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Article de méthode

Un protocole pour les cultures d’explants de gliomes diffus de bas grade avec mutation IDH1

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DOI :

10.3791/67260

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9 mai 2025

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1Institut de Génomique Fonctionnelle, Université de Montpellier, CNRS, INSERM, 2Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University of Chongqing, 3Department of Neurosurgery, Gui de Chauliac Hospital, Montpellier University Medical Center, 4Jingfeng laboratories of Chongqing

Dans cet article

Résumé

Les gliomes diffus de bas grade avec mutation IDH1 sont des tumeurs rares difficiles à cultiver. Nous introduisons une méthode d’explant simple et non enzymatique qui préserve l’expression de la protéine mutante IDH1 et maintient les cultures pendant des mois. Il est important de noter que cette technique fonctionne avec des tumeurs cryoconservées, offrant une ressource précieuse pour la recherche sur les gliomes.

Résumé

Les gliomes diffus, les tumeurs cérébrales primaires les plus répandues, sont classés en grades bas et élevés en fonction de critères histopathologiques et de mutations génétiques. Les gliomes diffus de bas grade constituent un sous-ensemble, affectant principalement les jeunes adultes et prédisposant aux gliomes de haut grade. Il existe deux principaux types de gliomes diffus de bas grade : les astrocytomes et les oligodendrogliomes, chacun défini par des caractéristiques génétiques et histologiques distinctes. Ces tumeurs présentent de manière caractéristique une variante mutée de l’enzyme métabolique IDH1, perturbant la différenciation cellulaire. Elles sont hétérogènes, comprenant à la fois des cellules souches prolifératives et des cellules gliales quiescentes plus différenciées.

Les modèles de tumeurs in vitro spécifiques au patient présentent un potentiel important pour démêler les mécanismes oncogéniques et adapter la sélection des médicaments pour une thérapie personnalisée. Cependant, l’absence de modèles in vitro fiables spécifiques aux gliomes de bas grade avec mutation IDH1 a entravé la recherche fondamentale et translationnelle. Ici, nous présentons une méthode simple pour cultiver des tumeurs mutantes IDH1 sous forme d’explants dans des milieux définis sans avoir besoin de dissociation enzymatique. Ces explants peuvent être maintenus pendant de longues périodes, en maintenant l’expression de la protéine mutante IDH1 ainsi que des marqueurs pour les cellules progénitrices des oligodendrocytes telles que ASCL1 (MASH1), OLIG1 et OLIG2 et pour les astrocytes (GFAP, SOX9). Ils peuvent également être établis à partir de tumeurs congelées dans le DMSO. Ces cultures peuvent servir de plate-forme précieuse pour le criblage de médicaments, la vidéomicroscopie et les études génétiques, facilitant ainsi les progrès dans la compréhension et le traitement de ces tumeurs difficiles. Ils offrent également la possibilité de dériver des lignées cellulaires mutantes IDH1.

Introduction

Les gliomes diffus sont les tumeurs cérébrales primaires les plus fréquentes. Ces tumeurs sont aujourd’hui incurables malgré des traitements très intenses (chirurgie, radio, chimiothérapie)1. De plus en plus de preuves soutiennent l’hypothèse selon laquelle la gliomagenèse provient de cellules souches adultes ou de cellules progénitrices gliales résidant dans le cerveau2. Bien que les glioblastomes représentent le type le plus agressif, les gliomes diffus de bas grade (DLGG, tumeurs de grade 2) sont également prévalents (15 % des gliomes diffus)1,3. Les DLGG se développent lentement et migrent le long des faisceaux de substance blanche, une caractéristique de ce néoplasme « diffus »4. Ces DLGG récidivent très souvent malgré le traitement, évoluant finalement vers des tumeurs malignes de haut grade (grades 3 et 4)5.

DLGG sont caractérisés par une mutation faux-sens du gène de l’isocitrate déshydrogénase 1 ou 2 (IDH1 ou IDH2), entraînant la production aberrante de l’oncométabolite 2-hydroxyglutarate (2HG). Cela perturbe la différenciation cellulaire par des déréglementations épigénétiques6. Les gliomes avec mutation IDH1 sont ensuite classés en sous-types : les astrocytomes présentent généralement des mutations dans ATRX et P53, tandis que les oligodendrogliomes sont caractérisés par des délétions 1p19q7. Ces tumeurs présentent une hétérogénéité des cellules tumorales. Le séquençage de l’ARN unicellulaire et l’immunocaractérisation ont révélé une population diversifiée de cellules tumorales, présentant des phénotypes de type cellules souches, de type astrocytes et de type oligodendrocytes au sein de ces tumeurs8,9.

Contrairement au glioblastome, qui bénéficie de cultures et de lignées cellulaires à long terme facilement disponibles, il existe une pénurie notable d’outils cellulaires adaptés à l’étude des tumeurs mutantes IDH11. Cela représente un obstacle important à l’avancement du développement thérapeutique et à l’approfondissement de notre compréhension de la gliomagenèse avec mutation IDH1 et de la progression de la maladie. Les lignées cellulaires traditionnelles cultivées au sérum, bien qu’utilisées depuis longtemps, répliquent de manière inadéquate les tumeurs d’origine, présentant des profils transcriptionnels altérés. Alternativement, les conditions de culture sans sérum, que ce soit dans des modèles tumoroïdes 2D ou 3D, préservent plus efficacement les profils transcriptionnels des cellules tumorales et leurs phénotypes in vivo, tels que l’invasion dans le tissu cérébral normal10,11.

De plus, les cultures cellulaires à court terme dérivées de l'échantillon chirurgical d'un patient préservent le profil moléculaire et la diversité cellulaire de la tumeur, représentant ainsi mieux les traits biologiques des tumeurs par rapport aux lignées cellulaires12. Dans cet article, nous présentons une méthode non enzymatique simple pour la culture de cultures de gliomes diffus de bas grade avec mutation IDH1 sous forme d’explants dérivés de résections de patients frais ou congelés, dans le but de répondre au besoin de modèles in vitro améliorés pour la recherche sur les gliomes et le développement thérapeutique. Ils offrent également la possibilité de dériver des lignées cellulaires mutantes IDH1.

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Protocole

Les fragments de tumeur utilisés dans ce protocole ont été obtenus à partir d'une collection bien caractérisée et approuvée sur le plan éthique, avec le consentement des patients. Cette recherche a été menée dans le cadre du projet intitulé Gliomacult : Caractérisation et cultures primaires de gliomes de bas grade (numéro de projet RECH/P722/1-5) et a été approuvée par le conseil scientifique de la biobanque de tumeurs le 28 août 2023.

1. Préparation des boîtes de culture

REMARQUE : Effectuer ces étapes sous une hotte à flux laminaire stérile pour culture de tissus.

  1. Au moins 1 h avant la culture, préparez des plaques de 24 puits revêtues de poly-D-lysine (PDL) et de laminine.
    1. Diluez 10 mg de poudre de PDL dans 100 mL de tampon borate (pH 8,4) pour obtenir une concentration finale de 100 µg/mL. Une fois dissous, filtrez la solution (0,22 µm) pour assurer la stérilité. Le PDL est alors prêt à l'emploi ; préparez des aliquotes de 3 mL et conservez-les à -20 °C.
    2. Décongelez le tube de laminine à 1-2 mg/mL à 4 °C pour éviter la formation de gel. Préparez des aliquotes de 50 µL et conservez-les à -20 °C.
      NOTE : Il convient d'éviter les cycles répétés de décongélation et de congélation.
    3. Revêtement des puits
      1. Étape facultative : placez des lamelles stériles de Ø 13 mm, adaptées aux boîtes de culture cellulaire, dans une plaque de 24 puits, une lamelle par puits.
        NOTE : Cette étape est destinée à une immunomarquage ultérieur des explants de gliome.
      2. Pour le revêtement des puits, mélangez 3 mL de solution de PDL avec 9 mL de PBS 1x et ajoutez 50 µL de laminine. Ajoutez 500 µL de cette solution par puits afin d'obtenir une concentration de revêtement de 1-2 µg/cm². Incubez les plaques revêtues à température ambiante, de préférence avec un mouvement lent de basculement (15 tr/min), pendant au moins 1 h.
      3. Juste avant la culture, retirez la solution de PDL-laminine et rincez deux fois avec du PBS 1x stérile.
        NOTE : N'attendez pas que les puits s'assèchent.

2. Milieu de culture

  1. Incuber des explants porteurs d'une mutation IDH1 dans un milieu défini composé de DMEM/F12 supplémenté en L-glutamine, ainsi qu'un mélange de remplacement du sérum constitué de N2 et de B27 sans vitamine A. Utiliser des antibiotiques, notamment la ciprofloxacine, la gentamicine et la fungine, afin de prévenir les contaminations bactériennes et fongiques. En outre, ajouter au milieu des facteurs de croissance tels que l'héparine, l'EGF et le FGF2, filtrer le milieu (0,2 µm) et le conserver jusqu'à 2 semaines à 4 °C.
    REMARQUE : Pour plus de détails sur les composants du milieu et leur préparation, consulter le Tableau 1 et le Tableau des matériaux.

3. Préparation des explants

  1. Avant le traitement des échantillons, préparez le poste de travail et les outils stériles comme illustré dans Figure 1A. Désinfecter une poche froide en la pulvérisant avec de l'éthanol à 70 %. Stériliser les ciseaux et la pince en les immergeant dans de l'éthanol à 70 %, puis en les rinçant avec du PBS.
  2. Transférez rapidement la pièce de résection tumorale pour la culture sur de la glace, idéalement dans les 2 heures suivant l'exérèse chirurgicale (Figure 1B).
    REMARQUE : L'échantillon tumoral doit avoir un diamètre minimum de 9 à 10 mm afin d'assurer de meilleurs résultats. Le tissu est transporté sans milieu de culture, car cette méthode est préférée à des fins histologiques. L'absence de liquide empêche la formation de cristaux de glace lors de la congélation rapide, préservant ainsi l'intégrité du tissu pour d'éventuelles examens histologiques ultérieurs.
  3. Placer la boîte de culture contenant l'échantillon tumoral sur le pack réfrigérant et rincer délicatement avec du PBS 1X pour éliminer l'excès de sang.
  4. La tumeur réséquée présente souvent une taille importante et une hétérogénéité marquée, composée de masse tumorale, de tissu infiltré et de composants non tumoraux (Figure 1C). Sélectionner les portions présentant une couleur grise et une texture molle ou proche de celle d’un gel pour l’isolement des cellules tumorales, car elles contiennent généralement davantage de cellules tumorales. À l’inverse, éviter les régions dures et blanches, qui pourraient contenir moins de cellules tumorales adaptées à la culture (Figure 1D), ainsi que les zones noircies, car elles sont probablement dues à l'électrocoagulation et pourraient ne pas fournir de résultats fiables pour l'analyse.
  5. Transférer les échantillons sélectionnés dans un microtube ou une cryovial de 1,5 mL pour la fragmentation. Ajouter 1 mL de milieu stérile dans le microtube de 1,5 mL ou la cryovial et hacher l'échantillon avec des ciseaux stériles jusqu'à l'obtention de petits morceaux (1-2 mm).3sont obtenus.
    REMARQUE : Environ 1 à 2 minutes de hachage sont nécessaires pour obtenir de petits fragments, généralement de 1 à 2 mm3 en taille (Figure 1E).
  6. Avec des ciseaux stériles, couper soigneusement l'extrémité d'un bleu 1,000 µL embout de pipette pour créer une ouverture large, d'environ 3 à 4 mm de diamètre. À l'aide de cet embout modifié, pipeter 50-200 µL des fragments de tissu hachés et les répartir uniformément dans chaque puits. Étant donné que les morceaux plus petits ont tendance à sédimenter rapidement, homogénéiser délicatement la suspension dans chaque puits afin d'assurer une distribution uniforme.
    REMARQUE : Éviter la surpopulation et maintenir un équilibre en ne mettant pas un nombre excessif de fragments dans chaque puitsFigure 1F).
  7. Incuber les fragments de tumeur à 37°C dans une étuve à 5 % de CO2 avec une humidité de 100 %. Changer le milieu tous les jours si l'activité métabolique de la tumeur (indiquée par un jaunissement rapide du milieu) et le nombre de fragments dans chaque puits le nécessitent. Lors des changements de milieu, manipuler avec précaution en aspirant délicatement le milieu à l'aide d'une pipette équipée d'une 200 µL pointe, en veillant à ne pas perturber les fragments de tumeur adhérents.

Procédure de préparation du tissu tumoral ; configuration du matériel ; échantillons de tissu ; résultats de la centrifugation ; tableau d'analyse.
Figure 1 : Procédure de culture d'explant tumoral. Une résection de gliome diffus de bas grade a été obtenue chez un patient de 44 ans diagnostiqué avec un astrocytome de grade II selon la classification OMS 2021. La tumeur présentait une mutation du gène IDH1 (exon 4 c.395 G>A, p.Arg132His) et une mutation du gène TP53 (exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), ainsi qu'une absence de coloration pour ATRX. Aucune mutation n'a été détectée au niveau des sites de liaison Ets/TCF (C250T et C228T) du gène TERT. (A) La surface de travail comprend un refroidisseur réfrigérant, qui fournit un environnement minimisant la dégradation de l'échantillon et préservant la viabilité des composants biologiques. Ces précautions sont essentielles pour maintenir la qualité et l'intégrité du tissu. (B) Le transport de l'échantillon de l'hôpital au laboratoire doit s'effectuer sur de la glace. (C) Fragment de résection tumorale. Les flèches indiquent les parties les plus appropriées pour la culture. (D) La dissection de la tumeur permet de sélectionner la partie la plus pertinente à hacher. Selon notre expérience, la substance blanche a généralement moins de chances de produire des explants viables. (E) Fragments tumoraux d'environ 1-2 mm³ de diamètre dans un tube de 15 mL après hachage mécanique à l’aide de ciseaux. (F) Nombre de fragments tumoraux nécessaires pour un semis adéquat, illustré pour les puits d'une plaque 24 puits. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

4. Cryoconservation et décongélation du tissu tumoral haché

REMARQUE : La cryoconservation permet de disposer d'un double en cas de contamination ou de perte de cultures d'explants, ou pour traiter ultérieurement les échantillons tumoraux.

  1. Cryopréservation : Préparer le milieu de congélation (solution de DMSO à 20 % v/v) en ajoutant 2 mL de DMSO à 8 mL de milieu de culture cellulaire.
  2. Combiner un volume de la suspension de tumeur hachée avec un volume égal de milieu de congélation à 20 % de DMSO afin d'obtenir une concentration finale de 10 % de DMSO. Pipeter soigneusement le mélange plusieurs fois afin d'assurer un mélange homogène, puis distribuer environ 1 mL dans des cryotubes.
  3. Transférer rapidement les cryotubes dans un conteneur cryogénique permettant une réduction progressive de la température, puis incuber toute la nuit à -80 °C avant le stockage définitif dans l'azote liquide.
    NOTE : Cette étape doit être réalisée immédiatement après que les cellules aient été mises dans le milieu de congélation, car certains cryoprotecteurs, comme le DMSO, peuvent être nocifs si les cellules y sont exposées à température ambiante plus longtemps que nécessaire.
  4. Décongélation : Retirer les cryotubes de l'azote liquide et les placer immédiatement dans un bain-marie à 37 °C jusqu'à ce qu'environ 80 % des cellules soient décongelées.
  5. Pour éliminer le DMSO, pipeter rapidement la suspension dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de PBS 1x préchauffé et centrifuger à 300 × g pendant 5 min.
  6. Éliminer le surnageant et répéter le lavage avec du PBS 1X suivi d'une centrifugation (étape 4.5). Aspirer le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot, puis ajouter la quantité appropriée de milieu pour transférer les cellules dans une plaque pré-enrobée PDL-Laminine à 24 puits et placer dans l'incubateur.
  7. Après 24 h, vérifier que les cellules se sont bien fixées. Après quelques jours, éliminer les fragments non adhérents en renouvelant le milieu de culture.

5. Passage de la culture

REMARQUE : Une fois établis, les explants peuvent être utilisés pour la vidéomicroscopie ou l'immunomarquage. Sinon, si des cellules tumorales ont migré hors de l'explant et apparaissent saines, l'explant peut être repiqué par dissociation enzymatique et resemé dans des puits pour des expérimentations supplémentaires. Toutefois, il est important de noter que ce protocole n'est pas conçu pour des repiquages répétés. En général, un seul repiquage peut être tenté avant que les cellules tumorales n'entrent en sénescence ou ne meurent. Toutes les cultures d'explants ne conduisent pas à un repiquage réussi.

  1. Pour le repiquage, retirez le milieu ancien, rincez avec du PBS 1X, puis ajoutez (125 µL) de trypsine-EDTA 0,05 % dans les puits et incubez 3 à 4 min à 37 °C, puis ajoutez 6,5 µL d'inhibiteur de la trypsine, 12 µL de CaCl2 20 mM (dilution finale à 2 mM) et 1 µL de DNase I.
    REMARQUE : Le temps d'incubation nécessaire à la dissociation peut varier selon la culture. Il est important de vérifier si les cellules se sont détachées après au moins 3 min. En général, l'explant n'est pas complètement dissocié en une suspension monocellulaire, et de petits agrégats persistent souvent, pouvant donner naissance à de nouvelles cultures d'explant.
  2. À l’aide d’une pipette P1000 réglée sur 500-600 µL, rincez doucement pour désagréger les explants. Évitez la formation de bulles.
  3. Ajoutez 5 mL de PBS 1X et centrifugez 5 min à 300 × g. Aspirez le surnageant, resuspendez le culot dans du milieu frais préchauffé et effectuez un décompte pour la mise en culture.
  4. Identifiez les cultures capables de générer des lignées cellulaires en observant les cellules en division au microscope à contraste de phase. Ces cellules en division présentent généralement une morphologie arrondie et des chromosomes visibles, comme illustré dans la Figure 2A.

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Résultats

Après quelques jours, certains fragments tumoraux adhèrent aux parois des puits, entraînant l'expansion cellulaire à partir des explants. Le délai entre le semis initial et l'apparition de cellules tumorales en prolifération varie selon les échantillons. Les cultures initiales contiennent souvent une quantité importante de débris cellulaires, rendant difficile l'évaluation de la présence de cellules viables. Par conséquent, la culture doit être maintenue pendant un minimum de 4 semaines. Une fois que les cellules commenc...

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Discussion

La mise au point de modèles in vitro et précliniques pour les gliomes de bas grade porteurs d'une mutation IDH1 est particulièrement difficile en raison de la croissance lente de ces tumeurs et de la complexité liée à la reproduction des nombreuses altérations génomiques et épigénomiques provoquées par la mutation IDH. De plus, ces cellules tumorales infiltrantes interagissent activement avec les cellules environnantes, notamment les cellules immunitaires, endothéliales, gliales et neuronales, et pourraient dépendre de c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Les fragments tumoraux utilisés ici font partie de la collection NEUROLOGY d’échantillons de tissus frais conservée par le Centre de Ressources Biologiques du CHU de Montpellier (CRB@chu-montpellier.fr). Cette recherche a été menée dans le cadre du projet intitulé « Gliomacult : Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas », dirigé par le Prof. J. P. Hugnot (Project No. RECH/P722/1-5). Ce travail a été soutenu par La ligue contre le cancer, l'ARC (Association pour la Recherche sur le Cancer), l'ARTC, L'ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, la Région Occitanie, l'INCA. K.A.C est soutenu par le Conseil national des sciences humaines et techniques (CONAHCYT), Mexique, et l’Association pour la recherche sur les tumeurs cérébrales (ARTC), France.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti-ASCL1BD Pharmingen&trade ;556604Dilution 1:500
Anti-ATRXSigma-AldrichHPA001906Dilution 1:100
Anti-CD68AgilentM081401-2Dilution 1:500
Anti-GFAPAves LabsAB_2313547Dilution 1:500
Anti-IBA1 FujifilmWako Anticorps019-19741Dilituion 1:1000
Anti-IDH1 (R132H) souris Anticorps monoclonalDianovaDIA-H09
Anti-Ki67BD Pharmingen&trade ;556003Dilituion 1:1000
Anti-OLIG1R& D Systems® ;AF2417Dulituion 1:300
Anti-OLIG2Sigma-AldrichMABN50Dilution 1:250
Anti-SOX9Abcam® ;EPR14335-78Dilution 1:100
B-27 Supplément (50x), moins vitamine AThermo Fisher Scientific12587010
Albumine sérique bovine (BSA)CiteAbA-421-100
Ciprofloxacine HClSigma-AldrichPHR1044-1G
CoolCellCorning® ;432000Conteneur de congélation de cellules, pour 12 flacons cryogéniques de 1 mL ou 2 mL
Couvercle et Oslash ;, 13 mmKarl Hecht&trade ; Assistent&trade ;
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD8418
DMEM/F-12, sans glutamineThermo Fisher Scientific21331020
DNAse ISigma-Aldrich10104159001
Dulbecco&prime ; s Saline tamponnée au phosphate (PBS) 1xSigma-AldrichD8537
Falcon 100 mm TC-treated TC-Culture DishCorning® ;
Falcon 24 puits à fond plat transparentCorning® ;353047Plaque de culture cellulaire multipuits traitée TC, avec couvercle, stérile
FunginInvivoGenant-fn-1
GentamicineThermo Fisher Scientific15750-037
HéparineSigma-AldrichH3149-100KU
HEPESSigma-AldrichH-3375
Humain EGFPeproTechAF-100-15-1MG
Humain FGF-basicPeproTech100-18B-1MG
LamininSigma-AldrichL2020
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030-024
N-2 Supplément (100x )Thermo Fisher Scientific17502-048
PDLSigma-AldrichP7886
Acrodisque sérique 37 mm filtre seringue avec GF/0.2 µ ; m SuporPALL Corporation4525
Inhibiteur de la trypsineThermo Fisher Scientific17075-029
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénolThermo Fisher Scientific25300054
Microscope Zeiss Z1 Apotome 3 Microscopeà épifluorescence droit à grand champZeiss
328017353003

Références

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