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Article de méthode

Surveillance des changements induits par l’électroporation dans la génération de potentiel d’action dans les cellules HEK à pointes Tet-On génétiquement modifiées

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⸱

DOI :

10.3791/67257

⸱

6 septembre 2024

 ,  , 
1Faculty of Electrical Engineering, University of Ljubljana

Dans cet article

Résumé

Pour l’étude des réponses des cellules excitables in vitro, le protocole décrit la surveillance optique des changements dans la génération de potentiel d’action dus à l’électroporation sur un modèle cellulaire excitable simple de cellules HEK à enrichissement tet-on génétiquement modifiées, ainsi que les changements de tension transmembranaire avec extraction automatisée des paramètres pertinents.

Résumé

Les cellules excitables telles que les cellules neuronales et musculaires peuvent être des cibles primaires dans les traitements basés sur l’électroporation qui émergent rapidement. Cependant, ils peuvent être affectés par des impulsions électriques même dans des thérapies où ils ne sont pas les cibles principales, ce qui peut provoquer des effets secondaires indésirables. Par conséquent, pour optimiser les traitements basés sur l’électroporation des tissus excitables et non excitables, il est nécessaire d’étudier les effets des impulsions électriques sur les cellules excitables, leurs canaux ioniques et l’excitabilité in vitro. À cette fin, un protocole a été développé pour la surveillance optique des changements dans la génération de potentiel d’action dus à l’électroporation sur un modèle cellulaire excitable simple de cellules HEK à enrichissement tet-on génétiquement modifiées. À l’aide d’un colorant potentiométrique fluorescent, les variations de tension transmembranaire ont été surveillées au microscope à fluorescence, et les paramètres pertinents des réponses cellulaires ont été extraits automatiquement à l’aide d’une application MATLAB. De cette façon, les réponses des cellules excitables à différentes impulsions électriques et l’interaction entre l’excitation et l’électroporation ont pu être évaluées efficacement.

Introduction

Dans l’électroporation, les impulsions électriques à haute tension provoquent une augmentation de la perméabilité de la membrane plasmique pour des molécules qui sont autrement mal perméables1. Les techniques basées sur l’électroporation sont aujourd’hui largement utilisées dans les applications de la médecine2, de la biotechnologie3 et de la technologie alimentaire4.

Les cellules excitables telles que les cellules neuronales et musculaires sont parmi les principales cibles des traitements basés sur l’électroporation qui émergent rapidement dans le cœur, le cerveau et les muscles squelettiques5. De plus, ils peuvent être affectés par des impulsions électriques même dans des thérapies où ils ne sont pas les cibles principales, ce qui peut provoquer des effets secondaires indésirables tels que des douleurs, des contractions musculaires et des lésions nerveuses6. En effet, les impulsions électriques peuvent provoquer une stimulation électrique des cellules excitables : elles activent les canaux ioniques voltage-dépendants et déclenchent des potentiels d’action (PA). Cependant, à des champs électriques plus élevés, la membrane plasmique des cellules devient perméabilisée et un courant ionique supplémentaire se produit à travers les pores/défauts7. Ce courant ionique supplémentaire affecte l’excitabilité cellulaire dans une interaction complexe entre l’excitation et l’électroporation. Par conséquent, pour optimiser les traitements basés sur l’électroporation des tissus excitables et non excitables, il est nécessaire d’étudier les effets des impulsions électriques sur les cellules excitables, leurs canaux ioniques et l’excitabilité in vitro.

Dans une étude récente8, nous avons exploré les cellules embryonnaires rénales humaines (HEK) génétiquement modifiées développées par Cohen et al.9,10, en tant qu’outil précieux pour étudier l’électroporation dans les cellules excitables. Dans ces cellules par ailleurs non excitables, un complément minimal de canaux sodiques et potassiques (NaV1,5 et Kir2,1) nécessaires à l’excitabilité est exprimé. L’expression de Kir2.1 dans ces cellules est contrôlée par un système tet-on induit par la doxycycline qui permet l’établissement de deux variantes cellulaires : les cellules S-HEK excitables (contenant NaV1,5 et Kir2,1) et les cellules NS-HEK non excitables (contenant uniquement les canaux NaV1,5). Cela nous permet de comparer les effets des impulsions électriques sur des variantes excitables et non excitables du même type de cellules. Par rapport aux cellules excitables primaires isolées, aux cellules excitables différenciées des cellules souches pluripotentes embryonnaires ou induites, et aux lignées cellulaires dérivées de tissus excitables, les cellules S-HEK présentent plusieurs avantages : elles sont faciles à manipuler, à cultiver et à propager, ont des canaux sodiques et potassiques bien définis et génèrent des PA robustes8.

Nous avons conçu un protocole de surveillance des changements de tension transmembranaire (TMV) déclenchés par des impulsions électriques de différentes amplitudes à l’aide d’un colorant potentiométrique fluorescent. De cette façon, nous pouvons étudier comment l’électroporation affecte la génération d’AP dans les cellules S-HEK et d’autres changements dans le TMV dans les cellules S-HEK et NS-HEK. En bref, les cellules S-HEK ou NS-HEK sont exposées à une seule impulsion électrique de 100 μs toutes les 2 minutes, et les changements relatifs de fluorescence sont enregistrés pendant environ 3 s autour de chaque application d’impulsion. Les impulsions appliquées sont de tension croissante, déclenchant d’abord des points d’accès dans les cellules et, à un champ électrique plus élevé, une électroporation. L’intervalle de 2 minutes entre l’application des impulsions a été choisi pour minimiser les effets cumulatifs possibles des impulsions consécutives tout en gardant les expériences suffisamment courtes pour ne pas détériorer les cellules. Le traitement de l’image a été automatisé à l’aide d’une application MATLAB personnalisée afin d’extraire les paramètres pertinents des réponses de fluorescence du colorant potentiométrique, évaluant ainsi les changements de TMV (AP et dépolarisation soutenue due à l’électroporation) dans les cellules S-HEK et NS-HEK.

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Protocole

1. Préparation des réactifs et culture cellulaire

  1. Préparez le milieu de culture cellulaire en complétant le Eagle’s Modified Eagle’s Medium-High Glucose avec 10 % de sérum de veau fœtal, 2 mM de glutamine, de la pénicilline-streptomycine (pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 μg/mL), 2 μg/mL de puromycine, 5 μg/mL de blasticidine et 200 μg/mL de génétique.
  2. Préparez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 et 1,8 mM de KH2PO4, pH 7,4. Filtrez-le à travers un filtre à membrane stérilisant avec une taille de pores de 0,22 μm.
  3. Préparez la solution de Tyrode avec 2 mM de KCl, 125 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM d’HEPES, 30 mM de glucose, pH 7,3. Préparez une solution de tyrode à faible teneur en potassium avec 0,5 mM de KCl, 126,5 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM d’HEPES, 30 mM de glucose, pH de 7,3. Filtrez les deux solutions à travers un filtre à membrane stérilisant avec une taille de pores de 0,22 μm.
  4. Préparez une solution mère de poly-L-lysine à 1 mg/mL en ajoutant 5 mL de PBS dans un flacon contenant 5 mg de poly-L-lysine.
  5. Préparez une solution mère de doxycycline de 2 mg/mL dans de l’eau distillée et filtrez-la à travers un filtre à membrane stérilisant avec une taille de pores de 0,22 μm.
  6. Préparer une solution mère de colorant potentiométrique ElectroFluor630 de 4 mM dans de l’éthanol pur (ajouter 25 μL d’éthanol pur dans le tube contenant 100 nM - 73 μg de colorant).
  7. Cultiver des cellules HEK génétiquement modifiées dans une fiole T25 dans 6 mL du milieu de culture cellulaire décrit précédemment8. Les ingrédients du milieu de culture sont sensibles à la lumière ; Ainsi, gardez le fluide à l’abri de la lumière (enveloppez le ballon de fluide dans du papier d’aluminium) et effectuez le passage dans des conditions de faible luminosité.
  8. Passez les cellules tous les 3-4 jours en ensemenceant 3 x 105 ou 5 x 105 cellules dans une fiole T25 fraîche. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Maintenir les cellules dans un ballon maître en tant que cellules NS-HEK non excitables sans ajout de doxycycline car elles ne tolèrent pas l’expression soutenue de Kir2.1. Utilisez des cellules de passages inférieurs à 14 dans les expériences.

2. Préparation de l’échantillon

  1. Revêtement en poly-L-lysine de lames de chambre en verre de couverture
    1. Pipeter 1 mL de PBS dans un puits des lames de la chambre en verre à 2 puits, ajouter 10 μL de solution stérile de poly-L-lysine à 1 mg/mL et bien mélanger à l’aide d’une pipette.
    2. Incuber pendant 1,5 h à température ambiante dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. Retirez le PBS avec la poly-L-lysine sans autre lavage.
  2. Ensemencement des cellules
    1. Préparer une dilution de 1:10 de la solution mère de doxycycline dans un milieu de culture dans un tube de 1,5 mL. Pour chaque puits de 30 μL de dilution de doxycycline 1:10 est nécessaire (3 μL de solution mère de doxycycline et 27 μL de milieu de culture), préparer le volume final en fonction du nombre total de puits expérimentaux.
    2. Retirer le milieu de culture de la fiole T25 et trypsiniser les cellules avec 2,5 mL de solution de trypsine-EDTA dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant 2 min.
    3. Ajouter 2,5 mL de milieu de culture frais et, par pipetage doux, détacher les cellules de la surface. Mélangez bien la suspension cellulaire.
    4. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et déterminez la densité des cellules en suspension.
    5. Calculer le volume de suspension cellulaire trypsinisée nécessaire à l’établissement de la culture. Pour une culture de 2 jours, ensemencez 2,5 x 105 cellules, et pour une culture de 3 jours, ensemencez 1 x 105 cellules par puits. Ajustez le nombre exact de cellules si nécessaire.
    6. Calculez le volume du milieu de culture en soustrayant le volume de suspension cellulaire précédemment calculé de 1470 μL. Les 30 μL restants représentent le volume de dilution de la doxycycline 1:10. Le volume total dans chaque puits sera de 1500 μL (cellules, doxycycline et milieu de culture).
    7. Pour préparer des échantillons avec des cellules S-HEK excitables, pipetez le volume calculé de milieu de culture et de suspension cellulaire trypsinisée dans un puits et ajoutez 30 μL de dilution de doxycycline 1:10. N’utilisez qu’un seul puits des deux chambres car l’expérience dure beaucoup de temps (environ 40 min). Bien mélanger par pipetage doux juste avant de placer les chambres dans l’incubateur de CO2 .
    8. Pour la préparation d’échantillons avec des cellules NS-HEK non excitables, pipetez le volume calculé de milieu de culture dans un puits et ajoutez 90 % du volume calculé de suspension cellulaire pour les cellules S-HEK sans doxycycline. Les cellules NS-HEK se développent légèrement plus rapidement que les cellules S-HEK.
    9. Incuber les chambres dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 2 à 3 jours avant l’expérience. Pour les échantillons contenant de la doxycycline, ce temps d’incubation est suffisant pour rendre les cellules excitables.
  3. Étiquetage des cellules
    1. Avant l’expérience, pipeter 3 μL de solution mère de colorant potentiométrique dans un tube de 1,5 mL et laisser le tube ouvert à température ambiante dans une hotte à flux laminaire pour permettre à l’éthanol de s’évaporer et au colorant potentiométrique de sécher (environ 15 min). Ajouter 997 μL de milieu de culture froid (provenant d’un réfrigérateur à 4 °C) dans le tube et dissoudre le colorant jusqu’à une concentration finale de 12 μM.
    2. Retirer le milieu de culture du puits et ajouter 1 mL de solution de colorant potentiométrique dans les cellules. Réfrigérez-les à 4 °C et incubez pendant 20 min.
    3. Retirez la solution de colorant potentiométrique et conservez-la dans le tube pour une réutilisation ultérieure (pour un maximum de six expériences séquentielles en 1 jour).
    4. Lavez doucement les cellules 3 fois avec la solution de Tyrode, et après le dernier lavage, pipetez 1 mL de solution de Tyrode à faible teneur en potassium dans le puits.

3. Électrostimulation et électroporation

  1. Configurez la synchronisation de l’émission d’impulsions avec l’acquisition d’images à l’aide d’un signal TTL du système de microscope qui déclenche le générateur d’impulsions. Pour générer des impulsions haute tension, utilisez un générateur d’impulsions personnalisé11 ou tout générateur d’impulsions pouvant être déclenché en externe avec un signal TTL.
    REMARQUE : Dans la configuration expérimentale présentée, le logiciel LAS X est utilisé pour l’acquisition d’images, qui peut être configuré pour envoyer un signal TTL à un moment présélectionné lors d’une acquisition en accéléré.
  2. Placez deux électrodes parallèles en fil Pt/Ir, de 0,8 mm de diamètre et de 5 mm de distance entre les bords intérieurs, au fond de la chambre et fixez la chambre sous le microscope.
  3. Connectez les électrodes au générateur d’impulsions. Connectez la sortie du générateur d’impulsions à un oscilloscope à l’aide d’une sonde de tension et de courant pour permettre de vérifier que les impulsions ont été correctement délivrées pendant l’expérience.
  4. Concentrez les cellules en fond clair. Imagez les cellules qui sont situées à peu près au milieu entre les électrodes.
  5. Commencez la première acquisition d’images de fluorescence en mode time-lapse avec un objectif 40x, en enregistrant le signal de fluorescence dans tout le champ de vision. La caméra doit être suffisamment rapide pour acquérir un parcours temporel clair d’un potentiel d’action (idéalement supérieur à 25 images/s).
    1. Acquérez 80 images en mode time-lapse, avec au moins 25 images/s pour résoudre le déroulement en temps réel du potentiel d’action. La durée totale d’acquisition de l’image est d’environ 3 s. Lors de l’acquisition d’images, illuminez les cellules avec une longueur d’onde d’excitation de 635 nm, un temps d’exposition de 10 ms, et détectez l’émission à environ 700 nm. Dans cette première acquisition, n’appliquez aucune impulsion - cette acquisition sera utilisée pour corriger les acquisitions ultérieures pour le photoblanchiment par colorant. Après cette acquisition, attendez 2 min.
      REMARQUE : Cette expérience utilise 27,8 images/s, c’est-à-dire une période de 36 ms, qui est le temps écoulé entre le début de la première acquisition d’image et le début de l’acquisition d’image suivante dans l’enregistrement en accéléré.
  6. Toutes les 2 min, enregistrez un time-lapse de la même manière qu’à l’étape 3.5. Pour ces acquisitions, appliquer une seule impulsion de 100 μs au moment de l’acquisition de la 10ème image (à 324 ms). Acquérez des images avec les tensions d’impulsion suivantes : 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V et 200 V. Estimez le champ électrique auquel les cellules sont exposées en tant que rapport tension/distance électrode appliqué (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 et 400 V/cm).
    REMARQUE : À des champs électriques plus faibles, les impulsions déclencheront des potentiels d’action ; À des champs électriques plus élevés, ils déclenchent une électroporation, qui se manifeste par une dépolarisation prolongée. La durée de l’expérience sur chaque échantillon de cellules est d’environ 40 min (20 min pour le marquage et 20 min pour la microscopie).

4. Analyse des données

  1. Exportez les enregistrements time-lapse au format tiff.
  2. Placez les enregistrements en accéléré de toutes les tensions appliquées au cours d’une expérience individuelle (un échantillon de cellules) dans un seul dossier. Renommez les enregistrements time-lapse de manière à ce que le champ électrique E puisse être reconnu par l’application MATLAB : Vcm (par exemple, 126Vcm pour 126 V/cm). Les autres parties du nom peuvent être arbitraires. Pour l’acquisition au début de l’expérience où aucune impulsion n’est appliquée, renommer en utilisant l’expression 000Vcm. Un exemple des noms d’enregistrement time-lapse : 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm, etc.
  3. Ouvrez l’application, qui peut être téléchargée à partir de
    https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Cliquez sur Sélectionner le dossier de données pour choisir le dossier contenant les enregistrements en accéléré d’une expérience.
  4. Sélectionnez les pixels à utiliser pour une analyse plus approfondie des données. Pour ce faire, utilisez deux curseurs pour déterminer le seuil bas pour une image claire des membranes (en violet) et le seuil haut pour l’élimination des débris (gros points à forte fluorescence) de l’analyse (en vert).
  5. Sélectionnez Analyser les données. Dans l’onglet Analyse, une table avec les paramètres extraits s’affiche. Sur le côté droit du tableau, des graphiques de fluorescence relative dans le temps apparaissent pour chaque E utilisé. Sélectionnez les graphiques d’un E donné dans le menu déroulant situé sur le côté gauche au-dessus du tableau.
  6. Examinez tous les graphiques et effectuez une correction manuelle en cas de détection de faux pics. Sélectionnez Effacer les pics AUTO en bas de l’onglet Analyse et les pics détectés automatiquement sont effacés. Cliquez sur le graphique pour déterminer manuellement un nouveau point de pointe.
  7. Sélectionnez Réexécuter la détection de pic AUTO en bas de l’onglet Analyse pour effectuer à nouveau la détection automatique de pic. Les paramètres extraits seront maintenant ajustés au nouveau pic.
  8. Sélectionnez Exporter les données en bas à droite dans l’onglet Analyse pour exporter les données vers le même dossier sous la forme d’un fichier .mat, d’un fichier tableur et d’images PNG pour chaque E utilisé.

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Résultats

Les modifications du TMV dans les cellules excitables in vitro déclenchées par des impulsions électriques peuvent être surveillées optiquement avec ce protocole, et les signaux de fluorescence peuvent être analysés pour extraire leurs paramètres pertinents.

Le dispositif expérimental est illustré à la figure 1A. La figure 1B illustre un signal typique d’impulsion électrique de 100 μs utilisé dans les expériences. Les cellules...

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Discussion

Les cellules S-HEK sont un modèle cellulaire excitable simple avec des canaux sodiques et potassiques bien définis, NaV1,5 et Kir2,19. Cela nous permet d’effectuer des études approfondies sur la façon dont les cellules excitables réagissent aux impulsions électriques appliquées et de relier les données expérimentales avec des modèles mathématiques basés sur les caractéristiques théoriques bien connues des canaux exprimés dans les cellules S-H...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par l’Agence slovène pour la recherche et l’innovation (ARIS) dans le cadre du programme de recherche P2-0249, du programme d’infrastructure I0-0022 et du projet de recherche J2-2503. Les travaux ont été en partie soutenus par l’ARIS et l’Université de Ljubljana par le biais du financement de programmes de recherche en démarrage. Le travail a été en partie soutenu par l’Union européenne et ARIS par le biais d’un financement NextGenerationEU et NOO dans le cadre du projet MN-0023. Les travaux ont été en partie soutenus par l’Union européenne par le biais de la bourse ERC Starting Grant (n° 101115323 - REINCARNATION) et de la bourse Marie Skłodowska-Curie (n° 893077 - EPmIC). Les points de vue et opinions exprimés sont toutefois ceux de l’auteur ou des auteurs et ne reflètent pas nécessairement ceux de l’Union européenne ou du Conseil européen de la recherche. Ni l’Union européenne ni l’autorité qui les octroie ne peuvent en être tenues responsables. Les auteurs remercient le groupe d’Adam E. Cohen de l’Université de Harvard pour avoir aimablement fourni les cellules HEK dopées tet-on et Duša Hodžić pour son aide dans le laboratoire de culture cellulaire.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de 1,5 mLRatiolab  ;5615000
2 puits Nunc Lab-Tek II chambré #1.5 Système de verre de protection allemandThermo Fisher Scientific  ;
ADP305 Sonde de tension différentielleTeledyne LeCroy
AP015 Sonde de courantTeledyne LeCroy
Blasticidine  ;Thermo Fisher Scientific  ;
incubateur à CO2PHCbi  ;MCO -230AICUV
Doxycycline  ;Sigma-Aldrich/MerckD9891
Dulbecco' s Modifed Eagle » s Milieu de croissance du glucose moyennement élevéSigma-Aldrich/MerckD5671
ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)Sondespotentiométriques31795
Sérum fœtal bovinSigma-Aldrich/MerckF2442
GeneticinThermo Fisher Scientific  ;
GlutamineSigma-Aldrich/MerckG7513
Hotte à flux laminaireIskra Pio  ;MC 15-2
MATLABMathworks
Pénicilline&ndash ; streptomycineSigma-Aldrich/MerckP07681
Poly-L-lysine bromhydrate  ;Sigma-Aldrich/MerckP9155-5MG  ;   ;
Générateur d’impulsions  ;Survoir référence11
PuromycinThermo Fisher Scientific  ;
T25 25cm² ; Fiole de culture tissulaireTPP  ;90026
Tet-on Spiking HEKcells American Type Culture Collection ATCCCRL-3479
Thunder Imager Système de cellules vivantes pour la microscopie à fluorescenceLeica Microsystems  ;
Solution trypsine-EDTASigma-Aldrich/MerckT3924
WavePro 7300A OscilloscopeTeledyne LeCroy
155379A111390310131035 mesure A1113803

Références

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  2. Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
  3. Kotnik, T., et al. Electroporation-based applications in biotechnology. Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).
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  13. Lee, P., et al. In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models. Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).

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