Surveillance des changements induits par l’électroporation dans la génération de potentiel d’action dans les cellules HEK à pointes Tet-On génétiquement modifiées

Summary

Pour l’étude des réponses des cellules excitables in vitro, le protocole décrit la surveillance optique des changements dans la génération de potentiel d’action dus à l’électroporation sur un modèle cellulaire excitable simple de cellules HEK à enrichissement tet-on génétiquement modifiées, ainsi que les changements de tension transmembranaire avec extraction automatisée des paramètres pertinents.

Abstract

Les cellules excitables telles que les cellules neuronales et musculaires peuvent être des cibles primaires dans les traitements basés sur l’électroporation qui émergent rapidement. Cependant, ils peuvent être affectés par des impulsions électriques même dans des thérapies où ils ne sont pas les cibles principales, ce qui peut provoquer des effets secondaires indésirables. Par conséquent, pour optimiser les traitements basés sur l’électroporation des tissus excitables et non excitables, il est nécessaire d’étudier les effets des impulsions électriques sur les cellules excitables, leurs canaux ioniques et l’excitabilité in vitro. À cette fin, un protocole a été développé pour la surveillance optique des changements dans la génération de potentiel d’action dus à l’électroporation sur un modèle cellulaire excitable simple de cellules HEK à enrichissement tet-on génétiquement modifiées. À l’aide d’un colorant potentiométrique fluorescent, les variations de tension transmembranaire ont été surveillées au microscope à fluorescence, et les paramètres pertinents des réponses cellulaires ont été extraits automatiquement à l’aide d’une application MATLAB. De cette façon, les réponses des cellules excitables à différentes impulsions électriques et l’interaction entre l’excitation et l’électroporation ont pu être évaluées efficacement.

Introduction

Dans l’électroporation, les impulsions électriques à haute tension provoquent une augmentation de la perméabilité de la membrane plasmique pour des molécules qui sont autrement mal perméables¹. Les techniques basées sur l’électroporation sont aujourd’hui largement utilisées dans les applications de la médecine², de la biotechnologie³ et de la technologie alimentaire⁴.

Les cellules excitables telles que les cellules neuronales et musculaires sont parmi les principales cibles des traitements basés sur l’électroporation qui émergent rapidement dans le cœur, le cerveau et les muscles squelettiques⁵. De plus, ils peuvent être affectés par des impulsions électriques même dans des thérapies où ils ne sont pas les cibles principales, ce qui peut provoquer des effets secondaires indésirables tels que des douleurs, des contractions musculaires et des lésions nerveuses⁶. En effet, les impulsions électriques peuvent provoquer une stimulation électrique des cellules excitables : elles activent les canaux ioniques voltage-dépendants et déclenchent des potentiels d’action (PA). Cependant, à des champs électriques plus élevés, la membrane plasmique des cellules devient perméabilisée et un courant ionique supplémentaire se produit à travers les pores/défauts⁷. Ce courant ionique supplémentaire affecte l’excitabilité cellulaire dans une interaction complexe entre l’excitation et l’électroporation. Par conséquent, pour optimiser les traitements basés sur l’électroporation des tissus excitables et non excitables, il est nécessaire d’étudier les effets des impulsions électriques sur les cellules excitables, leurs canaux ioniques et l’excitabilité in vitro.

Dans une étude récente⁸, nous avons exploré les cellules embryonnaires rénales humaines (HEK) génétiquement modifiées développées par Cohen et ^al.9,10, en tant qu’outil précieux pour étudier l’électroporation dans les cellules excitables. Dans ces cellules par ailleurs non excitables, un complément minimal de canaux sodiques et potassiques (Na_V1,5 et K_ir2,1) nécessaires à l’excitabilité est exprimé. L’expression de K_ir2.1 dans ces cellules est contrôlée par un système tet-on induit par la doxycycline qui permet l’établissement de deux variantes cellulaires : les cellules S-HEK excitables (contenant Na_V1,5 et K_ir2,1) et les cellules NS-HEK non excitables (contenant uniquement les canaux Na_V1,5). Cela nous permet de comparer les effets des impulsions électriques sur des variantes excitables et non excitables du même type de cellules. Par rapport aux cellules excitables primaires isolées, aux cellules excitables différenciées des cellules souches pluripotentes embryonnaires ou induites, et aux lignées cellulaires dérivées de tissus excitables, les cellules S-HEK présentent plusieurs avantages : elles sont faciles à manipuler, à cultiver et à propager, ont des canaux sodiques et potassiques bien définis et génèrent des PA robustes⁸.

Nous avons conçu un protocole de surveillance des changements de tension transmembranaire (TMV) déclenchés par des impulsions électriques de différentes amplitudes à l’aide d’un colorant potentiométrique fluorescent. De cette façon, nous pouvons étudier comment l’électroporation affecte la génération d’AP dans les cellules S-HEK et d’autres changements dans le TMV dans les cellules S-HEK et NS-HEK. En bref, les cellules S-HEK ou NS-HEK sont exposées à une seule impulsion électrique de 100 μs toutes les 2 minutes, et les changements relatifs de fluorescence sont enregistrés pendant environ 3 s autour de chaque application d’impulsion. Les impulsions appliquées sont de tension croissante, déclenchant d’abord des points d’accès dans les cellules et, à un champ électrique plus élevé, une électroporation. L’intervalle de 2 minutes entre l’application des impulsions a été choisi pour minimiser les effets cumulatifs possibles des impulsions consécutives tout en gardant les expériences suffisamment courtes pour ne pas détériorer les cellules. Le traitement de l’image a été automatisé à l’aide d’une application MATLAB personnalisée afin d’extraire les paramètres pertinents des réponses de fluorescence du colorant potentiométrique, évaluant ainsi les changements de TMV (AP et dépolarisation soutenue due à l’électroporation) dans les cellules S-HEK et NS-HEK.

Protocol

1. Préparation des réactifs et culture cellulaire

1. Préparez le milieu de culture cellulaire en complétant le Eagle’s Modified Eagle’s Medium-High Glucose avec 10 % de sérum de veau fœtal, 2 mM de glutamine, de la pénicilline-streptomycine (pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 μg/mL), 2 μg/mL de puromycine, 5 μg/mL de blasticidine et 200 μg/mL de génétique.
2. Préparez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na₂HPO₄ et 1,8 mM de KH₂PO₄, pH 7,4. Filtrez-le à travers un filtre à membrane stérilisant avec une taille de pores de 0,22 μm.
3. Préparez la solution de Tyrode avec 2 mM de KCl, 125 mM de NaCl, 2 mM de CaCl₂, 1 mM de MgCl₂, 10 mM d’HEPES, 30 mM de glucose, pH 7,3. Préparez une solution de tyrode à faible teneur en potassium avec 0,5 mM de KCl, 126,5 mM de NaCl, 2 mM de CaCl₂, 1 mM de MgCl₂, 10 mM d’HEPES, 30 mM de glucose, pH de 7,3. Filtrez les deux solutions à travers un filtre à membrane stérilisant avec une taille de pores de 0,22 μm.
4. Préparez une solution mère de poly-L-lysine à 1 mg/mL en ajoutant 5 mL de PBS dans un flacon contenant 5 mg de poly-L-lysine.
5. Préparez une solution mère de doxycycline de 2 mg/mL dans de l’eau distillée et filtrez-la à travers un filtre à membrane stérilisant avec une taille de pores de 0,22 μm.
6. Préparer une solution mère de colorant potentiométrique ElectroFluor630 de 4 mM dans de l’éthanol pur (ajouter 25 μL d’éthanol pur dans le tube contenant 100 nM - 73 μg de colorant).
7. Cultiver des cellules HEK génétiquement modifiées dans une fiole T25 dans 6 mL du milieu de culture cellulaire décrit précédemment⁸. Les ingrédients du milieu de culture sont sensibles à la lumière ; Ainsi, gardez le fluide à l’abri de la lumière (enveloppez le ballon de fluide dans du papier d’aluminium) et effectuez le passage dans des conditions de faible luminosité.
8. Passez les cellules tous les 3-4 jours en ensemenceant 3 x 10⁵ ou 5 x 10⁵ cellules dans une fiole T25 fraîche. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Maintenir les cellules dans un ballon maître en tant que cellules NS-HEK non excitables sans ajout de doxycycline car elles ne tolèrent pas l’expression soutenue de K_ir2.1. Utilisez des cellules de passages inférieurs à 14 dans les expériences.

2. Préparation de l’échantillon

1. Revêtement en poly-L-lysine de lames de chambre en verre de couverture
   1. Pipeter 1 mL de PBS dans un puits des lames de la chambre en verre à 2 puits, ajouter 10 μL de solution stérile de poly-L-lysine à 1 mg/mL et bien mélanger à l’aide d’une pipette.
   2. Incuber pendant 1,5 h à température ambiante dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. Retirez le PBS avec la poly-L-lysine sans autre lavage.
2. Ensemencement des cellules
   1. Préparer une dilution de 1:10 de la solution mère de doxycycline dans un milieu de culture dans un tube de 1,5 mL. Pour chaque puits de 30 μL de dilution de doxycycline 1:10 est nécessaire (3 μL de solution mère de doxycycline et 27 μL de milieu de culture), préparer le volume final en fonction du nombre total de puits expérimentaux.
   2. Retirer le milieu de culture de la fiole T25 et trypsiniser les cellules avec 2,5 mL de solution de trypsine-EDTA dans un incubateur de CO₂ à 37 °C pendant 2 min.
   3. Ajouter 2,5 mL de milieu de culture frais et, par pipetage doux, détacher les cellules de la surface. Mélangez bien la suspension cellulaire.
   4. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et déterminez la densité des cellules en suspension.
   5. Calculer le volume de suspension cellulaire trypsinisée nécessaire à l’établissement de la culture. Pour une culture de 2 jours, ensemencez 2,5 x 10⁵ cellules, et pour une culture de 3 jours, ensemencez 1 x 10⁵ cellules par puits. Ajustez le nombre exact de cellules si nécessaire.
   6. Calculez le volume du milieu de culture en soustrayant le volume de suspension cellulaire précédemment calculé de 1470 μL. Les 30 μL restants représentent le volume de dilution de la doxycycline 1:10. Le volume total dans chaque puits sera de 1500 μL (cellules, doxycycline et milieu de culture).
   7. Pour préparer des échantillons avec des cellules S-HEK excitables, pipetez le volume calculé de milieu de culture et de suspension cellulaire trypsinisée dans un puits et ajoutez 30 μL de dilution de doxycycline 1:10. N’utilisez qu’un seul puits des deux chambres car l’expérience dure beaucoup de temps (environ 40 min). Bien mélanger par pipetage doux juste avant de placer les chambres dans l’incubateur de CO₂ .
   8. Pour la préparation d’échantillons avec des cellules NS-HEK non excitables, pipetez le volume calculé de milieu de culture dans un puits et ajoutez 90 % du volume calculé de suspension cellulaire pour les cellules S-HEK sans doxycycline. Les cellules NS-HEK se développent légèrement plus rapidement que les cellules S-HEK.
   9. Incuber les chambres dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant 2 à 3 jours avant l’expérience. Pour les échantillons contenant de la doxycycline, ce temps d’incubation est suffisant pour rendre les cellules excitables.
3. Étiquetage des cellules
   1. Avant l’expérience, pipeter 3 μL de solution mère de colorant potentiométrique dans un tube de 1,5 mL et laisser le tube ouvert à température ambiante dans une hotte à flux laminaire pour permettre à l’éthanol de s’évaporer et au colorant potentiométrique de sécher (environ 15 min). Ajouter 997 μL de milieu de culture froid (provenant d’un réfrigérateur à 4 °C) dans le tube et dissoudre le colorant jusqu’à une concentration finale de 12 μM.
   2. Retirer le milieu de culture du puits et ajouter 1 mL de solution de colorant potentiométrique dans les cellules. Réfrigérez-les à 4 °C et incubez pendant 20 min.
   3. Retirez la solution de colorant potentiométrique et conservez-la dans le tube pour une réutilisation ultérieure (pour un maximum de six expériences séquentielles en 1 jour).
   4. Lavez doucement les cellules 3 fois avec la solution de Tyrode, et après le dernier lavage, pipetez 1 mL de solution de Tyrode à faible teneur en potassium dans le puits.

3. Électrostimulation et électroporation

1. Configurez la synchronisation de l’émission d’impulsions avec l’acquisition d’images à l’aide d’un signal TTL du système de microscope qui déclenche le générateur d’impulsions. Pour générer des impulsions haute tension, utilisez un générateur d’impulsions personnalisé¹¹ ou tout générateur d’impulsions pouvant être déclenché en externe avec un signal TTL.
   REMARQUE : Dans la configuration expérimentale présentée, le logiciel LAS X est utilisé pour l’acquisition d’images, qui peut être configuré pour envoyer un signal TTL à un moment présélectionné lors d’une acquisition en accéléré.
2. Placez deux électrodes parallèles en fil Pt/Ir, de 0,8 mm de diamètre et de 5 mm de distance entre les bords intérieurs, au fond de la chambre et fixez la chambre sous le microscope.
3. Connectez les électrodes au générateur d’impulsions. Connectez la sortie du générateur d’impulsions à un oscilloscope à l’aide d’une sonde de tension et de courant pour permettre de vérifier que les impulsions ont été correctement délivrées pendant l’expérience.
4. Concentrez les cellules en fond clair. Imagez les cellules qui sont situées à peu près au milieu entre les électrodes.
5. Commencez la première acquisition d’images de fluorescence en mode time-lapse avec un objectif 40x, en enregistrant le signal de fluorescence dans tout le champ de vision. La caméra doit être suffisamment rapide pour acquérir un parcours temporel clair d’un potentiel d’action (idéalement supérieur à 25 images/s).
   1. Acquérez 80 images en mode time-lapse, avec au moins 25 images/s pour résoudre le déroulement en temps réel du potentiel d’action. La durée totale d’acquisition de l’image est d’environ 3 s. Lors de l’acquisition d’images, illuminez les cellules avec une longueur d’onde d’excitation de 635 nm, un temps d’exposition de 10 ms, et détectez l’émission à environ 700 nm. Dans cette première acquisition, n’appliquez aucune impulsion - cette acquisition sera utilisée pour corriger les acquisitions ultérieures pour le photoblanchiment par colorant. Après cette acquisition, attendez 2 min.
      REMARQUE : Cette expérience utilise 27,8 images/s, c’est-à-dire une période de 36 ms, qui est le temps écoulé entre le début de la première acquisition d’image et le début de l’acquisition d’image suivante dans l’enregistrement en accéléré.
6. Toutes les 2 min, enregistrez un time-lapse de la même manière qu’à l’étape 3.5. Pour ces acquisitions, appliquer une seule impulsion de 100 μs au moment de l’acquisition de la 10ème image (à 324 ms). Acquérez des images avec les tensions d’impulsion suivantes : 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V et 200 V. Estimez le champ électrique auquel les cellules sont exposées en tant que rapport tension/distance électrode appliqué (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 et 400 V/cm).
   REMARQUE : À des champs électriques plus faibles, les impulsions déclencheront des potentiels d’action ; À des champs électriques plus élevés, ils déclenchent une électroporation, qui se manifeste par une dépolarisation prolongée. La durée de l’expérience sur chaque échantillon de cellules est d’environ 40 min (20 min pour le marquage et 20 min pour la microscopie).

4. Analyse des données

1. Exportez les enregistrements time-lapse au format tiff.
2. Placez les enregistrements en accéléré de toutes les tensions appliquées au cours d’une expérience individuelle (un échantillon de cellules) dans un seul dossier. Renommez les enregistrements time-lapse de manière à ce que le champ électrique E puisse être reconnu par l’application MATLAB : Vcm (par exemple, 126Vcm pour 126 V/cm). Les autres parties du nom peuvent être arbitraires. Pour l’acquisition au début de l’expérience où aucune impulsion n’est appliquée, renommer en utilisant l’expression 000Vcm. Un exemple des noms d’enregistrement time-lapse : 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm, etc.
3. Ouvrez l’application, qui peut être téléchargée à partir de
   https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Cliquez sur Sélectionner le dossier de données pour choisir le dossier contenant les enregistrements en accéléré d’une expérience.
4. Sélectionnez les pixels à utiliser pour une analyse plus approfondie des données. Pour ce faire, utilisez deux curseurs pour déterminer le seuil bas pour une image claire des membranes (en violet) et le seuil haut pour l’élimination des débris (gros points à forte fluorescence) de l’analyse (en vert).
5. Sélectionnez Analyser les données. Dans l’onglet Analyse, une table avec les paramètres extraits s’affiche. Sur le côté droit du tableau, des graphiques de fluorescence relative dans le temps apparaissent pour chaque E utilisé. Sélectionnez les graphiques d’un E donné dans le menu déroulant situé sur le côté gauche au-dessus du tableau.
6. Examinez tous les graphiques et effectuez une correction manuelle en cas de détection de faux pics. Sélectionnez Effacer les pics AUTO en bas de l’onglet Analyse et les pics détectés automatiquement sont effacés. Cliquez sur le graphique pour déterminer manuellement un nouveau point de pointe.
7. Sélectionnez Réexécuter la détection de pic AUTO en bas de l’onglet Analyse pour effectuer à nouveau la détection automatique de pic. Les paramètres extraits seront maintenant ajustés au nouveau pic.
8. Sélectionnez Exporter les données en bas à droite dans l’onglet Analyse pour exporter les données vers le même dossier sous la forme d’un fichier .mat, d’un fichier tableur et d’images PNG pour chaque E utilisé.

Results

Les modifications du TMV dans les cellules excitables in vitro déclenchées par des impulsions électriques peuvent être surveillées optiquement avec ce protocole, et les signaux de fluorescence peuvent être analysés pour extraire leurs paramètres pertinents.

Le dispositif expérimental est illustré à la figure 1A. La figure 1B illustre un signal typique d’impulsion électrique de 100 μs utilisé dans les expériences. Les cellules des chambres qui sont placées sous le microscope ressemblent généralement aux cellules de la figure 1C (image en fond clair) et de la figure 1D (image en fluorescence). Nous réalisons une expérience où toutes les 2 minutes, une impulsion électrique avec une tension croissante est appliquée aux mêmes cellules. Notez que le temps d’interimpulsion de 2 minutes peut ne pas être suffisamment long pour permettre une refermeture complète et une récupération des membranes cellulaires, en particulier lors de l’utilisation d’impulsions de la plus grande amplitude, qui sont associées à une électroporation proéminente. Ainsi, on peut s’attendre à certains effets cumulatifs des impulsions. Pour éviter ces effets cumulatifs, le retard entre les impulsions peut être prolongé, mais au prix d’une réduction du nombre d’amplitudes d’impulsion testées et d’éviter de garder les cellules sur le microscope trop longtemps.

Après avoir capturé des images de fluorescence dans le cadre d’expériences, analysez-les avec l’application MATLAB personnalisée. Tout d’abord, déterminez les seuils de pixels (Figure 2A) ; En ajustant le seuil bas, on obtient une image claire des membranes autour des cellules (en violet), et en ajustant le seuil haut, on supprime le signal de débris (vert). L’application détermine ensuite l’intensité de fluorescence moyenne de tous les pixels de seuil pour chaque impulsion consécutive délivrée afin d’obtenir un signal dépendant du temps de la variation relative de la fluorescence F/F0. Ce signal est corrigé pour le photoblanchiment par colorant en soustrayant la pente de la diminution linéaire de F déterminée à partir de l’enregistrement time-lapse de contrôle dans lequel aucune impulsion n’a été appliquée (Figure 2B). Après avoir corrigé le signal, les paramètres des réponses sont extraits sous la forme d’un tableau intégré à l’application et d’un graphique du signal de fluorescence corrigé (Figure 2C). Dans de rares cas, l’algorithme ne détecte pas un pic évident ou détecte les signaux de bruit parasites comme des faux positifs. Dans ces cas, l’utilisateur a la possibilité de sélectionner manuellement le point correspondant dans le signal de fluorescence en tant que pic ou de supprimer le faux pic détecté (Figure 2D-suppression d’un petit pic détecté de manière anormale avant l’application de l’impulsion électrique).

En utilisant l’application MATLAB, nous pouvons obtenir des images des réponses TMV aux impulsions électriques dans les cellules S-HEK excitables (Figure 3A) et NS-HEK non excitables (Figure 3B). Les paramètres de réponse suivants sont extraits (Tableau 1) : nombre de pics (NoPeaks), temps moyen de crête à crête (lorsque plus d’un pic est détecté, MPPT), réponse maximale (MR), temps jusqu’au premier pic (TtFP) et temps entre le pic et 25 %, 50 %, 75 % et 90 % de récupération (T25, T50, T75, T90, respectivement). Ces paramètres permettent d’évaluer les réponses à différentes impulsions électriques (par exemple, déterminer le nombre de pics déclenchés par des impulsions électriques de différents E, figure 3C) et l’interaction entre l’excitation et l’électroporation.

Figure 1 : La configuration, la forme d’onde et les cellules S-HEK. (A) L’image de la chambre sur la platine du microscope. (B) Exemple de la forme d’onde d’une impulsion utilisée dans l’étude (tension (U) dans le temps). (C, D) L’image des cellules S-HEK ((C) : fond clair, (D) : fluorescence), barre d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Application d’analyse de données. (A) L’image de l’interface d’application - seuillage. (B) Le graphique du signal brut et corrigé de changement de fluorescence. (C) L’image de l’interface de l’application - les données extraites. (D) Correction manuelle de la détection de crête (suppression d’un petit pic qui avait été détecté de manière anormale avant l’application de l’impulsion électrique, marqué d’une flèche rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résultats représentatifs. (A, B) Déclenchement de modifications de la TMV dans (A) le S-HEK excitable et (B) le NS-HEK non excitable avec des impulsions électriques de 100 μs d’amplitudes différentes, résultats d’expériences représentatives. Par souci de clarté, seules les réponses aux impulsions sélectionnées dans la séquence d’impulsions appliquée sont affichées. (C) Les paramètres des réponses TMV déclenchées par les impulsions de 100 μs de différentes amplitudes : l’exemple montre le nombre de pics. Les résultats sont exprimés en moyenne ± ET, nombre d’expériences : N = 13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Index	Force E (V/cm)	Pas de pics (-)	MPPT (Mme)	MONSIEUR (-)	TtFP (Mme)	T25 (Mme)	T50 (Mme)	T75 (Mme)	T90 (Mme)
1	0
2	126	9	224	0.104	360	72	108	144	180
3	150	6	354	0.097	108	72	108	144	180
4	176	2	144	0.089	36	72	108	144	180
5	200	1		0.075	0	108	144	180	252
6	250	2	396	0.064	0	108	216	432	2052
7	300	1		0.059	0	180	1188	2448
8	350	1		0.053	0	1008	2340
9	400	1		0.047	0	1512

Tableau 1 : Paramètres des réponses TMV déclenchées par les impulsions de 100 μs de différentes amplitudes.

Discussion

Les cellules S-HEK sont un modèle cellulaire excitable simple avec des canaux sodiques et potassiques bien définis, Na_V1,5 et K_ir2,1⁹. Cela nous permet d’effectuer des études approfondies sur la façon dont les cellules excitables réagissent aux impulsions électriques appliquées et de relier les données expérimentales avec des modèles mathématiques basés sur les caractéristiques théoriques bien connues des canaux exprimés dans les cellules S-HEK. Dans notre étude précédente⁸, nous avons décrit les réponses de ces cellules à des impulsions de 100 μs d’augmentation de E à la fois expérimentalement et théoriquement. À E inférieur, les cellules S-HEK répondent avec des potentiels d’action simples ou multiples, tandis qu’à E supérieur, les AP deviennent prolongés et se transforment en une dépolarisation soutenue. Comme la dépolarisation soutenue est clairement visible également dans une version non excitable de ces cellules (NS-HEK), elle est attribuée à l’électroporation et à l’augmentation associée du courant ionique non sélectif.

L’utilisation du colorant potentiométrique fluorescent s’est avérée être un moyen très efficace d’étudier les PA et l’électroporation dans les cellules excitables. Par rapport aux méthodes électrophysiologiques classiques, telles que le patch clamp, les mesures optiques sont beaucoup plus pratiques, rapides et ne nécessitent pas de compétences techniques particulières. De plus, l’utilisation d’impulsions électriques à haute tension n’interfère pas avec les mesures, ce qui peut devenir un problème dans les mesures de patch^{clamp 12}. Cependant, les principaux inconvénients de ce protocole sont liés à la nature du colorant. En raison de son photoblanchiment, le signal de fluorescence capturé doit être corrigé. Le colorant se diffuse spontanément dans la cellule, de sorte que le signal des membranes diminue avec le temps. Pour cette raison, le colorant est adapté à la surveillance des potentiels d’action et d’autres changements à court terme du TMV (~3 s dans ces expériences). Étant donné que le colorant permet l’imagerie ratiométrique¹³, une telle imagerie pourrait éviter certains problèmes de diffusion du colorant, mais au détriment d’une vitesse d’imagerie plus faible possible. Dans cette configuration expérimentale, l’imagerie ratiométrique serait trop lente pour capturer correctement la forme des potentiels d’action. De plus, les changements mesurés dans la fluorescence du colorant fournissent des informations qualitatives sur le changement du TMV ; Néanmoins, le colorant peut être calibré pour permettre des mesures quantitatives.

L’analyse automatisée des images à l’aide d’une application MATLAB personnalisée nous permet d’analyser une grande quantité de données et d’extraire efficacement des caractéristiques précieuses des réponses TMV dans un court laps de temps. L’application est configurée pour capturer le signal de fluorescence des membranes de toutes les cellules dans le champ de vision. Cela améliore le rapport signal/bruit, mais au prix de la perte d’informations sur la façon dont le TMV change au niveau de la cellule individuelle. Dans la configuration expérimentale donnée, le signal des cellules individuelles était trop bruyant pour permettre des mesures utiles. De plus, les membranes des cellules adjacentes étaient difficiles à distinguer. Néanmoins, les cellules HEK expriment de manière endogène des jonctions lacunaires par lesquelles elles sont connectées électriquement. La modélisation mathématique, présentée dans l’étude précédente⁸, a démontré qu’en raison de leurs connexions électriques, les cellules dans le champ de vision sont suffisamment proches pour déclencher simultanément l’AP. De plus, l’AP se propage le long de la monocouche cellulaire à grande vitesse (environ 34 mm/s, estimée sur la base de l’imagerie à un grossissement d’objectif de 5x)^8,9. Compte tenu de la longueur latérale du champ de vision (~0,33 mm), l’AP parcourrait cette longueur en environ 10 ms, ce qui est plus court que notre période d’acquisition d’image. Ainsi, l’effet de propagation du point d’accès ne peut pas être vu avec ce grossissement et cette vitesse d’enregistrement. Néanmoins, la propagation du PA des électrodes vers le champ de vision peut provoquer un retard entre l’impulsion appliquée et le PA⁸ capturé.

Dans l’étude précédente⁸, ainsi que dans cette publication, les effets d’impulsions d’une durée de 100 μs sur l’interaction entre l’excitabilité et l’électroporation sont décrits. Cependant, ce protocole peut être adapté pour étudier des impulsions électriques avec d’autres paramètres (de durée, de tension, de nombre, de taux de répétition ou de forme différents) ou d’autres cellules excitables.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube de 1,5 mL	Ratiolab  ;	5615000
2 puits Nunc Lab-Tek II chambré #1.5 Système de verre de protection allemand	Thermo Fisher Scientific  ;
ADP305 Sonde de tension différentielle	Teledyne LeCroy
AP015 Sonde de courant	Teledyne LeCroy
Blasticidine  ;	Thermo Fisher Scientific  ;
incubateur à CO2	PHCbi  ;	MCO -230AICUV
Doxycycline  ;	Sigma-Aldrich/Merck	D9891
Dulbecco' s Modifed Eagle » s Milieu de croissance du glucose moyennement élevé	Sigma-Aldrich/Merck	D5671
ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)Sondes	potentiométriques	31795
Sérum fœtal bovin	Sigma-Aldrich/Merck	F2442
Geneticin	Thermo Fisher Scientific  ;
Glutamine	Sigma-Aldrich/Merck	G7513
Hotte à flux laminaire	Iskra Pio  ;	MC 15-2
MATLAB	Mathworks
Pénicilline&ndash ; streptomycine	Sigma-Aldrich/Merck	P07681
Poly-L-lysine bromhydrate  ;	Sigma-Aldrich/Merck	P9155-5MG  ;   ;
Générateur d’impulsions  ;	Sur		voir référence11
Puromycin	Thermo Fisher Scientific  ;
T25 25cm² ; Fiole de culture tissulaire	TPP  ;	90026
Tet-on Spiking HEK	cells American Type Culture Collection ATCC	CRL-3479
Thunder Imager Système de cellules vivantes pour la microscopie à fluorescence	Leica Microsystems  ;
Solution trypsine-EDTA	Sigma-Aldrich/Merck	T3924
WavePro 7300A Oscilloscope	Teledyne LeCroy