Quantification de génomes viraux adéno-associés dans des échantillons de vecteurs purifiés par réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes

Résumé

La quantification précise des copies du génome du vecteur du virus adéno-associé (AAV) est essentielle, mais un protocole standardisé n’a pas encore été établi. Ce protocole décrit une méthode validée pour la préparation d’échantillons d’AAV purifiés et la réalisation d’une réaction en chaîne par polymérase (dd_PCR) numérique en gouttelettes afin de quantifier de manière fiable le titre du génome viral.

Résumé

Le virus adéno-associé (AAV) est un virus non pathogène utilisé comme véhicule d’administration pour transférer des gènes thérapeutiques chez les patients. La quantification précise du nombre de copies du génome AAV dans les préparations de vecteurs est essentielle pour l’optimisation des bioprocédés et le calcul du dosage dans les études précliniques et cliniques de produits de thérapie génique à base d’AAV. À l’heure actuelle, il n’existe pas de protocole consensuel pour le titrage du génome viral AAV. Ici, nous présentons un protocole de PCR numérique par gouttelettes (dd_PCR) pour la quantification des génomes viraux dans des échantillons de vecteurs purifiés. Les échantillons sont traités avec de la DNase I pour éliminer l’ADN contaminant non emballé. Les échantillons traités à la DNase sont ensuite mélangés avec un ensemble d’amorces-sondes appropriées (conçues en fonction du génome AAV cible) et des réactifs PCR, puis chargés dans un générateur de gouttelettes. Les gouttelettes préparées sont transférées dans une plaque PCR, où l’amplification de la PCR est effectuée et analysée. Le titre du génome viral est calculé en fonction de la concentration (copies/μL), en tenant compte des dilutions de l’échantillon. Une mesure réussie montre une séparation claire des nuages de gouttelettes positives et négatives, a au moins 10 000 gouttelettes acceptées, montre une valeur comprise entre 10 copies/μL et 10 000 copies/μL, et a un coefficient de variation (CV) entre les répétitions inférieur à 20%. Un titrage fiable du génome viral contribuera au développement de produits de thérapie génique sûrs et efficaces à base d’AAV.

Introduction

La thérapie génique est une modalité thérapeutique couramment utilisée pour traiter les troubles génétiques. La conception d’une thérapie génique donnée est spécifique à la pathologie associée à l’indication cible, mais toutes les thérapies géniques impliquent l’administration intracellulaire de matériel génétique aux cellules cibles afin de provoquer un effet thérapeutique¹. La thérapie génique peut être classée en plusieurs catégories, notamment le remplacement de gènes pour les mutations de perte de fonction, le silençage génique pour les anomalies de gain de fonction et les techniques d’édition de gènes. Quelle que soit la stratégie spécifique employée, le matériel d’acide nucléique thérapeutique (appelé transgène) doit être emballé dans un vecteur afin d’obtenir une administration intracellulaire ciblée².

Bien qu’une variété de systèmes de vecteurs viraux et non viraux soient disponibles pour le développement de la thérapie génique, les virus adéno-associés (AAV) sont fréquemment choisis en raison du large tropisme viral et de la faible immunogénicité associés à ce groupe de virus ^1,2. À ce jour, sept thérapies géniques utilisant l’AAV pour l’administration thérapeutique de gènes ont obtenu l’approbation de l’Agence européenne des médicaments (EMA) ou de la Food and Drug Administration (FDA) ciblant des maladies allant de l’hémophilie (par exemple, le Roctavian) à l’amyotrophie spinale (par exemple, Zolgensma)³.

La production de thérapies géniques à base d’AAV découle d’une compréhension de l’AAV de type sauvage lui-même. L’AAV est un petit virus à ADN de la famille des Parvoviridae comprenant 13 sérotypes principaux (AAV1-13)³. Le génome de l’AAV comprend une molécule d’ADN simple brin de ~4,7 kb contenant deux cadres de lecture ouverts principaux (ORF) qui codent pour les gènes viraux essentiels nécessaires à la réplication du génome, à l’assemblage de la capside et à l’empaquetage (rep, cap). Le génome viral est flanqué aux extrémités 5' et 3' de séquences nucléotidiques palindromiques, appelées répétitions terminales inversées (ITR). Ces ITR forment des structures en forme d’épingle à cheveux qui jouent un rôle crucial dans la réplication du génome et l’empaquetage des génomes viraux de novo dans des capsides virales nouvellement synthétisées. L’AAV est un virus dépendant de l’aide et, par conséquent, nécessite l’expression de gènes auxiliaires d’autres virus, tels que le virus de l’herpès simplex (HSV) ou l’adénovirus (AdV) afin de devenir compétent en matière de réplication¹.

Afin de produire des AAV, un système d’expression cellulaire approprié est utilisé pour faciliter l’expression des protéines de la capside virale et l’assemblage ultérieur en particules virales de novo, suivi de l’encapsidation d’un transgène sélectionné flanqué d’ITR (également appelé génome vecteur). Ce processus utilise généralement un système plasmidique triple, comprenant (1) un plasmide hébergeant des gènes auxiliaires dérivés d’un virus auxiliaire, (2) un plasmide codant pour les éléments viraux essentiels (rep/cap), et (3) un plasmide portant la cassette d’expression thérapeutique (communément appelé plasmide de transfert)⁴. La présence unique de signaux d’empaquetage à répétition terminale inversée (ITR) flanquant la cassette d’expression thérapeutique dans le plasmide de transfert assure un empaquetage spécifique du transgène, tout en excluant la plupart du temps les gènes viraux présents sur les autres plasmides. La co-transfection de ce système à trois plasmides dans une plateforme d’expression cellulaire (généralement HEK293T cellules) entraîne la production de particules virales compétentes en transduction et déficientes en réplication, adaptées à une utilisation dans des applications de thérapie génique ^3,4.

Il existe un certain nombre d’attributs de qualité critiques (AQC) associés à la production de thérapies géniques à base d’AAV qui doivent être évalués afin de garantir l’activité, la pureté et l’innocuité du produit médicinal prévu⁴. Ces CQA incluent le titre de virus, la teneur en capside et l’agrégation. Le titre viral lui-même est une combinaison du nombre de particules virales (titre de capside) et du nombre de génomes de vecteurs (titre de génome de vecteur) présents dans une préparation donnée. Idéalement, le rapport entre ces deux titres devrait être de 1:1 puisque chaque particule virale devrait contenir un génome de vecteur, mais les inefficacités dans l’emballage du génome du vecteur pendant la biosynthèse entraînent la coproduction de capsides vides ou partiellement remplies (celles contenant des séquences partielles du génome du vecteur et/ou des séquences du génome non vectoriel)⁵. La présence de telles impuretés peut potentiellement provoquer des réponses immunitaires injustifiées et entrer en compétition pour les sites de liaison aux vecteurs, augmentant ainsi le risque d’immunotoxicité et réduisant le taux de transduction des capsides pleines⁶. Une quantification précise des génomes des AAV est donc essentielle pour établir le titre du virus et la teneur en capside. Cela a un impact à la fois sur la recherche fondamentale et sur l’industrie de la thérapie génique, qui nécessite un dosage précis afin de maintenir à la fois l’innocuité et l’efficacité des médicaments.

La réaction en chaîne par polymérase (dd_PCR) des gouttelettes numériques est devenue étroitement associée à la quantification du titre du virus, car elle peut être utilisée pour déterminer le nombre de génomes de vecteurs présents dans une préparation donnée⁷. La PCR numérique elle-même a été introduite pour la première fois dans les années 1990 ^8,9 et dd_PCR est une amélioration de cette technologie qui permet le traitement d’échantillons à haut débit^10,11. En dd_PCR, une réaction de PCR en temps réel de 20 μL est divisée en environ 20 000 gouttelettes enrobées d’huile, ce qui donne jusqu’à 96 réactions de ce type lorsqu’elle est logée sur une plaque standard à 96 puits. Par rapport à la PCR quantitative conventionnelle (qPCR), dd_PCR offre plusieurs avantages, notamment une sensibilité accrue, une précision accrue et une quantification plus directe et absolue des séquences cibles sans avoir besoin de courbes standard. De plus, le niveau élevé de répartition dans dd_PCR réduit l’impact des inhibiteurs de PCR et minimise le potentiel de biais dû à l’amplification préférentielle de certains matrices, ce qui en fait une option attrayante pour la mesure analytique du titrage du génome vectoriel.

Protocole

Le protocole décrit ici est conçu pour quantifier le titre du génome viral d’un vecteur AAV9 purifié et produit en interne avec une protéine fluorescente verte (GFP) comme transgène¹² avec un haut niveau de précision (Tableau 1). Cependant, ce protocole est applicable à tout sérotype AAV et à toute conception de génome de vecteur, à condition que les ensembles d’amorces/sondes soient conçus pour cibler le génome vectoriel spécifique d’intérêt. Les détails des réactifs, des amorces, des sondes et de l’équipement utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation des solutions mères

REMARQUE : Préparez toutes les solutions mères nécessaires à la dilution de l’échantillon à un poste de PCR afin d’éviter la contamination par de l’ADN étranger.

1. Préparez un tampon de test PCR 10x, composé de 500 mM de KCl, 100 mM de Tris-HCl, 15 mM de MgCl₂ et 0,01 % (p/v) de BSA. Mesurez le pH de la solution et ajustez-le à 8,3.
   REMARQUE : Cette solution peut être conservée à température ambiante jusqu’à 1 mois.
2. Préparez le tampon de dilution AAV, qui se compose d’un tampon de test PCR x, de 0,2 ng/μL d’ADN de sperme de saumon cisaillé (sss) et de 0,1 % de F-68 pluronique. Préparez cette solution fraîchement à chaque test et maintenez-la à 4 °C.
   REMARQUE : Si le pluronic F-68 n’est pas disponible, une alternative telle que le tensioactif non ionique Poloxamer 188 peut être utilisée.

2. Préparation des échantillons - traitement DNase I et dilution en série

REMARQUE : Afin d’éliminer les contaminants de l’ADN qui pourraient réduire la précision du titrage du génome du vecteur, l’ADN libre présent dans l’échantillon AAV (y compris l’ADN plasmidique restant ou les génomes viraux non encapsulés) peut être éliminé avant l’amplification par PCR à l’aide de la DNase. Cela est possible puisque les génomes des vecteurs sont encapsulés dans les capsides de l’AAV et ne sont donc pas accessibles avant l’étape de dénaturation de la réaction PCR elle-même (voir étape 5). De plus, étant donné que le nombre de génomes du vecteur dans un échantillon donné est inconnu, il est nécessaire d’effectuer une dilution en série des échantillons pour s’assurer que les mesures restent dans les limites supérieures et inférieures détectables. Effectuez toutes les manipulations d’échantillons à un poste de PCR. Conservez tous les échantillons sur de la glace, sauf indication contraire.

1. Mélangez l’échantillon AAV sélectionné pour l’analyse en vortex brièvement puis en centrifugeant pour vous assurer que tout le liquide reste au fond du tube contenant l’échantillon.
2. Pour le traitement à la DNase, ajouter 45 μL d’une solution contenant 1 tampon DNase I, 0,1 % de F-68 pluronique et 0,04 U/μL de DNase I dans de l’eau exempte de DNase dans un tube de 8 bandelettes PCR de 0,2 ml.
3. Transvaser 5 μL d’échantillon dans le tube contenant la solution d’ADNase. Vortex les échantillons et centrifugez-les brièvement pour vous assurer que tout le liquide reste au fond.
4. Dans un thermocycleur, incuber les échantillons pendant 1 h à 37 °C, puis refroidir à 4 °C. Placer sur de la glace dès que possible après avoir atteint 4 °C.
5. À l’aide d’une bandelette PCR neuve de 0,2 mL à 8 tubes, procéder à des dilutions appropriées de l’échantillon traité par DNase dans un tampon de dilution AAV. Les dilutions d’échantillon recommandées dépendent du titre vg attendu (tableau 2), mais visez au moins 2 dilutions différentes par échantillon et exécutez chaque dilution en double. Veillez à vortex rigoureusement (2 000-3 000 tr/min) sur les échantillons pendant 5 s avant de prélever tout volume.
6. Après dilution en série, vortex les échantillons et centrifuge pour s’assurer que tout le liquide reste au fond des tubes.
7. Inclure un témoin positif dont le titre vg est connu, et un témoin négatif (tampon de dilution AAV uniquement) qui est également appelé témoin sans matrice (NTC).
   REMARQUE : La commande positive peut être un AAV produit en interne ou un matériau de référence AAV commercial, qui comprend la séquence cible des amorces/sonde.

3. Préparation du master mix dd_PCR

REMARQUE : Sélectionnez une séquence cible appropriée dans le génome du vecteur et concevez une amorce directe, une amorce inverse et des sondes d’hydrolyse marquées avec des fluorophores rapporteurs FAM ou HEX conformément aux directives publiées¹³. Les amorces qui ciblent le transgène sont préférées aux amorces qui ciblent les ITR, car le transgène est spécifique à la conception du génome du vecteur, et la structure secondaire associée à la formation en épingle à cheveux des ITR peut entraver une liaison efficace de l’amorce. De plus, les amorces ITR pourraient surestimer les titres AAV si des capsides partiellement remplies contenant des fragments de génome de vecteur tronqué sont présentes et abritent toujours l’une ou l’autre des séquences ITR¹⁴. Préparez le dd_PCR master mix dans un poste de travail dédié et séparé (salle de pré-PCR). Cette pièce doit être séparée de celle où les échantillons sont préparés afin d’éviter la contamination croisée.

1. Laissez l’amorce, la sonde et dd_PCR réactifs supermix atteindre la température ambiante (20-25 °C). Ensuite, vortex tous les réactifs et centrifugez brièvement les tubes pour recueillir tout le liquide au fond du tube.
2. Préparez un volume de dd_PCR mélange maître dans un tube de microcentrifugation séparé en fonction du nombre de réactions requis en combinant les amorces avant et arrière, la sonde, le supermélange dd_PCR et l’eau exempte de DNase selon les volumes et les concentrations décrits dans le tableau 3.
   1. Vortex le mélange principal, puis centrifugez brièvement le tube pour vous assurer que tout le liquide reste au fond du tube.
      REMARQUE : Préparez toujours un volume de mélange dd_PCR supérieur à celui requis (n + 1) afin de tenir compte de la perte de volume de pipetage.
3. Transférez 19,8 μL du mélange principal dans chaque tube sur une bandelette PCR fraîche de 0,2 mL de 8 tubes.

4. Génération de gouttelettes

REMARQUE : Les échantillons et dd_PCR master mix sont mélangés séparément avant d’être chargés dans une cartouche génératrice de gouttelettes. Effectuez toutes les manipulations à un poste de PCR, de préférence différent de celui où les échantillons ont été préparés, afin d’éviter la contamination par des amplicons. Vous pouvez également nettoyer soigneusement le poste de PCR après avoir préparé les échantillons.

1. Transvaser 2,2 μL de l’échantillon dilué dans le volume de 19,8 μL de dd_PCR mélange maître dans chaque tube de la bandelette PCR à 8 tubes et bien mélanger. Vortex et centrifuger brièvement pour s’assurer que tout le liquide reste au fond.
2. Transférez 20 μL de cette solution dans les puits contenus dans la rangée centrale « échantillon » d’une cartouche génératrice de gouttelettes. Évitez les bulles dans la cartouche génératrice de gouttelettes ; Cela peut entraîner des erreurs de l’instrument et l’absence de génération de gouttelettes.
   REMARQUE : Étant donné que les cartouches sont au format 8 puits, tout comme les bandelettes de tubes PCR, il est recommandé d’utiliser une pipette à 8 canaux.
3. Transférez 60 μL de l’huile génératrice de gouttelettes dans les puits contenus dans la rangée inférieure « huile » de la cartouche génératrice de gouttelettes.
   REMARQUE : Ne laissez jamais un puits de la cartouche génératrice de gouttelettes vide ; Remplissez le puits d’échantillon vide avec dd_PCR contrôle de tampon pour les sondes (avec le volume correspondant décrit ci-dessus).
4. Placez un joint en caoutchouc sur la cartouche génératrice de gouttelettes et placez-le dans le générateur de gouttelettes.
5. Une fois les gouttelettes générées, à l’aide d’une pipette à 8 canaux, transférez lentement une solution de 42,5 μL de la puce dd_PCR vers une plaque de PCR multipuits.
   REMARQUE : Pipetez lentement et à un angle de 45 degrés pour éviter le cisaillement des gouttelettes dans le liquide pendant le pipetage. Inspectez visuellement la plaque afin que tous les puits soient remplis de la même quantité de liquide et que les gouttelettes soient visibles sous forme de couche opaque dans le puits.
6. Scellez la plaque avec un couvercle en aluminium dans une machine à thermosouder pendant 5 s à 180 °C.
   REMARQUE : Vérifiez visuellement que tous les puits sont scellés. Si ce n’est pas le cas, répétez encore 5 s à 180 °C. La plaque scellée peut être conservée jusqu’à 4 h à 4 °C avant dd_PCR amplification dans un thermocycleur.

5. Amplification dd_PCR

REMARQUE : Le thermocycleur doit être placé dans une pièce séparée de la salle de pré-PCR afin de séparer spatialement les activités pré-PCR de l’amplification de la PCR et d’éviter les résultats faussement positifs dus à une contamination par des amplicons.

1. Placez la plaque dans un thermocycleur (avec un module de réaction à 96 puits de profondeur) pour l’amplification par PCR et fermez-la en toute sécurité.
2. Configurez le thermocycleur pour qu’il fonctionne dans les conditions décrites dans le tableau 4 et à un volume de réaction de 40 μL. Incluez une étape de préchauffage dans les paramètres du programme et assurez-vous que le couvercle est chauffé à 99 °C.
3. Lorsque le programme PCR est terminé, maintenez la plaque à 4 °C pendant au moins 15 minutes pour vous assurer qu’elle est complètement refroidie.
   REMARQUE : La plaque peut être conservée pendant 48 à 72 h à 4 °C avant de devoir lire les gouttelettes.

6. Lecture des gouttelettes

1. Chargez la plaque dans un lecteur de gouttelettes, entrez les informations suivantes dans le logiciel système et poursuivez la lecture.
   REMARQUE : Type d’expérience = Quantification directe ; Supermix = dd_PCR supermix pour sondes (pas de dUTP) ; Type de test = cible unique par canal ; Infos cible, canal de signal 1 = canal FAM ou canal HEX selon la sonde utilisée.
2. Annotez les échantillons afin que la position de chaque échantillon puisse être déterminée et identifiée efficacement à partir du fichier de données.

7. Analyse des données

1. Effectuez l’analyse des données à l’aide du logiciel compatible fourni par le fabricant du lecteur de gouttelettes.
2. Effectuer un test d’adéquation du système pour évaluer la performance globale (et, par conséquent, la fiabilité) du test.
   1. Vérifiez le nombre d’événements (nombre de gouttelettes) mesuré pour chaque puits sur la plaque de PCR. Idéalement, le nombre d’événements se situe entre 15 000 et 20 000. Si le nombre d’événements est de 10 000 <, cette valeur doit être exclue de l’analyse.
   2. Évaluez le graphique d’amplitude 1D ou 2D et vérifiez la présence de pluie de gouttelettes.
   3. Allez dans l’onglet de la table de données et exportez les données dans un fichier Excel.
3. Calculez le titre vg en suivant les étapes ci-dessous :
   1. La plage de travail de dd_PCR est de 10 à 10 000 copies/μL. Exclure de l’analyse toute valeur de <10 copies/μL. La plage recommandée pour l’équipement dd_PCR utilisé ici est de 25 à 5000 exemplaires/μL.
      REMARQUE : Le logiciel d’analyse des données fournira un numéro de génome du vecteur en fonction du volume de réaction de la PCR (40 μL), mais cela ne tient pas compte des facteurs de dilution appliqués lors de la préparation de l’échantillon.
   2. Calculez le titre vg par volume de l’échantillon (généralement exprimé en vg/mL) en tenant compte des différents facteurs de dilution tout au long de la préparation de l’échantillon à l’aide de la relation suivante :
      REMARQUE : Concentration (valeur obtenue à partir de l’analyse des données) x 10 (dilution de la DNase I avant le traitement) x 10 (dilution du mélange maître PCR) x 1000 (μL à mL) dilution de l’échantillon sélectionné (dans le tampon de dilution AAV - p. ex., tableau 2).
   3. Calculer le coefficient de variation (%CV) entre les répétitions et entre les différentes dilutions d’un même échantillon.
      REMARQUE : Le % CV est calculé en divisant l’écart-type par la moyenne. Si le % CV entre les différentes dilutions est de >20 %, la valeur ne doit pas être considérée comme exacte.
   4. Vérifiez les valeurs du témoin négatif et du témoin positif. Le témoin négatif doit être inférieur à 5 copies/μL.

Résultats

Les résultats peuvent être visualisés à l’aide d’un logiciel approprié. Pour chaque puits, le graphique d’amplitude 1D affiche toutes les gouttelettes par rapport à leur amplitude. Une séparation claire entre les gouttelettes positives et négatives est attendue. Si plus de 10 % du total des gouttelettes se trouvent entre les nuages de gouttelettes positives et négatives (phénomène appelé pluie de gouttelettes), il est nécessaire de mesurer à nouveau l’échantillon (voir la figure 1). Des informations supplémentaires sur la pluie de gouttelettes sont disponibles dans la discussion.

Un tableau de données peut être créé pour résumer tous les renseignements enregistrés, y compris le nom de l’échantillon, le nombre de gouttelettes acceptées (nombre d’événements) et la concentration (copies/μL). Idéalement, le nombre d’événements devrait se situer entre 15 000 et 20 000 gouttelettes acceptées. Si le nombre d’événements pour un puits est inférieur à 10 000, le point de données doit être exclu de l’analyse. Le tableau 5 donne un exemple des données de sortie.

Le titre vg peut être calculé sur la base de la concentration (copies/μL), en tenant compte des dilutions de l’échantillon. La plage de travail de dd_PCR est de 10 à 10 000 copies/μL. Les valeurs inférieures à 10 copies/μL doivent être exclues de l’analyse. Le titre vg des échantillons, ainsi que les témoins positifs et négatifs, doivent être calculés. La valeur mesurée du témoin positif doit avoir un coefficient de variation (%CV) inférieur à 20 % par rapport à la valeur théorique. Le témoin négatif doit être inférieur à 5 copies/μL. De plus, le % CV entre les répétitions et les différentes dilutions pour chaque échantillon doit être calculé. Si le % CV entre différentes dilutions dépasse 20 %, la valeur peut être considérée comme inexacte et il peut être nécessaire de mesurer à nouveau l’échantillon.

Une mesure réussie se caractérise par une séparation nette des nuages de gouttelettes positives et négatives, au moins 10 000 gouttelettes acceptées, une valeur comprise entre 10 copies/μL et 10 000 copies/μL, et un %CV inférieur à 20 % entre les répétitions.

Figure 1 : Visualisation de dd_PCR gouttelettes. (A) Le graphique d’amplitude 1D montre une séparation claire des gouttelettes positives et négatives, indiquant une répartition réussie des gouttelettes. (B) Le graphique montre une mauvaise séparation des gouttelettes positives et négatives, connue sous le nom de pluie de gouttelettes, ce qui suggère une répartition sous-optimale ou des problèmes potentiels avec le test. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Flux de travail pour la quantification des génomes viraux à l’aide de la PCR numérique par gouttelettes. (1) Les tampons, les réactifs et les solutions sont préparés conformément aux instructions du fabricant ou à l’étape 1 du protocole (Préparation des solutions mères). (2) 45 μL de la solution de DNase I sont aliquotes dans chaque tube d’une bandelette PCR à 8 tubes. Après un vortex et une brève centrifugation des échantillons, 5 μL de l’échantillon sont ajoutés à l’un des tubes. La DNase I et la bandelette PCR à huit tubes contenant l’échantillon sont incubées dans un thermocycleur pendant 1 h à 37 °C, puis les échantillons sont dilués en série. (3) Le mélange maître de PCR est préparé comme décrit, et 19,8 μL sont aliquotes dans chaque tube d’une bandelette de PCR à 8 tubes. Les dilutions en série de l’échantillon de l’étape 2 sont ajoutées au mastermix. 20 μL de mastermix plus
la solution d’échantillon est chargée dans la rangée centrale de la cartouche, et 60 μL d’huile générant des gouttelettes sont transférés dans les puits inférieurs d’une cartouche génératrice de gouttelettes. La cartouche est ensuite placée dans le générateur de gouttelettes et fonctionne selon les conditions spécifiées. Après la génération des gouttelettes, 42,5 μL de la rangée supérieure de la cartouche sont transférés sur une plaque PCR multi-puits. (4) La plaque PCR est chargée dans un thermocycleur PCR et fonctionne selon les conditions fournies. La plaque est analysée à l’aide d’un lecteur dd_PCR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Données de précision. Ce tableau présente des données de précision provenant de quatre ensembles d’échantillons de contrôle de la qualité (CQ), chacun avec cinq concentrations (QC1-QC5). Chaque CQ a été mesuré cinq fois. Le coefficient de variation (% CV) entre différents cycles, représentant la répétabilité (A), et entre différents ensembles d’échantillons, représentant une précision intermédiaire (B), est indiqué. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Dilutions des échantillons. Le tableau montre les dilutions d’échantillon recommandées en fonction du titre attendu du génome viral (vg/mL). Un total de trois dilutions est recommandé pour s’assurer qu’au moins deux valeurs se situent dans la plage de travail du test. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Composition du master mix dd_PCR. Ce tableau décrit la composition du dd_PCR master mix, qui comprend une amorce directe et inverse (909 nM), une sonde (227 nM) et dd_PCR supermix pour sondes (sans dUTP, 1x). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Conditions de thermocyclage. Le tableau détaille le programme de PCR recommandé, qui comprend : (1) une incubation de 10 minutes à 95 °C pour la rupture de la capside et l’activation enzymatique, (2) 40 cycles de 30 s à 94 °C pour la dénaturation de l’ADN et 1 min à 60 °C pour le recuit et l’extension, (3) une incubation de 10 minutes à 98 °C pour la désactivation de l’enzyme, et (4) maintien à 4 °C. La température de recuit peut nécessiter une optimisation en fonction du jeu d’amorce/sonde utilisé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Exemple de données de sortie d’une exécution AAV réelle. Le tableau fournit un exemple de données de sortie d’un cycle AAV réel, où un échantillon a été mesuré dans deux dilutions différentes, chacune en double. Le titre du génome viral (vg) (en vg/mL) est calculé à l’aide de la formule suivante : 10 (prétraitement de la DNase I) x 10 (dilution dans le mélange maître) x 1 000 (μL à mL) x dilution dans le tampon de dilution AAV. STDEV représente l’écart-type et CV indique le coefficient de variation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

La quantification précise des copies du génome des vecteurs AAV dans les préparations de vecteurs est essentielle pour le développement de produits de thérapie génique à base d’AAV. Il existe plusieurs méthodes pour déterminer le titre vg, la PCR quantitative (qPCR) et la dd_PCR étant les deux techniques les plus utilisées et les plus acceptées. dd_PCR est souvent préférée à la qPCR en raison de son indépendance vis-à-vis de l’efficacité de l’amplification, de sa précision accrue et de sa plus grande robustesse¹⁵. De nombreux protocoles de titrage du génome vectoriel par dd_PCR sont disponibles dans la littérature, chacun avec ses propres méthodes de préparation d’échantillons 15,16,17. Cependant, il n’existe pas de protocole de consensus qualifié. Cet article présente un protocole de dd_PCR validé et adapté à l’usage pour la quantification des génomes des vecteurs AAV dans des échantillons de vecteurs purifiés (Figure 2).

Une attention particulière à la manipulation des échantillons est essentielle lors de l’exécution de ce protocole. La contamination croisée peut poser un défi important pour évaluer avec précision les titres de VG ; par conséquent, il est préférable de traiter les échantillons sous un poste de travail PCR pour éviter la contamination par de l’ADN étranger. De plus, la bonne exécution de l’incubation de la DNase est cruciale pour éliminer l’ADN contaminant non emballé sans perturber la capside et potentiellement digérer le génome du vecteur emballé. De nombreux protocoles incluent l’inactivation thermique et le traitement à la protéinase K 16,17,18. Cependant, au cours de la mise au point de méthodes internes, il a été constaté qu’un échauffement excessif nuisait au titrage vg et qu’un traitement par protéinase K n’était pas nécessaire (données non présentées).

Alors que dd_PCR devient de plus en plus populaire pour quantifier les génomes viraux, les fabricants ont publié des guides d’application détaillés avec des directives sur la conception et l’optimisation des tests dd_PCR¹⁹. Des informations de dépannage sont également disponibles. En pratique, lorsqu’un test est correctement conçu, les problèmes les plus fréquents incluent la pluie de gouttelettes et le faible nombre de gouttelettes. La pluie de gouttelettes est souvent causée par une mauvaise accessibilité de l’amorce/des sondes à l’amplicon, mais plusieurs stratégies peuvent résoudre ce problème. Par exemple, une expérience de gradient de température peut aider à établir la température de recuit optimale. De plus, la dilution d’échantillons pour réduire la quantité d’ADN (recommandée inférieure à 66 ng) ou la réalisation d’une digestion de restriction avec des enzymes spécifiques qui coupent en dehors de la région de l’amplicon peut améliorer l’accessibilité du modèle. Une recommandation de 10 U d’enzyme de restriction par μg d’ADN est généralement efficace. Le problème du faible nombre de gouttelettes (moins de 10 000) est souvent dû à un mauvais pipetage de l’échantillon et à l’huile dans les cartouches. Un pipetage lent avec des pointes appropriées est recommandé pour éviter le cisaillement des gouttelettes. Bien que le test dd_PCR soit robuste, l’une des limites est le temps prolongé d’obtention des résultats. Le processus, du traitement de l’échantillon à la lecture des gouttelettes, prend plusieurs heures, ce qui peut être un inconvénient lorsque les résultats sont nécessaires rapidement.

La quantification précise des copies du génome de l’AAV dans les préparations de vecteurs est nécessaire à toutes les étapes du cycle de vie de la thérapie génique AAV. Plus précisément, il est important pour optimiser les processus de production et de purification, mener des études précliniques et déterminer les dosages cliniques des produits de thérapie génique à base d’AAV. Le protocole dd_PCR présenté ici est largement applicable et peut être utilisé sur des produits AAV purifiés avec différents sérotypes et transgènes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pipette 8 canaux 10 & micro ; L	Eppendorf	3,12,50,00,010
Pipette 8 canaux 200 & micro ; L	Eppendorf	3,12,50,00,036
Pipette 8 canaux 300 & micro ; L	Eppendorf	3,12,50,00,052
Bandelette PCR 8 puits	Sarstedt	72.991.002
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
C1000 Touch Thermocycleur avec 96&ndash ; Module de réaction à puits profonds	Bio-Rad	1851197
ddPCR Contrôle tampon pour sondes 9 mL (2 x 4,5 mL)	Bio-Rad	1863052
ddPCR Supermix pour sondes (sans dUTP) (2 x 1 mL)	Plaques Bio-Rad	1863023
ddPCR 96 puits (paquet de 25)		Bio-Rad
ddPCR (2 x 1L)	Bio-Rad	1863004
Porte-cartouche DG8	Bio-Rad	1863051
Cartouches DG8 pour QX200/QX100 (paquet de 24)	Joints Bio-Rad	1864008
DG8 pour QX200/QX100 (paquet de 24)	Bio-Rad	1863009
DNase I (10U/µ ; L) + tampon	Roche	4716728001
Gouttelettes Génération Huile pour sondes (10 x 7 mL)	Bio-Rad	1863005
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 0.1-10 &mu ; L, 34 mm, Rack, PCR Clean, STÉRILE  ;	Eppendorf	30078500
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 20-300 &mu ; L, 55 mm, Rack, PCR Clean, STÉRILE  ;	Eppendorf	30078560
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Pointe de filtre, 2-100 &mu ; L, 53 mm, Rack, PCR Clean, STERILE  ;	Eppendorf	30078543
Apprêts lyophilisés en aval et huiles mères respectives à 100 mM  ;	GFP IDT		comme séquence cible. Amorce avant : sonde 5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'
Lyopohilized et stock maître à 100 & micro ; M  ;	GFP IDT		comme séquence cible. Sonde PrimeTime Eco : /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACATCGAGGA/3IABkFQ/
Chlorure de magnésium (MgCl2)	Chemlab Analytical	CL00.1381
Eau sans nucléase	IDT	11-04-02-01
Plaque PCR Thermoscellable, feuille, perçable (paquet de 100)	Bio-Rad	1814040
Pluronic F-68 (100x)  ;	Thermo Fisher Scientific	24040032
potassium (KCl)	Produits chimiques de recherche Honeywell	31248
Logiciel de gestion	QX Bio-Rad		Logiciel pour l’analyse des données ddPCR Générateur
gouttelettes QX200	Bio-Rad	1864002
QX200 Lecteur de gouttelettes	Bio-Rad	1864003
Réservoir de réactifs	VWR	613-1181
Amorces lyophilisées inverses et huiles mères correspondantes à 100 mM  ;	GFP IDT		comme séquence cible. Amorce inverse : 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'Tube
réactionnel SafeSeal, 1,5 mL	Sarstedt	72.706.200
ADN de spermatozoïde de saumon, cisaillé (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	AM9680
TE buffer	IDT		Accompagné d’amorces lors de la commande de
chlorhydrate de Tris (Tris-HCl)	Roche	10812846001