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Article de méthode

Analyse des interactions protéine-ADN télomériques à l’aide d’une pince magnétique à molécule unique

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DOI :

10.3791/67251

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30 août 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Pharmacy, Nankai University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole démontre l’utilisation d’une pince magnétique à molécule unique pour étudier les interactions entre les protéines de liaison à l’ADN télomérique (facteur de liaison à la répétition des télomères 1 [TRF1] et TRF2) et les télomères longs extraits de cellules humaines. Il décrit les étapes préparatoires pour les télomères et les facteurs de liaison de répétition télomérique, l’exécution d’expériences sur une seule molécule et les méthodes de collecte et d’analyse des données.

Résumé

Les télomères, les structures protectrices aux extrémités des chromosomes, sont cruciales pour maintenir la longévité cellulaire et la stabilité du génome. Leur bon fonctionnement dépend de processus étroitement régulés de réplication, d’allongement et de réponse aux dommages. Le complexe de la shelterine, en particulier le facteur de liaison répétée des télomères 1 (TRF1) et TRF2, joue un rôle central dans la protection des télomères et est devenu une cible anticancéreuse potentielle pour la découverte de médicaments. Ces protéines se lient au motif répétitif de l’ADN télomérique TTAGGG, facilitant la formation de structures protectrices et le recrutement d’autres protéines télomériques. Les méthodes structurelles et les techniques d’imagerie avancées ont permis de mieux comprendre les interactions protéine-ADN télomériques, mais l’exploration des processus dynamiques nécessite des approches à molécule unique. Des outils tels que les pinces magnétiques, les pinces optiques et la microscopie à force atomique (AFM) ont été utilisés pour étudier les interactions protéine-ADN télomériques, révélant des détails importants tels que la distorsion de l’ADN dépendante de TRF2 et la catalyse de la télomérase. Cependant, la préparation de constructions à molécule unique avec des motifs répétitifs télomériques continue d’être une tâche difficile, ce qui pourrait limiter l’étendue des études utilisant des méthodes mécaniques à molécule unique. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une méthode pour étudier les interactions en utilisant de l’ADN télomérique humain complet avec des pinces magnétiques. Ce protocole décrit comment exprimer et purifier TRF2, préparer l’ADN télomérique, mettre en place des tests mécaniques monomoléculaires et analyser des données. Ce guide détaillé profitera aux chercheurs en biologie des télomères et à la découverte de médicaments ciblant les télomères.

Introduction

Les télomères sont des structures protectrices aux extrémités des chromosomes 1,2,3. L’érosion des télomères pendant la division cellulaire entraîne la sénescence et le vieillissement cellulaires, tandis qu’un allongement anormal des télomères contribue au cancer 4,5. Pour que les télomères fonctionnent correctement, leur réplication, leur allongement et leurs réponses aux dommages doivent être hautement régulés 6,7,8. La shelterine, composée de six sous-unités, joue un rôle central dans la protection des télomères 9,10,11. Une compréhension plus approfondie des télomères fournira des informations précieuses sur la biologie des télomères.

TRF1 et TRF2, sous-unités centrales de la shelterine, sont des protéines de liaison télomérique12,13. TRF1 et TRF2 se lient tous deux au motif d’ADN répétitif TTAGGG dans les télomères via leurs domaines Myb14. Ils forment des dimères grâce à leurs domaines TRFH partagés, ce qui leur permet d’encercler l’ADN double brin télomérique et de recruter les protéines télomériques 15,16,17,18,19. TRF2 est particulièrement important pour la formation des boucles D télomériques et des boucles T20,21. En raison de leur rôle crucial dans la protection des télomères, TRF1 et TRF2 sont apparus comme des cibles potentielles de médicaments anticancéreux 22,23,24,25.

Des efforts importants ont été déployés pour étudier les interactions protéine-ADN au niveau des télomères. Des méthodes biochimiques telles que l’électrophorèse par décalage de mobilité (EMSA) et la résonance plasmonique de surface (SPR) ont été utilisées pour examiner les affinités de liaison20,26. De nombreuses structures de protéines de liaison télomériques complexées avec de l’ADN ont été élucidées à l’aide de la cryomicroscopie électronique (cryo-EM), de la cristallographie aux rayons X et de la résonance magnétique nucléaire (RMN)27,28,29. Des techniques d’imagerie à super-résolution comme la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) ont révélé la formation de boucles T dépendantes de TRF221. Récemment, le séquençage des nanopores a été développé pour profiler les séquencestélomériques 4,30,31. Ces connaissances structurelles ont considérablement amélioré notre compréhension des interactions protéine-ADN télomériques. Pour explorer davantage la dynamique des interactions protéine-ADN télomériques, le développement de nouvelles technologies est essentiel.

Les outils à molécule unique sont des techniques puissantes pour explorer les interactions protéine-ADN au télomère 32,33,34. Des méthodes mécaniques à molécule unique, telles que les pinces magnétiques, les pinces optiques et l’AFM, ont été employées pour étudier la distorsion de l’ADN dépendante de TRF2, révéler l’empilement colonnaire médié par TRF2 de la chromatine télomérique humaine et observer la catalyse processive de la télomérase, entre autres applications 35,36,37,38,39,40. Ces méthodes sont particulièrement utiles pour sonder les conformations topologiques et la cinétique de l’association et de la dissociation protéine-ADN.

Cependant, la préparation de constructions monomoléculaires avec des motifs répétitifs télomériques présente encore des défis, ce qui limite les études utilisant des méthodes mécaniques à molécule unique. Pour remédier à cette limitation, nous avons développé une méthode mécanique à molécule unique pour étudier les interactions globales protéine-ADN sur des télomères humains41 de pleine longueur. Cette méthode extrait directement l’ADN télomérique des cellules humaines, contournant ainsi la préparation laborieuse de l’ADN télomérique artificiel. Il facilite l’étude des processus cinétiques sur de longs télomères natifs couvrant plusieurs kilobases.

Dans ce protocole, nous fournissons une description détaillée des étapes permettant de sonder les interactions protéine-ADN télomériques à l’aide d’une pince à épiler magnétique, un outil mécanique monomoléculaire populaire 42,43,44. Nous montrons comment exprimer et purifier les protéines télomériques, en utilisant TRF2 comme exemple, et comment préparer de l’ADN télomérique à partir de cellules humaines. De plus, nous montrons comment mettre en place un test à molécule unique sur une pince magnétique pour étudier les interactions protéine-ADN télomériques, et nous couvrons l’analyse ultérieure des données des expériences à molécule unique. Ce protocole profitera aux chercheurs dans le domaine de la biologie des télomères et de la découverte de médicaments ciblant les télomères.

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Protocole

1. Matériels et méthodes généraux

  1. Reportez-vous au fichier de la Table des matériaux pour connaître les sels, les produits chimiques, les antibiotiques, les enzymes, les anticorps et les résines utilisés dans ce protocole.
  2. Préparez le milieu liquide Luria-Bertani (LB), les plaques de gélose LB, le tampon HEPES, l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE), le sérum salin tamponné au phosphate (PBS), le tampon Tris-EDTA (TE) selon les recettes des protocoles de port de source froide 45,46,47,48,49,50,51,52,53.
  3. Acquérir le vecteur pET28a (Addgene), les lignées cellulaires procaryotes et eucaryotes (ATCC) par le biais de sources commerciales. Ensuite, cultivez-les en continu et passez-les en laboratoire.
  4. Pour de grands volumes de liquide, autoclave à 120 °C pendant 20 min. Pour les petits volumes, utilisez un filtre stérile avec une taille de pores de 0,22 μm.
  5. Ajustez le pH des solutions au niveau souhaité à l’aide de HCl ou de NaOH avant de les amener à leur volume final.
    REMARQUE : les pinces magnétiques sont conçues sur mesure et s’exécutent dans un environnement de LabVIEW 2017, tandis que l’analyse de données à molécule unique est effectuée dans MATLAB 2017 2,54,55.
  6. Pour des raisons de sécurité, portez des blouses de laboratoire à manches longues, des gants en nitrile (ou des gants fabriqués à partir d’un matériau imperméable et résistant à la substance), des lunettes ou des lunettes de protection et des chaussures fermées.

2. Expression protéique et purification des protéines de liaison à l’ADN télomérique

  1. Effectuer la culture cellulaire et induire l’expression des protéines.
    1. Insérez la séquence codante des protéines de liaison à l’ADN télomérique (Figure 1A), TRF2 comme exemple dans ce cas, dans le vecteur pET28a par digestion enzymatique et ligature, avec SUMO utilisé comme marqueur de fusion. Insertion entre les sites de restriction de BamHI et HindIII, produisant le plasmide de pET28a-SUMO-TRF2 (Figure 1B).
    2. Transformez les cellules BL21(DE3) avec le plasmide pET28a-SUMO-TRF2.
      1. Décongeler une aliquote de 50 μL de cellules BL21(DE3) compétentes sur de la glace.
      2. Ajouter 1 μL d’ADN du plasmide pET28a-SUMO-TRF2 (contenant 50 ng d’ADN) aux cellules compétentes. Agitez doucement pour mélanger sans pipeter de haut en bas.
        REMARQUE : Ne pas vortex.
      3. Incuber le mélange sur de la glace pendant 30 min.
      4. En cas de choc thermique, chauffer le mélange de cellules à 42 °C pendant exactement 45 s dans un bain-marie. Remettez immédiatement les cellules dans la glace pendant 2 min pour stabiliser les cellules transformées.
      5. Ajoutez 950 μL de milieu LB à température ambiante (RT) dans les cellules pour faciliter la récupération.
      6. Incuber les cellules transformées à 37 °C pendant 1 h en agitant à 220 tr/min.
      7. Étaler 100 μL du mélange de transformation sur une plaque de gélose LB contenant 50 μg/mL de kanamycine (85,8 μM).
      8. Incuber les cellules en boîte pendant la nuit à 37 °C. Après l’incubation, choisir des colonies distinctes à utiliser dans l’inoculation des cultures de démarrage.
        REMARQUE : Les colonies sur plaques peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
    3. Prélever une colonie de cellules BL21(DE3) transformées et la cultiver dans 5 mL de milieu LB complété par 50 μg/mL de kanamycine (85,8 μM). Incuber pendant 18 h à 37 °C avec agitation à 220 tr/min.
    4. Pour passer à l’échelle, transférez 2 mL de la culture de nuit dans 200 mL de milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine (85,8 μM). Poursuivre l’incubation à 37 °C en agitant à 220 tr/min jusqu’à ce que la densité optique à 600 nm (OD 600) atteigne 0,6-0,8.
    5. Prélever 1 mL de la culture comme échantillon témoin non induit.
    6. Induire la culture restante avec de l’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 1 mM et incuber à 20 °C pendant 17 h pour favoriser l’expression des protéines.
    7. Effectuez SDS-PAGE à l’aide d’un gel d’empilage à 5 % et d’un gel de séparation à 10 %. Chargez les échantillons avec le tampon de chargement SDS-PAGE et exécutez SDS-PAGE initialement à 100 V pendant 30 min, puis à 120 V pendant 50 min dans un tampon Tris-Glycine. Colorer avec du bleu Coomassie pour visualiser l’expression des protéines (voir les recettes dans le tableau supplémentaire 1) (Figure 1C).
      REMARQUE : Voir la discussion pour le dépannage si l’expression n’est pas respectée.
  2. Purifier la protéine.
    1. Récolter les cellules par centrifugation à 4 °C, 8500 x g pendant 10 min. Jeter le surnageant et laver la pastille dans 200 mL de PBS. Centrifuger à nouveau, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 25 mL de tampon de lyse (20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 20 mM d’imidazole, 10 % de glycérol, 0,5 mM de DTT, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle [PMSF]).
      ATTENTION : Le PMSF est corrosif et toxique et provoque des brûlures. Portez des vêtements de protection appropriés, des gants et une protection oculaire/faciale.
      REMARQUE : Congeler à -80 °C si ce n’est pas faire immédiatement.
    2. Ajouter 5 μL de lysozyme à 100 mg/mL, 5 μL de DNase I à 1 U/μL et 5 μL de RNase A à 10 mg/mL dans les cellules remises en suspension.
    3. Effectuez une sonication sur glace, avec des rafales de 1 s à 250 W suivies d’une pause de 2 s, pour un total de 30 min.
    4. Centrifuger à 38 000 x g, 4 °C pendant 40 min (30 à 60 min sont acceptables) et filtrer le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,22 μm.
    5. Préparez 500 mL de tampon de liaison sur colonne de Ni en dissolvant 8,76 g de NaCl (concentration finale de 300 mM) et 0,68 g d’imidazole (concentration finale de 20 mM) dans 20 mM d’HEPES (pH de 8,0). Filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 μm.
      ATTENTION : L’imidazole est dangereux et peut provoquer une irritation de la peau et des yeux. Cela peut également nuire à un enfant à naître. Évitez tout contact avec les yeux, la peau et les vêtements. Ne pas ingérer ni inhaler. Portez de l’équipement de protection individuelle, y compris une protection faciale.
    6. Préparez des tampons d’élution en colonne de nickel (20 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl) avec des concentrations croissantes d’imidazole (100 mM, 200 mM, 300 mM et 500 mM) pour une élution par étapes, en veillant à ce que tous les tampons soient correctement filtrés.
    7. Chargez le surnageant filtré sur la colonne de nickel pré-équilibrée dans le tampon de liaison (20 mM HEPES (pH 8,0),300 mM NaCl,20 mM imidazole). Laver avec un tampon de liaison et éluer la protéine avec le gradient d’imidazole préparé, en recueillant 12 fractions, chacune avec 1 mL (figure 1C). Combinez des fractions avec une pureté de >95%.
    8. Mesurer la concentration de la protéine de fusion éluée 6xHis-sumo-TRF2 par A280 dans un spectrophotomètre.
    9. Pour la protéine utilisée dans les dosages à molécule unique, ajoutez de la protéase sumo selon les instructions du fabricant (généralement 0,125 U de protéase pour 2 μg de protéine de fusion) et laissez la digestion pendant la nuit à 4 °C.
    10. Après le traitement à la protéase de sumo, chargez le mélange sur une colonne de Ni pour lier toute protéine de fusion non digérée et le sumo marqué His, permettant à la protéine TRF2 sans marquage de s’écouler. Récupérez le flux continu.
  3. Déterminez la concentration en protéines et stockez-la.
    1. Concentrez la protéine TRF2 purifiée à l’aide d’une unité de filtration centrifuge à coupure de 30 kDa et remplacez-la dans un tampon de stockage contenant 20 mM d’HEPES (pH 8,0), 150 mM de NaCl, 0,5 mM de DTT, afin de réduire la concentration d’imidazole en dessous de 150 mM.
    2. Répétez le processus de concentration jusqu’à ce que le volume soit réduit à moins de 1 ml.
    3. Analysez les échantillons de chaque étape de purification à l’aide de SDS-PAGE pour évaluer la pureté et l’intégrité de la protéine (Figure 1C).
      REMARQUE : La chromatographie d’affinité est utilisée pour purifier les protéines, recueillir et laver les échantillons élués, et effectuer une étude SDS-PAGE pour évaluer l’intégrité des protéines et assurer le contrôle de la qualité. Lorsque la chromatographie d’affinité seule ne répond pas aux exigences de pureté, la chromatographie d’exclusion stérique est utilisée pour améliorer encore la pureté des protéines. Les courbes d’absorbance UV aident à évaluer les fractions d’élution, et SDS-PAGE vérifie l’intégrité des protéines, assurant un contrôle qualité rigoureux tout au long du processus.
    4. Ajoutez du glycérol à une concentration finale de 50 % à la protéine concentrée et remplacée par un tampon pour le stockage.
    5. Conservez les protéines à -80 °C.

3. Préparation de fragments de restriction télomérique humaine

  1. Extraire l’ADN génomique.
    1. En suivant l’organigramme (figure 2A), centrifuger 1 x 107 cellules à 1000 x g pendant 3 min et jeter le surnageant. Pour le lavage, remettre les cellules en suspension dans 200 μL de PBS, centrifuger à nouveau à 1000 x g pendant 3 min et jeter le surnageant.
    2. Ajouter 760 μL de tampon contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM de NaCl, 100 mM d’EDTA et 1 % de SDS dans le tube contenant 1 x 107 cellules et remettre doucement en suspension par pipetage pour éviter les bulles d’air.
      REMARQUE : Ne pas vortex.
    3. Pour la digestion des protéines et l’élimination des DNases et des RNases dans l’échantillon, ajouter la protéinase K à une concentration finale de 0,5 mg/mL, correspondant à 40 μL d’une solution mère de 10 mg/mL. Tapotez le bas du tube pour mélanger (ne pas vortex).
    4. Incuber toute la nuit à 37 °C.
    5. Ajouter 265 μL de NaCl 5,4 M. Mélangez pendant 5 min en retournant le tube cinq fois par minute, puis placez sur de la glace pendant 20 min.
    6. Centrifugeuse à vitesse maximale (par exemple, 16 900 x g) pendant 10 min à RT.
    7. Transférez le surnageant dans un tube à centrifuger et ajoutez un volume égal d’isopropanol (environ 750 μL), en évitant les lipides ou les sédiments flottants. L’ADN est dans le surnageant.
    8. Retournez le tube cinq fois pour mélanger. Confirmez visuellement la présence d’une pastille d’ADN précipitant dans le tube à centrifuger.
    9. Centrifugeuse à RT à vitesse maximale pendant 10 min.
    10. Jetez le surnageant. Lavez la pastille d’ADN avec 500 μL d’éthanol à 70 % en inversant cinq fois le tube de centrifugation.
      REMARQUE : La pastille est de l’ADN.
    11. Centrifugeuse à RT à vitesse maximale (par exemple, 16 900 x g) pendant 10 min.
    12. Retirez soigneusement tout le surnageant, laissant la pastille d’ADN. Laissez sécher les granulés à l’air libre à RT pendant 5 min.
      REMARQUE : Évitez de trop sécher, car l’ADN génomique peut devenir difficile à dissoudre.
    13. Remettre en suspension la pastille d’ADN dans 475 μL de tampon TE (10 mM de Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM d’EDTA). Mélangez délicatement en tapotant le fond du tube. Pour la digestion de l’ARN pendant la préparation de l’ADN, ajoutez 25 μL de RNase A à 10 mg/mL (concentration finale de 0,5 mg/mL) et mélangez en tapotant doucement jusqu’à ce que la pastille d’ADN soit complètement dissoute.
      REMARQUE : Évitez le vortex pour éviter le cisaillement de l’ADN.
    14. Incuber l’échantillon d’ADN à 4 °C pendant la nuit.
    15. Effectuer une extraction au phénol trissaturé de volume égal : ajouter 500 μL de phénol dans le tube de centrifugation, mélanger délicatement à l’aide d’une pipette et centrifuger à vitesse maximale pendant 10 min à 4 °C.
      ATTENTION : L’exposition au phénol peut provoquer une irritation de la peau, des yeux, du nez, de la gorge et du système nerveux. Évitez tout contact avec les yeux, la peau et les vêtements. Ne pas ingérer ni inhaler. Portez de l’équipement de protection individuelle, y compris une protection faciale.
      REMARQUE : L’ADN est dans la phase aqueuse supérieure, les protéines sont dans l’interphase et la phase organique est en bas.
    16. Répétez l’opération trois fois. Prenez le surnageant d’ADN (environ 280 μL).
    17. En fonction du volume de l’échantillon d’ADN, ajouter 1/10 volume (28 μL) d’acétate de sodium 3 M (concentration finale 0,3 M, pH 5,2) et 2 volumes (616 μL) d’éthanol 100 % froid. Placez le tube de centrifugation à -80 °C pendant 2-3 h.
    18. Centrifugeuse à vitesse maximale (par exemple, 16 900 x g) pendant 10 min à 4 °C. Décongeler la solution sur de la glace si elle est congelée avant la centrifugation.
    19. Jetez le surnageant et lavez-le 3 à 4 fois avec de l’éthanol à 70 % en inversant le tube de centrifugation. Centrifuger à vitesse maximale pendant 5 min à 4 °C.
    20. Retirez l’éthanol et laissez la pastille sécher à l’air libre à RT pendant 5 min.
    21. Ajoutez 100 μL de tampon TE, tapotez le tube pour mélanger et laissez-le reposer à 4 °C pendant 2 h pour qu’il se dissolve complètement.
      REMARQUE : Examiner l’intégrité de l’ADN génomique sur un gel d’agarose à 1 % (figure 2B).
    22. Conservez l’ADN à -20 °C au congélateur. Il restera stable pendant au moins 1 an.
  2. Effectuer la digestion et la modification de l’ADN génomique.
    1. Prenez 4 μg d’ADN génomique et combinez-les avec 1 μL de CviAII (10 U), 2 μL de tampon de digestion 10x (voir le tableau supplémentaire 1 pour les recettes), et ajoutez de l’eau pour atteindre un volume total de 20 μL. Incuber le mélange à 25 °C pendant 12 h.
      REMARQUE : FatI peut remplacer CviAII, qui est maintenant abandonné par NEB.
    2. Ajoutez 1 μL de NdeI (20 U), 1 μL de MseI (10 U) et 1 μL de BfaI (10 U) dans le même tube contenant le mélange précédent (20 μL). Ajoutez également 2 μL de tampon de digestion 10x et 15 μL d’eau pour obtenir un volume total de 40 μL. Incuber à 37 °C pendant 12 h, puis inactiver toutes les enzymes à 80 °C pendant 20 min.
      REMARQUE : La digestion de l’ADN génomique peut être examinée à l’aide de la méthode des fragments de restriction terminale (TRF) (Figure 2C). La combinaison des quatre enzymes de restriction (CviAII, NdeI, MseI et BfaI) digère l’ADN génomique en fragments d’environ 800 pb et produit les TRF avec une contamination minimale de l’ADN sous-télomérique.
    3. Pour la modification de la digoxigénine, prélever 40 μL de l’ADN génomique digéré et ajouter 4 μL de 1 mM de dATP (concentration finale de 0,08 mM), 4 μL de 1 mM de digoxigénine-11-dUTP (concentration finale de 0,08 mM), 1 μL de fragment de Klenow (5 U), 0,5 μL de 100 mM de DTT (concentration finale de 1 mM) et 1 μL de tampon de digestion 10x. Incuber à 37 °C pendant 12 h, puis chauffer à 75 °C pendant 20 min pour inactiver le fragment de Klenow.
    4. Pour le marquage de la biotine, prélever 12,5 μL d’ADN génomique modifié par la digoxigénine (1 μg) et ajouter 1 μL de sonde télomère biotinylée 1 μM (c’est-à-dire 1 pmol) qui sont complémentaires au surplomb télomérique simple brin. Ajouter 611,5 μL de tampon TE Li (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl) pour diluer les ions 50 mM K à 1 mM, ce qui donne un volume total de 625 μL, qui peut être divisé en 16 tubes de 39 μL chacun.
    5. Chauffer à 75 °C pendant 3 min dans un thermocycleur, puis diminuer la température de 0,1 °C toutes les 30 s jusqu’à atteindre 25 °C.
    6. Conservez les échantillons d’ADN à -20 °C pendant au moins un an.

4. Mise en place d’une cellule d’écoulement pour un échantillon d’ADN télomérique sur une pince à épiler magnétique

  1. Fabriquer une cellule d’écoulement pour les dosages de molécules uniques.
    1. Utilisez une meuleuse électrique pour percer des trous comme l’entrée et la sortie sur les lamelles supérieures (verre de couverture # 2 d’une épaisseur de 0,2 mm).
    2. Nettoyez les lamelles dans un détergent par sonication pendant 30 min.
    3. Lavez les lamelles avec de l’eau ultra-pure 3 fois.
    4. Nettoyez les lamelles à l’isopropanol par sonication pendant 30 min.
    5. Lavez les lamelles à l’eau ultra-pure 3 fois.
    6. Nettoyez les lamelles en ultra-pure par sonication pendant 15-30 min.
    7. Séchez les lamelles avec de l’azote.
      REMARQUE : Le protocole peut être arrêté ici et les lamelles nettoyées peuvent être stockées pour une utilisation ultérieure.
    8. Enduire les lamelles inférieures (sans trous) de 20 μL de nitrocellulose à 0,1 % et ajouter des billes de référence (dilution 20x, 3 μm de diamètre). Cuire au four à 100 °C pendant 4 min.
    9. À l’aide d’un scalpel, découpez des entretoises de parafilm double couche selon un moule métallique. Le moule est une pièce rectangulaire en alliage d’aluminium avec les mêmes dimensions que la lamelle, avec un centre évidé pour faciliter la coupe du canal.
    10. Assemblez le sandwich de cellules d’écoulement (Figure 3A). Chauffer à 85 °C et masser à l’aide de deux cotons-tiges jusqu’à ce que le parafilm scelle le canal.
    11. Enduisez la cellule d’écoulement d’un anticorps. Injectez 70 μL d’anticorps anti-digoxigénine (0,1 mg/mL) directement dans la cellule d’écoulement. Laisser à RT pendant 1 h.
    12. Passivez la cellule d’écoulement. Injecter 70 μL de BSA à 10 mg/mL pour déplacer l’anticorps anti-digoxigénine. Laisser à RT pendant 12 h. Les anticorps anti-digoxigénine non liés seront éliminés dans les étapes suivantes avec un rinçage rigoureux.
      REMARQUE : Conservez la cellule d’écoulement à 4 °C pendant 1 à 2 semaines.
    13. Testez la liaison non spécifique en injectant 5 μL de MyOne lavé (10 mg/mL) (ou 5 μL de billes M270 lavées (10 mg/mL)) sans ADN dans la cellule d’écoulement. Laissez agir 10 min, puis rincez les billes à l’aide d’un tampon de travail (20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Comptez le nombre de perles collées à la surface dans un champ de vision. Une surface bien traitée ne doit montrer que zéro ou seulement quelques billes.
  2. Isolez et immobilisez les attaches d’ADN télomérique dans une cellule à écoulement.
    1. Prélever 10 μL de billes M270 (10 mg/mL) ou 5 μL de 10 mg/mL MyOne et les laver cinq fois avec 50 μL de tampon de travail (20 mM HEPES [pH 7,5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) à l’aide d’un aimant.
    2. Prenez 500 ng d’ADN génomique digéré et mettez-le dans un tube à centrifuger de 1,5 ml. Ajoutez toutes les billes (50 μL) sur l’échantillon d’ADN.
    3. Sans pipetage, agitez doucement le tube à centrifuger plusieurs fois pour mélanger les billes et l’échantillon d’ADN. Laissez le mélange sur de la glace pendant 1 h. Laver trois fois avec 500 μL de tampon de travail à l’aide d’un aimant pour tirer les billes vers le bas, avec des intervalles de 10 minutes entre les lavages.
    4. Remettez l’échantillon en suspension à l’aide de 30 μL de tampon de travail et chargez le mélange dans la cellule d’écoulement. Laisser agir 30 min. Affleurez les billes magnétiques non liées.
      REMARQUE : L’ADN télomérique est attaché entre la lamelle inférieure et la bille magnétique par le biais d’interactions d’affinité médiées par la digoxigénine-anticorps et la biotine-streptavidine (Figure 3B).
  3. Installer une cellule d’écoulement sur une pince à épiler magnétique
    1. Nettoyez la cellule d’écoulement avec de l’éthanol à 70 % et séchez la surface à l’aide d’un chiffon pour lentilles. Placez la cellule d’écoulement nettoyée sur le porte-échantillon inférieur et assemblez délicatement le support d’échantillon supérieur à l’aide d’un tournevis.
    2. Appliquez une goutte d’huile pour lentille sur la surface inférieure de la cellule d’écoulement, où elle s’aligne avec la lentille de l’objectif. Ensuite, placez le porte-échantillon sur le dessus de l’objectif et fixez-le à l’aide d’un tournevis.
    3. Sélectionnez une paire d’aimants cubiques de 5 mm disposés dans une configuration verticale. Alignez le support magnétique avec l’axe X du trajet lumineux de la pince magnétique pour l’imagerie.
      REMARQUE : Il s’agit d’une étape critique. La direction du champ magnétique est alignée et donc déterminée par l’orientation du support d’aimant.
    4. Lancez le logiciel de programmation graphique et connectez les contrôleurs pour la pince à épiler magnétique. Ajustez le champ de vision pour localiser une perle de référence au bas de la cellule d’écoulement et ajustez légèrement la lentille de l’objectif de sorte que la perle de référence présente des anneaux de diffraction clairs.
    5. Déplacez les aimants vers le haut de la cellule d’écoulement.
      REMARQUE : Il s’agit d’une étape critique. Des changements soudains dans le motif de diffraction des billes indiquent que les aimants viennent de toucher la surface de la cellule d’écoulement. Cette position est considérée comme le décalage pour la mesure du point zéro.
      REMARQUE : Abaissez les aimants avec précaution, en commençant par des marches plus grandes et en passant progressivement à des marches plus petites. Déplacez-vous par incréments de 0,1 mm pour éviter d’endommager la cellule d’écoulement à l’approche de la cellule d’écoute.
    6. Soulevez les aimants à leur position la plus haute et retirez le support d’aimant.
    7. Allumez la pompe péristaltique connectée à la bouteille de déchets et jetez le liquide. Ajoutez 100 μL de tampon de travail à l’entrée et réglez le débit de la pompe péristaltique à 100 μL/min pour remplir la cellule d’écoulement avec tampon.

5. Mesures d’un télomère à l’aide d’une pince magnétique à molécule unique

  1. Configurez l’appareil photo.
    1. Réglez l’échelle de gris de la caméra CMOS (semi-conducteur à oxyde métallique complémentaire) avec un réglage de la luminosité sur 150 niveaux.
    2. Définissez la taille de la région d’intérêt (ROI).
    3. Réglez la fréquence d’images sur 200 Hz avec un temps d’exposition de 5000 μs.
      REMARQUE : Il s’agit d’une étape critique. Assurez-vous que le temps mort de l’obturateur est réglé sur zéro.
    4. Déplacez la position de l’aimant à 3 cm (environ 8 pN) et ajustez la mise au point de l’objectif sur les billes.
  2. Établissez la table de correspondance (LUT).
    1. Déplacez les aimants à une position correspondant à 8 pN pour étirer étroitement la bille magnétique attachée à l’ADN.
    2. Réglez la LUT sur 200 pas avec une taille de pas de 0,05 μm.
    3. Utilisez une caméra CMOS pour capturer les profils des billes magnétiques à différentes positions afin d’établir la LUT.
      REMARQUE : Il s’agit d’une étape critique. Les billes de polystyrène fixées dans la cellule d’écoulement servent de billes de référence pour éliminer la dérive des billes d’intérêt.
  3. Concevoir une expérience mécanique à molécule unique.
    1. Écrivez un script dans MATLAB pour contrôler les mouvements du moteur pour les tests de rampe de force ou de saut de force.
      REMARQUE : Il s’agit d’une étape critique. Ce script encode les commandes pour les mouvements de l’aimant. Le taux de charge de force est défini à cette étape pour un essai de rampe de force. Les niveaux et les durées des essais de saut de force sont également déterminés ici (Figure 4, Fichier supplémentaire 1, Fichier supplémentaire 2 et Fichier supplémentaire 3).
    2. Importez le script dans un logiciel de programmation graphique pour tester les expériences sur une molécule unique.
    3. Vérifiez le nombre total de trames requises pour exécuter l’expérience sur une molécule unique et assurez-vous que la mémoire disponible dépasse cette exigence.
      REMARQUE : Les données seront perdues si la mémoire allouée est inférieure à celle requise, car la sauvegarde des données prend du temps.
    4. Vérifiez la vitesse d’imagerie maximale pour déterminer le nombre maximal de billes pouvant être surveillées simultanément.
      REMARQUE : L’expérience sera interrompue si la limite de vitesse d’imagerie est dépassée.
    5. À l’aide d’un test de saut de force à titre d’exemple, exécutez l’expérience mécanique sur une molécule unique. Des forces sont brusquement appliquées à la bille magnétique, qui transmet ces forces à la molécule d’ADN, l’étirant immédiatement vers le haut.

6. Mesures de TRF1/2 sur un télomère à l’aide d’une pince à épiler magnétique

  1. Essai de rampe de force
    1. En utilisant TRF1 comme exemple, chargez 200 μL de TRF1 10 nM dans la cellule d’écoulement à un débit lent (par exemple, 30 μL/min). Attendez 30 minutes pour que TRF1 se lie à l’ADN télomérique.
    2. Choisissez un script pour une expérience de rampe de force avec un taux de charge de force de ±1 pN/s.
    3. Nommez les fichiers de données de manière appropriée et exécutez l’expérience. Les données seront enregistrées dans la destination spécifiée pour analyse (Figure 5).
      REMARQUE : Au cours de cette expérience, la force est augmentée et diminuée linéairement entre 0 pN et 17 pN, ce qui étire et détend l’ADN télomérique et brise les boucles d’ADN médiées par TRF1/2.
  2. Essai de saut de force
    1. Sélectionnez un script pour exécuter un test de saut de force.
      REMARQUE : Diverses forces sont appliquées pour étirer l’ADN télomérique, par exemple, la « force de repos » (Frest) à 0 pN pendant 40 s, la « force d’essai » (Ftest) allant de 2 à 8 pN pendant 60 s, la « force élevée » (Fhigh) à 10 pN pendant 30 s et la « force maximale » (Fmax) à 20 pN pendant 30 s.
    2. Nommez les fichiers de données de manière appropriée et exécutez l’expérience. Les données seront enregistrées dans la destination spécifiée pour analyse (Figure 5).

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Résultats

La figure 1A illustre les domaines schématiques et les structures de TRF1 et TRF2, composés respectivement de 439 et 542 acides aminés, qui peuvent être exprimés dans les cellules procaryotes. La préparation de TRF1 a déjà été décrite dans la littérature41. Nous fournissons ici une description complète et des résultats représentatifs de la préparation de TRF2. La figure 1B montre la carte plasmidique utilisée pour exprimer TRF2 chez E...

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Discussion

Ce protocole utilise des pinces magnétiques pour la manipulation des TRF au niveau de la molécule unique 57,58,59. Nous utilisons des billes magnétiques pour séparer les TRF des fragments d’ADN génomique. Après la digestion par restriction, les TRF se lient aux billes magnétiques, ce qui permet de les séparer facilement des fragments d’ADN génomique. Cette approche permet la manipulation à l’aid...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent ou autre conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [Subvention 32071227 à Z.Y.], la Fondation municipale des sciences naturelles de Tianjin de Chine (22JCYBJC01070 à Z.Y.) et le Laboratoire clé d’État de technologie et d’instruments de mesure de précision (Université de Tianjin) [Subvention pilab2210 à Z.Y.].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti-digoxigénineRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
caméra CMOS  ;MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
solution d’extraction d’ADNG-CLONEEX0108
Dnase I, sans Rnase, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
Mélange dNTPNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  ; billesThermo Fisher Scientific65305Perles de streptavidine
Dynabeads MyOne perlesThermo Fisher Scientific65001Perles de streptavidine
EthanolTianjin No.6 Chemical Reagent Factory1083
GlycérolBeijing Hwrkchemical Co. LtdSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Chemical Reagent FactoryA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
Fragment de Klenow (3&prime ;-5&prime ; exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlLogiciel de programmation graphique  ;
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrophotometer
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Perles 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
Membrane nitrocellulosiqueABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Acétate de sodiumSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo protéaseBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

Références

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