Un protocole pour les cultures d’explants de gliomes diffus de bas grade avec mutation IDH1

Résumé

Les gliomes diffus de bas grade avec mutation IDH1 sont des tumeurs rares difficiles à cultiver. Nous introduisons une méthode d’explant simple et non enzymatique qui préserve l’expression de la protéine mutante IDH1 et maintient les cultures pendant des mois. Il est important de noter que cette technique fonctionne avec des tumeurs cryoconservées, offrant une ressource précieuse pour la recherche sur les gliomes.

Résumé

Les gliomes diffus, les tumeurs cérébrales primaires les plus répandues, sont classés en grades bas et élevés en fonction de critères histopathologiques et de mutations génétiques. Les gliomes diffus de bas grade constituent un sous-ensemble, affectant principalement les jeunes adultes et prédisposant aux gliomes de haut grade. Il existe deux principaux types de gliomes diffus de bas grade : les astrocytomes et les oligodendrogliomes, chacun défini par des caractéristiques génétiques et histologiques distinctes. Ces tumeurs présentent de manière caractéristique une variante mutée de l’enzyme métabolique IDH1, perturbant la différenciation cellulaire. Elles sont hétérogènes, comprenant à la fois des cellules souches prolifératives et des cellules gliales quiescentes plus différenciées.

Les modèles de tumeurs in vitro spécifiques au patient présentent un potentiel important pour démêler les mécanismes oncogéniques et adapter la sélection des médicaments pour une thérapie personnalisée. Cependant, l’absence de modèles in vitro fiables spécifiques aux gliomes de bas grade avec mutation IDH1 a entravé la recherche fondamentale et translationnelle. Ici, nous présentons une méthode simple pour cultiver des tumeurs mutantes IDH1 sous forme d’explants dans des milieux définis sans avoir besoin de dissociation enzymatique. Ces explants peuvent être maintenus pendant de longues périodes, en maintenant l’expression de la protéine mutante IDH1 ainsi que des marqueurs pour les cellules progénitrices des oligodendrocytes telles que ASCL1 (MASH1), OLIG1 et OLIG2 et pour les astrocytes (GFAP, SOX9). Ils peuvent également être établis à partir de tumeurs congelées dans le DMSO. Ces cultures peuvent servir de plate-forme précieuse pour le criblage de médicaments, la vidéomicroscopie et les études génétiques, facilitant ainsi les progrès dans la compréhension et le traitement de ces tumeurs difficiles. Ils offrent également la possibilité de dériver des lignées cellulaires mutantes IDH1.

Introduction

Les gliomes diffus sont les tumeurs cérébrales primaires les plus fréquentes. Ces tumeurs sont aujourd’hui incurables malgré des traitements très intenses (chirurgie, radio, chimiothérapie)¹. De plus en plus de preuves soutiennent l’hypothèse selon laquelle la gliomagenèse provient de cellules souches adultes ou de cellules progénitrices gliales résidant dans le cerveau². Bien que les glioblastomes représentent le type le plus agressif, les gliomes diffus de bas grade (DLGG, tumeurs de grade 2) sont également prévalents (15 % des gliomes diffus)^1,3. Les DLGG se développent lentement et migrent le long des faisceaux de substance blanche, une caractéristique de ce néoplasme « diffus »⁴. Ces DLGG récidivent très souvent malgré le traitement, évoluant finalement vers des tumeurs malignes de haut grade (grades 3 et 4)⁵.

DLGG sont caractérisés par une mutation faux-sens du gène de l’isocitrate déshydrogénase 1 ou 2 (IDH1 ou IDH2), entraînant la production aberrante de l’oncométabolite 2-hydroxyglutarate (2HG). Cela perturbe la différenciation cellulaire par des déréglementations épigénétiques⁶. Les gliomes avec mutation IDH1 sont ensuite classés en sous-types : les astrocytomes présentent généralement des mutations dans ATRX et P53, tandis que les oligodendrogliomes sont caractérisés par des délétions 1p19q⁷. Ces tumeurs présentent une hétérogénéité des cellules tumorales. Le séquençage de l’ARN unicellulaire et l’immunocaractérisation ont révélé une population diversifiée de cellules tumorales, présentant des phénotypes de type cellules souches, de type astrocytes et de type oligodendrocytes au sein de ces tumeurs^8,9.

Contrairement au glioblastome, qui bénéficie de cultures et de lignées cellulaires à long terme facilement disponibles, il existe une pénurie notable d’outils cellulaires adaptés à l’étude des tumeurs mutantes IDH1¹. Cela représente un obstacle important à l’avancement du développement thérapeutique et à l’approfondissement de notre compréhension de la gliomagenèse avec mutation IDH1 et de la progression de la maladie. Les lignées cellulaires traditionnelles cultivées au sérum, bien qu’utilisées depuis longtemps, répliquent de manière inadéquate les tumeurs d’origine, présentant des profils transcriptionnels altérés. Alternativement, les conditions de culture sans sérum, que ce soit dans des modèles tumoroïdes 2D ou 3D, préservent plus efficacement les profils transcriptionnels des cellules tumorales et leurs phénotypes in vivo, tels que l’invasion dans le tissu cérébral normal^10,11.

De plus, les cultures cellulaires à court terme dérivées de l'échantillon chirurgical d'un patient préservent le profil moléculaire et la diversité cellulaire de la tumeur, représentant ainsi mieux les traits biologiques des tumeurs par rapport aux lignées cellulaires¹². Dans cet article, nous présentons une méthode non enzymatique simple pour la culture de cultures de gliomes diffus de bas grade avec mutation IDH1 sous forme d’explants dérivés de résections de patients frais ou congelés, dans le but de répondre au besoin de modèles in vitro améliorés pour la recherche sur les gliomes et le développement thérapeutique. Ils offrent également la possibilité de dériver des lignées cellulaires mutantes IDH1.

Protocole

Les fragments tumoraux utilisés dans ce protocole ont été obtenus à partir d’une collection bien caractérisée et approuvée sur le plan éthique, avec le consentement du patient. Cette recherche a été menée dans le cadre du projet intitulé Gliomacult : Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas (Projet No. RECH/P722/1-5) et a été approuvé par le conseil scientifique de la biobanque de tumeurs le 28 août 2023.

1. Préparation des plaques de culture

REMARQUE : Effectuez ces étapes sous une hotte à flux laminaire de culture de tissus stériles.

1. Au moins 1 h avant la culture, préparer des plaques de poly-D-lysine (PDL) et de laminine à 24 puits.
   1. Diluer 10 mg de poudre de PDL dans 100 mL de tampon de borate (pH 8,4) pour une concentration finale de 100 μg/mL. Une fois dissoute, filtrez la solution (0,22 μm) pour la stérilité. PDL est prêt à l’emploi ; préparer 3 mL d’aliquotes et les conserver à -20 °C.
   2. Décongeler le tube de laminine de 1 à 2 mg/mL à 4 °C pour éviter la formation de gel. Préparez des aliquotes de 50 μL et conservez-les à -20 °C.
      REMARQUE : La décongélation et la congélation répétées doivent être évitées.
   3. Revêtement des plaques
      1. Étape facultative : placer les lamelles stériles Ø, 13 mm, adaptées aux boîtes de culture cellulaire, dans une plaque de 24 puits, une lamelle par puits.
         REMARQUE : Cette étape est pour une immunocoloration supplémentaire des explants de gliome.
      2. Pour le revêtement des puits, mélanger les 3 mL de la solution PDL dans 9 mL de 1x PBS et ajouter 50 μL de laminine. Ajouter 500 μL de cette solution dans chaque puits pour une concentration d’enrobage de 1 à 2 μg/cm². Incuber les plaques revêtues à température ambiante, de préférence avec un balancement lent (15 tr/min), pendant au moins 1 h.
      3. Immédiatement avant la culture, retirer la solution de laminine PDL et rincer deux fois avec du 1x PBS.
         stérile REMARQUE : Ne laissez pas les puits se dessécher.

2. Médias

1. Cultivez des explants mutants IDH1 dans un milieu défini comprenant du DMEM/F12 complété par de la L-glutamine, ainsi qu’un mélange de remplacement sérique composé de N2 et de B27 sans vitamine A. Utilisez des antibiotiques, notamment de la ciprofloxacine, de la gentamicine et des champignons, pour prévenir la contamination bactérienne et fongique. De plus, incorporez les facteurs de croissance héparine, EGF et FGF2 dans le milieu, filtrez-le (0,2 μm) et stockez-le jusqu’à 2 semaines à 4 °C
   REMARQUE : Pour plus de détails sur les ingrédients et la préparation des milieux, reportez-vous au tableau 1 et au tableau des matériaux.

3. Préparation de l’explant

1. Avant le traitement de l’échantillon, préparez l’espace de travail et les outils stériles comme illustré dans Figure 1A. Désinfectez un bloc réfrigérant en le vaporisant avec de l’éthanol à 70 %. Stérilisez les ciseaux et les pinces en les immergeant dans de l’éthanol à 70 % et en les rinçant avec du PBS.
2. Transférez rapidement la résection tumorale pour culture sur glace, idéalement dans les 2 heures suivant l’extraction chirurgicale (Figure 1B).
   REMARQUE : L’échantillon de tumeur doit avoir un diamètre minimum de 9-10 mm pour assurer de meilleurs résultats. Le tissu est transporté sans milieu de culture car cette méthode est préférée à des fins histologiques. L’absence de liquide empêche la formation de cristaux de glace lors de la congélation éclair, préservant ainsi l’intégrité des tissus pour un examen histologique ultérieur si nécessaire.
3. Placez la boîte de culture avec l’échantillon de tumeur sur le pack réfrigérant et rincez-la doucement avec 1X PBS pour éliminer l’excès de sang.
4. La tumeur réséquée présente souvent une taille et une hétérogénéité significatives, comprenant la masse tumorale, le tissu infiltré et les composants non tumoraux (Figure 1C). Sélectionnez des portions affichant une couleur grise avec une texture douce ou gélatineuse pour l’isolement des cellules tumorales, car elles ont tendance à contenir plus de cellules tumorales. À l’inverse, évitez les régions dures et blanches car elles peuvent contenir moins de cellules tumorales adaptées à la culture (Figure 1D), ainsi que des zones noircies, car elles sont probablement le résultat d’une électrocautérisation et peuvent ne pas fournir de résultats fiables pour l’analyse.
5. Transférez les échantillons sélectionnés dans un microtube de 1,5 mL ou un cryoflacon pour le hachage. Ajoutez 1 ml de milieu stérile dans le microtube de 1,5 ml ou le cryoflacon et hachez l’échantillon avec les ciseaux stériles jusqu’à l’obtention de petits morceaux (1-2 mm³).
   REMARQUE : Environ 1 à 2 minutes de hachage sont nécessaires pour obtenir de minuscules fragments, généralement de 1 à 2 mm⁽Figure 1E).
6. À l’aide de ciseaux stériles, coupez soigneusement l’extrémité d’une pointe de pipette bleue de 1 000 μL pour créer une large ouverture d’environ 3 à 4 mm de diamètre. À l’aide de cette pointe modifiée, pipetez 50 à 200 μL des fragments de tissu haché et répartissez-les uniformément dans chaque puits. Comme les petits morceaux ont tendance à se déposer rapidement, réhomogénéisez doucement la suspension dans chaque puits pour assurer une distribution uniforme.
   REMARQUE : Évitez la surpopulation et maintenez un équilibre en n’introduisant pas un nombre excessif de fragments dans chaque puits (Figure 1F).
7. Incuber les fragments tumoraux à 37°C dans un incubateur à 5 % de CO2 avec 100 % d’humidité. Changez de milieu tous les jours si l'activité métabolique de la tumeur (indiquée par un jaunissement rapide du milieu) et le nombre de fragments dans chaque puits l'exigent. Lors des changements de support, faites attention en aspirant délicatement le support à l’aide d’une pipette équipée d’un embout de 200 μL, en veillant à ne pas perturber les fragments tumoraux adhérents.

Figure 1 : Procédure de culture d’explants tumoraux. Une résection diffuse de gliome de bas grade a été obtenue chez un patient de 44 ans diagnostiqué avec un astrocytome de grade II selon la classification 2021 de l’OMS. La tumeur présentait une mutation IDH1 (Exon 4 c.395 G>A, p.Arg132His) et une mutation TP53 (Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), ainsi que l’absence de coloration ATRX. Aucune mutation n’a été détectée dans les sites de liaison Ets/TCF (C250T et C228T) du gène TETT. (A) La surface de travail comprend un bloc réfrigérant, fournissant un environnement qui minimise la dégradation de l’échantillon et maintient la viabilité des composants biologiques. Ces précautions sont importantes pour préserver la qualité et l’intégrité des tissus. (B) Le transport de l’échantillon de l’hôpital au laboratoire doit se faire sur de la glace. (C) Fragment de résection tumorale. Les flèches montrent les parties les plus appropriées pour la culture. (D) Une dissection de la tumeur est effectuée pour sélectionner la partie la plus pertinente à hacher. D’après notre expérience, la substance blanche est généralement moins susceptible de générer des explants réussis. (E) Fragments tumoraux d’environ 1 à 2 mm³ de diamètre dans un tube de 15 mL après avoir été hachés mécaniquement avec des ciseaux. (F) Le nombre de morceaux tumoraux nécessaires pour un ensemencement correct est indiqué pour les puits sur une plaque de 24 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Cryoconservation et décongélation des tumeurs hachées

REMARQUE : La cryoconservation assure une sauvegarde en cas de contamination et de perte de cultures d’explants ou pour traiter les échantillons de tumeurs plus tard.

1. Cryoconservation : Préparez le milieu de congélation (solution de DMSO à 20 % v/v) en ajoutant 2 mL de DMSO à 8 mL de milieu de culture cellulaire.
2. Combinez 1 volume de suspension tumorale hachée avec un volume égal de milieu de congélation à 20 % de DMSO pour obtenir une concentration finale de 10 % de DMSO. Pipetez soigneusement le mélange de haut en bas pour assurer un mélange complet, puis versez environ 1 ml dans des flacons cryogéniques.
3. Transférez rapidement les flacons cryogéniques dans un récipient cryogénique pour une réduction progressive de la température, suivi d’une incubation d’une nuit à -80 °C avant d’être stocké définitivement dans de l’azote liquide
   REMARQUE : Cette étape doit être effectuée immédiatement après que les cellules ont été placées dans le milieu de congélation, car certains cryoprotecteurs, comme le DMSO, peuvent être nocifs si les cellules y sont exposées à température ambiante plus longtemps que nécessaire.
4. Décongélation : Retirez les cryoflacons de l’azote liquide et placez-les immédiatement dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’environ 80 % des cellules soient décongelées.
5. Pour retirer le DMSO, pipetez rapidement la suspension dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 5 ml de PBS 1x préchauffé et centrifugez à 300 × g pendant 5 min.
6. Retirez le surnageant et répétez le lavage avec 1X PBS suivi d’une centrifugation (étape 4.5). Aspirez le surnageant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille, et ajoutez la quantité appropriée de milieu à transférer dans une plaque PDL-Laminin 24 puits pré-enduite et placez-la dans l’incubateur.
7. Après 24 h, vérifiez que les cellules sont attachées. Après quelques jours, retirez les fragments non adhérents en replaçant le milieu de culture.

5. Passage de la culture

REMARQUE : Une fois établis, les explants peuvent être utilisés pour la vidéomicroscopie ou l’immunomarquage. Alternativement, si les cellules tumorales ont migré hors de l’explant et semblent saines, l’explant peut être passé par dissociation enzymatique et réensemencé dans des puits pour une expérimentation plus approfondie. Cependant, il est important de noter que ce protocole n’est pas conçu pour le passage répété. En règle générale, un seul passage peut être tenté avant que les cellules tumorales ne deviennent sénescentes ou ne meurent. Toutes les cultures d’explants n’aboutiront pas à un passage réussi.

1. Pour le passage, retirez l’ancien support, rincez avec 1X PBS et ajoutez (125 μL) 0,05 % de trypsine-EDTA dans les puits et incubez pendant 3 à 4 minutes à 37 °C, puis ajoutez 6,5 μL d’inhibiteur de trypsine, 12 μL de 20 mM de CaCl₂ (dilution finale à 2 mM) et 1 μL de DNAse I.
   REMARQUE : Le temps d’incubation nécessaire à la dissociation peut varier en fonction de la culture. Il est important de vérifier si les cellules sont détachées après au moins 3 min. En règle générale, l’explant peut ne pas être complètement dissocié en une suspension unicellulaire, et de petits amas sont souvent conservés, ce qui peut générer de nouvelles cultures d’explants.
2. Avec un p1000 réglé sur 500-600 μL, rincer doucement pour désagréger les explants. Évitez la formation de bulles.
3. Ajouter 5 mL de 1x PBS et centrifuger pendant 5 min à 300 × g. Aspirez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans un milieu frais préchauffé et comptez pour l’ensemencement.
4. Identifiez les cultures ayant le potentiel de générer des lignées cellulaires en observant les cellules en division au microscope à contraste de phase. Ces cellules en division ont généralement une morphologie arrondie et des chromosomes visibles, comme le montre Figure 2A).

Résultats

Après quelques jours, certains fragments de tumeur adhèrent à la surface du puits, initiant la croissance des cellules des explants. Le temps entre le placage initial et l’apparition des cellules tumorales en croissance est différent d’un échantillon à l’autre. Les cultures initiales contiennent souvent des débris cellulaires substantiels, ce qui rend difficile l’évaluation de la présence de cellules viables. Par conséquent, la culture doit être maintenue pendant au moins 4 semaines. Une fois que les cellules commencent ...

Discussion

Le développement de modèles in vitro et précliniques pour les gliomes de bas grade mutants IDH1 est particulièrement difficile en raison de la croissance lente de ces tumeurs et de la complexité de la réplication des altérations génomiques et épigénomiques étendues causées par la mutation IDH. De plus, ces cellules tumorales infiltrantes interagissent activement avec les cellules environnantes, y compris les cellules immunitaires, endothéliales, gliales et neuronales, en s’appuyant potentiellement sur elles pour leur sur...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-ASCL1	BD Pharmingen&trade ;	556604	Dilution 1:500
Anti-ATRX	Sigma-Aldrich	HPA001906	Dilution 1:100
Anti-CD68	Agilent	M081401-2	Dilution 1:500
Anti-GFAP	Aves Labs	AB_2313547	Dilution 1:500
Anti-IBA1 Fujifilm	Wako Anticorps	019-19741	Dilituion 1:1000
Anti-IDH1 (R132H) souris Anticorps monoclonal	Dianova	DIA-H09
Anti-Ki67	BD Pharmingen&trade ;	556003	Dilituion 1:1000
Anti-OLIG1	R& D Systems® ;	AF2417	Dulituion 1:300
Anti-OLIG2	Sigma-Aldrich	MABN50	Dilution 1:250
Anti-SOX9	Abcam® ;	EPR14335-78	Dilution 1:100
B-27 Supplément (50x), moins vitamine A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Albumine sérique bovine (BSA)	CiteAb	A-421-100
Ciprofloxacine HCl	Sigma-Aldrich	PHR1044-1G
CoolCell	Corning® ;	432000	Conteneur de congélation de cellules, pour 12 flacons cryogéniques de 1 mL ou 2 mL
Couvercle et Oslash ;, 13 mm	Karl Hecht&trade ; Assistent&trade ;
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM/F-12, sans glutamine	Thermo Fisher Scientific	21331020
DNAse I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco&prime ; s Saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 100 mm TC-treated TC-Culture Dish	Corning® ;
Falcon 24 puits à fond plat transparent	Corning® ;	353047	Plaque de culture cellulaire multipuits traitée TC, avec couvercle, stérile
Fungin	InvivoGen	ant-fn-1
Gentamicine	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Héparine	Sigma-Aldrich	H3149-100KU
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3375
Humain EGF	PeproTech	AF-100-15-1MG
Humain FGF-basic	PeproTech	100-18B-1MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-024
N-2 Supplément (100x )	Thermo Fisher Scientific	17502-048
PDL	Sigma-Aldrich	P7886
Acrodisque sérique 37 mm filtre seringue avec GF/0.2 µ ; m Supor	PALL Corporation	4525
Inhibiteur de la trypsine	Thermo Fisher Scientific	17075-029
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol	Thermo Fisher Scientific	25300054
Microscope Zeiss Z1 Apotome 3 Microscope	à épifluorescence droit à grand champ	Zeiss