Article de méthode

Optimisation de la préparation de l’antigène pour le dosage de l’inhibition de l’hémagglutination de la sérologie du virus de la maladie de Newcastle

DOI :

10.3791/67256

⸱

24 janvier 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science and Technology, Suzhou Chien-shiung Institute of Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Novel Tumor-targeting Drug Conjugates, 3Crown Bioscience Inc.

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article présente une méthode simplifiée de préparation de l’antigène de 4 unités d’hémagglutination pour le test sérologique du virus de la maladie de Newcastle. En déterminant avec précision le titre d’hémagglutination de l’antigène, combiné à une méthode de titrage inverse plus rigoureuse et à un processus d’ajustement bien défini, il améliore l’efficacité des tests, réduit les faux positifs et améliore la surveillance des maladies chez les volailles.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une évaluation précise des titres d’anticorps contre le virus de la maladie de Newcastle (NDV) est cruciale pour un contrôle et une surveillance efficaces des maladies de la volaille. Cet article présente une méthode optimisée pour la préparation d’une solution d’antigène à 4 unités d’hémagglutination (4-HAU), un composant clé du test d’inhibition de l’hémagglutination (HI) utilisé dans la détection sérologique de la NDV. Contrairement aux méthodes conventionnelles, qui impliquent des étapes de contre-titrage et d’ajustement longues et indéfinies, cette approche rationalise ce processus en mesurant avec précision le titre HA à l’aide d’une série initiale de dilutions (1:3, 1:5, 1:7 et 1:9). Nous fournissons également une méthode spécifique pour ajuster ou reformuler en fonction des résultats du contre-titrage, réduisant ainsi le besoin de contre-titrages répétés. De plus, nous avons évalué l’effet de la précision de la solution de l’antigène 4-HAU sur le titre sérique de HI et avons constaté que lorsque le titre de l’antigène 4-HAU était inférieur à 3, cela entraînait l’apparition d’échantillons HI faussement positifs. En fournissant une méthode précise et en minimisant les tâches de calcul, cette approche augmente l’efficacité et la fiabilité des tests, contribuant ainsi à améliorer la surveillance et le contrôle des maladies dans les populations de volailles.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maladie de Newcastle (ND) est une affection aviaire grave et répandue reconnue dans le monde entier 1,2,3. Il se manifeste par divers symptômes tels qu’une forte fièvre, une détresse respiratoire, une dysenterie, des troubles nerveux et une hémorragie muqueuse4. L’agent causal, le virus de la maladie de Newcastle (NDV), a perduré pendant près d’un siècle, affectant plus de 200 espèces aviaires, dont les poulets, les canards, les oies et les pigeons5. La transmission se fait principalement par contact direct ou indirect avec des oiseaux infectés, les volailles, les pigeons et les oiseaux en liberté servant de réservoirs potentiels6. Malgré le sérotype unique du NDV, sa diversité génétique pose des défis importants pour la gestion de la maladie et les efforts de contrôle 3,7.

La vaccination constitue la principale stratégie de lutte contre la MN, complétée par des mesures de biosécurité strictes 5,8. Divers vaccins commerciaux sont disponibles dans le monde entier pour les volailles, provoquant des réponses robustes en anticorps sériques après l’immunisation9. Ces anticorps jouent un rôle essentiel dans l’atténuation de la gravité des symptômes lors de l’exposition à des souches virulentes et dans la réduction de la transmission entre les troupeaux10. Les protocoles de revaccination standard, impliquant généralement des vaccins vivants atténués administrés toutes les 6 à 12 semaines, sont une pratique courante dans les régions endémiques au ND9. La surveillance régulière des titres d’anticorps post-vaccination dans les troupeaux de volailles commerciales est essentielle pour évaluer l’efficacité du vaccin 11,12,13. De faibles titres d’anticorps après la vaccination peuvent indiquer un échec du vaccin, ce qui incite à prendre des mesures correctives en temps opportun comme une vaccination supplémentaire ou l’étude des facteurs immunosuppresseurs potentiels affectant la réponse immunitaire14.

De multiples techniques sont utilisées pour détecter les anticorps sériques contre le NDV, notamment le dosage immuno-enzymatique, l’inhibition de l’hémagglutination (IH) et le test de neutralisation 9,13,15,16. Chaque méthode présente des avantages et des limites uniques en termes de sensibilité, de spécificité et de rentabilité.

Cet article décrit un protocole étape par étape basé sur le protocole de l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE) pour la réalisation d’IH afin de quantifier les titres d’anticorps spécifiques sériques contre le NDV11. L’hémagglutination (HA), phénomène induit par certains virus enveloppés comme la NDV, implique l’agglutination des globules rouges (GR)9. La protéine hémagglutinine-neuraminidase (HN) à la surface du NDV interagit avec les globules rouges, ce qui entraîne l’agglutination cellulaire et la formation d’un réseau2. Le dosage HI est préféré comme méthode sérologique en raison de sa capacité à évaluer la spécificité des anticorps sériques envers la protéine HN du NDV 8,9. De plus, sa rentabilité et son indépendance vis-à-vis d’instruments spécialisés le rendent accessible et pratique pour une utilisation courante.

Pour améliorer l’efficacité des tests, nous avons affiné le flux de travail du protocole11 de l’OIE, en mettant l’accent sur l’obtention de titres d’antigène HA plus précis et en proposant des ajustements détaillés pour la solution d’antigène à 4 unités d’hémagglutination (4-HAU). De plus, grâce à une analyse comparative, nous avons évalué l’impact de la précision de la 4-HAU sur les résultats de l’IH, fournissant ainsi des informations précieuses aux praticiens de terrain. Cette approche ne se limite pas au test d’anticorps NDV, mais s’étend à la détection des sous-types viraux et d’autres virus hémagglutinants, notamment la rougeole, le polyomavirus, les oreillons et la rubéole.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’approbation du protocole a été accordée par le comité institutionnel local de soin et d’utilisation des animaux. Toutes les procédures impliquant des antigènes viraux vivants et des échantillons de sérum clinique ont été effectuées dans un laboratoire de biosécurité de niveau 2, conformément aux protocoles de sécurité établis.

1. Préparation de la suspension de globules rouges de poulet 1 %

  1. Ajouter 3 mL de la solution d’Alserver (anticoagulant) dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 mL.
  2. Prélever 1 mL de sang dans la veine de l’aile de chacun des trois poulets non immunisés (sans anticorps contre le NDV). Transférez immédiatement le sang dans le tube contenant l’anticoagulant et mélangez délicatement.
  3. Remplissez le tube avec une solution saline stérile 1x tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,2-7,4) jusqu’à un volume total de 12 mL, et mélangez délicatement. Centrifugeuse à 500 × g pendant 10 min à l’aide d’un rotor horizontal.
  4. Retirez avec précaution le surnageant et la couche de globules blancs. Répétez les étapes 1.3 et 1.4 2 fois pour obtenir la pastille de globule rouge.
  5. Pipeter 1 mL de globules rouges dans 99 mL de PBS stérile, pour préparer une suspension de globules rouges à 1 %.
    REMARQUE : Le volume requis de la suspension de globules rouges de poulet à 1 % est estimé à 3 mL/plaque (25 μL/puits x 96 puits x 1,25 = 3,0 mL ; où 1,25 tient compte du gaspillage de pipetage pour assurer un volume suffisant).

2. Reconstitution de l’antigène ou du sérum lyophilisé

  1. Ajouter 2 mL de PBS stérile dans l’ampoule contenant l’antigène ou le sérum lyophilisé. Secouez doucement l’ampoule et laissez-la reposer pendant 2-3 minutes pour minimiser les bulles et assurer une dissolution complète.
    REMARQUE : Suivez les instructions spécifiques du fabricant, car différents types de matériaux lyophilisés n’ont pas été comparés dans cette étude.
  2. Aliquote la solution reconstituée dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL et congeler à -20 °C jusqu’à utilisation.
    REMARQUE : Redéterminez le titre d’HA chaque fois que l’antigène est décongelé et utilisé, ou lorsqu’une nouvelle suspension de globules rouges est préparée.

3. Titrage AH des antigènes

  1. Distribuez respectivement 40, 80, 120 et 160 μL de PBS dans quatre puits adjacents d’une plaque de microtitration jetable à fond en V de 96 puits, puis ajoutez 20 μL d’antigène dans chaque puits et mélangez en pipetant 10 fois vers le haut et vers le bas pour obtenir des dilutions de 1:3, 1:5, 1:7 et 1:9, respectivement. Un schéma de l’opération de dilution est présenté à la figure 1.

figure-protocol-1
Figure 1 : Schéma de principe illustrant la procédure de dilution de la solution d’antigène dans le dosage de l’hémagglutination. La solution d’antigène est diluée dans du PBS dans des rapports de 1:3, 1:5, 1:7 et 1:9, respectivement. Le PBS dans les puits ou les tubes à centrifuger est représenté en bleu, tandis que les antigènes sont représentés en vert. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Étiquetez une nouvelle plaque de microtitration. Ajouter 25 μL de PBS dans chaque puits des rangées 1 à 5.
  2. Placez 25 μL de solutions d’antigène diluées dans les premiers puits des rangées 1 à 5 à l’aide d’une pipette multicanaux, et mélangez en pipetant de haut en bas au moins 5 fois.
  3. Transférez 25 μL du premier puits de chaque rangée au deuxième puits, en mélangeant soigneusement. Continuez le transfert d’un puits à l’autre, jusqu’à la 11e colonne, pour créer des dilutions en série doubles (1:2 à 1:2048). Jeter 25 μL après la 11e colonne.
  4. Ajouter 25 μL de PBS dans chaque puits, en commençant par les puits contenant la plus faible concentration d’antigène.
  5. Ajouter 25 μL de suspension de globules rouges de poulet à 1 % dans chaque puits, en commençant encore une fois par les puits contenant la plus faible concentration d’antigène.
  6. Agitez la plaque sur un agitateur de microplaques pendant ~20 s pour bien mélanger.
  7. Laissez-le tranquillement sur la paillasse à température ambiante (20-25 °C) pendant ~30 min jusqu’à ce que le RBC de la 12e colonne se soit complètement stabilisé. Pour la disposition des plaques, reportez-vous à la figure 2.

figure-protocol-2
Figure 2 : Schéma d’une microplaque utilisée dans le dosage de l’hémagglutination. La première colonne des rangées 1 à 5 contient des dilutions initiales non diluées et diverses dilutions de la solution d’antigène, suivies d’une dilution en série en deux fois de gauche à droite jusqu’à la colonne 11. Le contrôle PBS est placé dans la dernière colonne. Le gradient de l’obscurité à la lumière indique une diminution de la concentration d’antigène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Lisez et enregistrez les résultats. L’HA est déterminé en inclinant la plaque de 90° pendant ~25 s et en observant la présence ou l’absence d’écoulement en forme de larme des globules rouges. La dilution la plus élevée montrant une hémagglutination complète (pas de coulée), représente 1 unité HA. Les puits de la 12e colonne servent de contrôles globaux (négatifs).
  2. Calculer le titre d’AH de chaque rang à l’aide du tableau 1, dont le maximum est utilisé pour la préparation de la solution d’antigène 4-HAU. Par exemple, si a, b, c, d et e sont respectivement égaux à 9, 8, 7, 6, 6, alors 3 x 28 = 768 est la valeur maximale et est le titre HA du stock d’antigènes.
AntigènesColonne de dilution la plus élevée de l’AH completTitre HA du stock non dilué
Stock non diluéun2a
Dilution 3 foisb3 x 2b
Dilution 5 foisc5 x 2c
Dilution 7 foisd7 x 2d
Dilution 9 foise9 x 2e

Tableau 1 : Résultats de l’analyse de l’AH et calcul du titre d’AH de la solution mère.

4. Préparation de la solution de l’antigène 4-HAU

  1. Calculer le facteur de dilution pour la préparation de la solution de l’antigène 4-HAU : figure-protocol-3. Déterminez le volume total de 4-HAU nécessaire : V = 3 ml x Nombre de microplaques. Ensuite, calculez les volumes requis de solution mère d’antigène : figure-protocol-4, et PBS : Vp = V - Va.
    REMARQUE : Les volumes sont mesurés en millilitres. Estimer à 3 mL par plaque de microtitration de la 4-HAU (25 μL/puits x 96 puits x 1,25 = 3 mL).
  2. Pipeter le volume calculé de PBS dans un récipient, puis ajouter le volume correspondant de solution mère d’antigène et bien mélanger pour obtenir la solution d’antigène 4-HAU.
    REMARQUE : La solution d’antigène 4-HAU doit être utilisée dès que possible.

5. Titrage inverse de la solution d’antigène 4-HAU

  1. Distribuer 25, 50, 75, 100, 125 et 150 μL de PBS dans six puits adjacents d’une plaque de microtitration, puis ajouter 25 μL de la solution d’antigène 4-HAU dans chaque puits et mélanger en pipetant de haut en bas 10x.
    REMARQUE : Diluez la solution d’antigène 4-HAU avec du PBS à des dilutions de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 et 1:7. Un schéma de l’opération de dilution est présenté à la figure 3.

figure-protocol-5
Figure 3 : Schéma de principe de la procédure de dilution de la solution de 4 unités d’hémagglutination en contre-titrage. La solution de travail 4-HAU est diluée avec du PBS dans des rapports de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 et 1:7. Le PBS est représenté en bleu et les antigènes en vert. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Transférez 25 μL de chaque solution d’antigène diluée dans les puits d’une autre rangée à l’aide d’une pipette multicanaux. Ajouter 25 μL de PBS à un témoin supplémentaire ainsi qu’à un témoin négatif.
  2. Ajouter 25 μL de PBS dans chaque puits, puis ajouter 25 μL de globules rouges de poulet à 1 % dans chaque puits.
  3. Agitez la plaque sur un agitateur de microplaques pendant ~20 s pour mélanger.
  4. Laissez-le tranquille sur la paillasse à température ambiante (20-25 °C) pendant ~30 min jusqu’à ce que les globules rouges du témoin négatif soient complètement installés.
  5. Lisez et enregistrez les résultats.
    REMARQUE : Le puits de contrôle négatif ne doit montrer aucun HA. Idéalement, la dilution 1:4 est exactement la dilution la plus élevée avec de l’AH complet. Si le titre de la solution de 4-HAU est supérieur à 4, la dilution la plus élevée peut être de 1:5, 1:6 ou 1:7 ; s’il est inférieur, il peut être de 1:2 ou de 1:3. Une présentation schématique du contre-titrage et des résultats représentatifs est présentée à la figure 4.

figure-protocol-6
Figure 4 : Schéma des puits pour le contre-titrage et le résultat représentatif. La solution de travail diluée de 4-HAU est transférée dans un nouveau rang, avec l’ajout d’un témoin PBS supplémentaire. Le gradient du vert foncé au vert clair indique une concentration d’antigène élevée à faible. Les résultats représentatifs démontrent que la dilution 1:4 est la dilution la plus élevée montrant une hémagglutination complète. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Ajustez ou reformulez la solution d’antigène 4-HAU si nécessaire.
    REMARQUE : Si le volume de la solution d’antigène 4-HAU utilisée pour le contre-titrage est de ≤1 % du volume total (le volume de la solution d’antigène 4-HAU ≥ 15 mL), reportez-vous au tableau 2 pour des ajustements spécifiques. Par exemple, si la dilution la plus élevée avec de l’AH complet est de 1:2, le titre de la solution d’antigène 4-HAU est maintenant de 2, et un volume égal d’antigène doit être ajouté comme dans la préparation précédente de la solution d’antigène 4-HAU. À l’inverse, si la dilution la plus élevée de l’AH complet est de 1:6, le titre est maintenant de 6 et la moitié du volume de PBS doit être reconstituée.
    Si le volume utilisé pour le contre-titrage dépasse 1 % du total (le volume de la solution d’antigène 4-HAU < 15 mL), reformuler la solution d’antigène 4-HAU en utilisant le facteur de dilution corrigé. Voir le tableau 3 pour les corrections spécifiques. Par exemple, si la dilution la plus élevée de l’AH complet est de 1:2, le titre de la solution de l’antigène 4-HAU est maintenant de 2 et le facteur de dilution doit être ajusté à 1/2 de l’original. Inversement, si la dilution la plus élevée de l’AH complet est de 1:6, le titre de la solution de l’antigène 4-HAU est maintenant de 6 et le facteur de dilution est ajusté à 3/2 de l’original.
Titre HA du titrage inverseRéapprovisionnement en antigène ou PBS
1:2Va
1:3Va/3
1:5Vp/4
1:6V/2
1:73V/4

Tableau 2 : Tableau de référence pour l’ajustement de la concentration de 4-HAU en fonction des résultats de contre-titrage. Va et Vp représentent respectivement les volumes d’antigène et de PBS utilisés dans la formulation de la solution d’antigène 4-HAU.

Titre HA du titrage inverseCorrection du facteur de dilution
1:2J/2
1:33D/4
1:55J/4
1:63D/2
1:77J/4

Tableau 3 : Tableau de référence de la correction du facteur de dilution pour la repréparation de l’antigène 4-HAU. D représente le facteur de dilution précédemment utilisé dans la préparation de l’antigène 4-HAU.

6. Préparation du sérum

  1. Prélever ~1 mL de sang sur les ailes de poulet sans utiliser d’anticoagulant.
  2. Transférez le sang dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et incubez à 37 °C pendant ~2 h. Centrifugez à 3 000 x g pendant 10 min et aspirez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube.

7. Dosage HI

  1. Étiquetez les plaques de microtitration selon la disposition du test. Ajoutez 25 μL de PBS dans chaque puits des colonnes 1 à 11 et 50 μL dans les puits de la colonne 12 à l’aide d’une pipette multicanaux.
  2. Ajouter 25 μL de sérum dans le premier puits de chaque rangée, y compris les rangées de contrôle sérique positives et négatives. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas au moins 5 fois.
  3. Transférez 25 μL du premier puits de chaque rangée au deuxième puits et mélangez soigneusement. Continuez à transférer et à mélanger du deuxième puits au troisième, et ainsi de suite, jusqu’à la 10ème colonne. Jeter 25 μL de liquide du puits dans la 10e colonne après avoir mélangé.
  4. Ajouter 25 μL d’antigène 4-HAU dans chaque puits des colonnes 1 à 11 dans le sens d’une concentration sérique faible à élevée.
  5. Agitez la plaque sur un agitateur de microplaques pendant ~20 s. Laissez-le tranquille sur la paillasse pendant ~30 min.
  6. Ajouter 25 μL de globules rouges de poulet à 1 % dans chaque puits dans le sens d’une concentration sérique faible à élevée.
  7. Agitez la plaque sur un agitateur de microplaques pendant ~20 s pour bien mélanger. Laissez-le tranquille sur la paillasse pendant ~30 min jusqu’à ce que les globules rouges des puits de contrôle PBS soient complètement installés.
  8. Lisez et enregistrez les résultats.
    REMARQUE : Le titre HI est la dilution sérique la plus élevée qui inhibe complètement l’hémagglutination de l’antigène 4-HAU. Un écoulement en forme de larme des globules rouges peut être observé dans la dernière colonne de chaque rangée, en inclinant la plaque de 90° pendant 25 s. L’AH complet (pas de coulée) peut être observé dans l’avant-dernier puits à partir de la fin de chaque rangée. Pour être valides, il faut que le titre d’IH du témoin sérique positif se situe à moins d’une dilution du titre d’IH connu ; le titre HI du témoin sérique négatif est ≤ 2 log2 ; et l’absence d’auto-HA du contrôle des GR. Pour un schéma de principe du flux de travail du test HA, voir la figure 5.

figure-protocol-7
Figure 5 : Schéma de principe du flux de travail du dosage de l’hémagglutination. Le PBS est représenté en bleu, le sérum en jaune, la solution de l’antigène 4-HAU en vert et la suspension de globules rouges de poulet à 1 % en rouge. Les flèches indiquent l’ordre de distribution du liquide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Validation du titre de la solution d’antigène 4-HAU formulée à l’aide de la méthode optimisée
L’étude a utilisé diverses dilutions de la solution mère d’antigène pour déterminer avec précision le titre d’HA, facilitant ainsi le calcul du facteur de dilution pour la préparation de la solution d’antigène 4-HAU. Les résultats révèlent que la méthode optimisée est à la fois efficace et précise, réduisant le nombre de procédures répétitives de contre-titrage et d’ajustement. Dans le premier scénario, un ti...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode optimisée proposée dans cet article présente une approche permettant de préparer avec précision la solution de l’antigène 4-HAU. Bien que les lignes directrices de l’OIE et de l’UE suggèrent des dilutions initiales pour le titrage de l’HA, elles ne fournissent pas de détails précis sur les taux de dilution à utiliser ni ne proposent de méthodologies spécifiques11,12. De plus, bien que la FAO et l’OIE recommandent le contretitrage comme moyen d’améliorer la précision de la ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.C. a été soutenu par le programme technologique Taicang (TC2021JC16) et les fonds d’équipe d’innovation de l’Institut de technologie Chien-shiung de Suzhou (2023JXKYTD01). H.Y. a été soutenu par le programme Taicang Technology (TC2021JC11). Tous deux ont été soutenus par le Fonds de démarrage pour les nouveaux chercheurs titulaires d’un doctorat de l’Institut de technologie Chien-Shiung de Suzhou.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
  ; Tube à centrifuger stérile (15 mL)  ;Labshark130201030
Centrifugeuse de table à basse vitesse refroidie à l’air  ;TitanLDC-5
Alserve’s SolutionSangon BiotechE607058
CentrifugeuseDLAB9032002121
Pipette Pasteur jetableTitanSWXG-004
Seringue stérile jetable (1 mL)BeyotimeFS801-30PCS
Plaque de microtitration jetable à fond en V (96 puits)Labshark
Agitateur de microplaquesJiangsu Xinkang Medical Equipment Co., LtdXK96-3
NDV HI Négatif SérumQingdao Regen Centre
NDV HI Positif SeraQingdao Regen Centre de développement
NDV HI AntigèneQingdao Regen Centre
PBS Solution (1x)  ;Adamas LifeC8020
Tube à centrifuger stérile (1,5 mL)Labshark130201012
130207001de développement de diagnosticsde diagnosticsde développement de diagnostics

Références

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Test d inhibition de l h magglutinationantig ne 4 HAUd tection d anticorpsm thode de r titrationrythrocytes de pouletplaque de microtitrationd tection s rologique

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