Article de méthode

Imagerie FRET à molécule unique pour l’observation de la dynamique conformationnelle de l’atlastine GTPase de type dynamine

DOI :

10.3791/67263

⸱

24 janvier 2025

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Life Sciences, Frontiers Science Center for Cell Responses, Nankai University, 2National Laboratory for Condensed Matter Physics, Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les fonctions des protéines de la superfamille des dynamines dépendent des changements de conformation couplés à l’hydrolyse des GTP. Un système est décrit à l’aide de la technique FRET à molécule unique (smFRET) pour surveiller la dynamique conformationnelle de l’atlastine GTPase de type dynamine dans différents états de charge nucléotidique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La rotation du corps rigide du domaine intermédiaire à trois hélices (3HB) par rapport au domaine GTPase de l’atlastine de type dynamine (ATL) est un moteur crucial de la fusion membranaire homotypique au sein du réticulum endoplasmique (RE). Des perturbations dans ce processus ont été associées à la paraplégie spastique héréditaire (HSP), une maladie neurodégénérative. Des études structurales et biochimiques suggèrent que les changements conformationnels de l’ATL sont liés à l’hydrolyse du GTP, mais la visualisation en temps réel de cette dynamique conformationnelle pendant le cycle d’hydrolyse du GTP reste difficile. Pour mieux comprendre les mécanismes mécaniques à l’origine de la fonction ATL, le transfert d’énergie par résonance de Förster (smFRET) à molécule unique a été utilisé. Trois stratégies spécifiques ont été employées pour immobiliser la région cytosolique N-terminale de l’ATL1 humain (ATL1cyto) dans une chambre microfluidique enrobée de streptavidine, facilitant ainsi l’application de l’imagerie smFRET intramoléculaire et intermoléculaire. Cela a permis un suivi précis des conformations des protéines dans divers états de charge nucléotidique, fournissant des informations directes sur les comportements moléculaires individuels. Cette méthode peut également être appliquée à l’étude d’autres protéines mécanochimiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans les cellules eucaryotes, les protéines de la superfamille des dynamines interviennent dans le remodelage des membranes biologiques, y compris la tubulation membranaire, la fission et la fusion 1,2,3. Les mutations de ces protéines entraînent diverses maladies humaines, telles que les maladies neurodégénératives. Les membres de la superfamille des dynamines contiennent généralement un domaine GTPase, un domaine intermédiaire composé de faisceaux hélicoïdaux, un motif de liaison membranaire et un domaine effecteur GTPase (GED). L’une de ces GTPases de type dynamine est l’atlastine (ATL), qui catalyse la fusion membranaire homotypique du réticulum endoplasmique (RE) pour former un réseau 4,5,6,7,8,9,10. Il existe trois ATL (ATL1-3) chez les mammifères. La molécule ATL se compose d’une région cytosolique N-terminale (cyto ATL), comprenant un domaine GTPase et un domaine intermédiaire à trois hélices (3HB), suivi de deux régions transmembranaires, mais n’a pas le GED typique. Alternativement, ATL contient une queue C-terminale qui joue un rôle crucial dans la fusion membranaire 11,12,13.

Il a été rapporté que la fusion membranaire efficace repose sur le réarrangement du domaine dépendant de l’hydrolyse du GTP dans ATLcyto 14,15,16,17,18,19,20. Cependant, par rapport au complexe SNARE, qui utilise l’énergie de repliement des changements conformationnels pour piloter la fusion membranaire hétérotypique21, le processus de fusion membranaire homotypique médié par ATL et d’autres protéines de type dynamine spécifiques à la fusion22 reste insaisissable. Trois structures cristallines del’ATL1 cyto humain ont été déterminées dans différentes conditions de charge nucléotidique 14,15,16,23. Dans les structures, les deux 3HB du dimère pointent dans des directions différentes, mais il manque encore un modèle complet expliquant comment la dynamique conformationnelle de l’ATLcyto et son activité GTPase sont couplées.

Dans le modèle précédent, les molécules monomères ATL forment des dimères à travers différentes membranes de manière dépendante du GTP pour entraîner la fusion membranaire. Ici, trois stratégies sont décrites pour appliquer le transfert d’énergie de résonance de Förster (smFRET) à molécule unique afin d’observer directement et de détecter avec précision le comportement des moléculesindividuelles de cyto ATL1. smFRET est une technique puissante largement utilisée pour étudier la dynamique conformationnelle et les interactions de biomolécules individuelles en temps réel, telles que l’activation de la β-arrestine24 médiée par les RCPG, le remodelage de la chromatine par Snf225 et les réarrangements de domaine de la protéine de type dynamine MxA couplée aux cycles d’hydrolyse GTP26. Étant donné que le smFRET ne peut détecter efficacement que les changements de distance de ~3 nm à ~8 nm, des expériences smFRET intermoléculaires et intramoléculaires sont nécessaires pour analyser de manière exhaustive les conformations d’ATL1cyto pour chaque état de charge nucléotidique. Nous avons généré trois constructions decytose ATL1 avec toutes les cystéines natives substituées par des alanines et K400 (ATL1 cyto-K) ou la paire T51/K400 (ATL1 cyto-TK) mutée en cystéine pour le marquage fluorophore. Les stratégies d’immobilisation ducytodimère ou du monomère ATL1 dans une chambre microfluidique enrobée de streptavidine (Figure 1A) pour des expériences smFRET intermoléculaires ou intramoléculaires sont illustrées à la Figure 1B-D. Cette méthode fournit plus de détails sur la dynamique conformationnelle des protéines de type dynamine à chaque étape de l’hydrolyse du GTP27.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation d’une lamelle modifiée pour la chambre d’immobilisation des protéines

  1. Préparation
    1. Préparez 50 ml de solution de piranha (composée d’acide sulfurique concentré et de peroxyde d’hydrogène dans un rapport de 3:1) en ajoutant lentement du peroxyde d’hydrogène à de l’acide sulfurique concentré pour éviter les températures excessives. Placez-le soigneusement dans une hotte.
    2. Préparez une solution d’éthoxyde de sodium. Dissoudre 2 g de NaOH dans 15 mL de ddH2O, ajouter 35 mL d’éthanol absolu et mélanger complètement. Laisser à température ambiante.
    3. Préparez une solution à haute teneur en sel (0,1 M de NaHCO3 et 0,6 M de K2SO4). Dissoudre complètement et aliquote 500 μL/tube. Conserver à -20 °C.
    4. Aliquote SVA-mPEG et SVA-mPEG-biotine en environ 30 mg par tube et 3 mg par tube. Conserver à -20 °C.
    5. Personnalisez les lames de microscope (75 mm × 26 mm × 1 mm) avec 6 paires de trous de 1,2 mm de diamètre.
  2. Nettoyage de la surface de la lamelle
    1. À l’aide d’une pince à épiler, prenez huit lamelles et placez-les dans un bocal de coloration. Ajoutez de l’acétone (~50 ml) pour couvrir les lamelles, placez le pot de coloration dans un nettoyeur à ultrasons pendant 30 min, puis rincez les lamelles trois fois avec du ddH2O.
    2. Lavez les lamelles avec du méthanol comme à l’étape 1.2.1.
    3. Ajoutez la solution de piranha (étape 1.1.1) dans le bocal de coloration et faites-la chauffer dans une bouilloire à bain-marie à 95 °C pendant 2 h. Une fois que le pot de coloration a refroidi à température ambiante, rincez les lamelles au moins six fois avec du jdH2O.
    4. Ajoutez la solution d’éthoxyde de sodium dans le bocal de coloration, placez-la dans un nettoyeur à ultrasons pendant 15 min, puis rincez trois fois avec du ddH2O.
    5. Ajoutez du ddH2O dans le pot de coloration pour couvrir les lamelles, placez-le dans un nettoyeur à ultrasons pendant 15 min, puis rincez 3 fois avec du ddH2O.
  3. Modification de l’aminosilanisation de la surface de la lamelle.
    1. Fixez les lamelles dans le bocal de coloration sur une paillasse propre, séchez-les avec de l’azote et mettez-les dans un autre bocal de coloration (séché à l’avance).
    2. Faites cuire le pot de coloration dans une étuve de séchage à 120 °C pendant 30 min, puis laissez-le refroidir à température ambiante dans un dessiccateur.
    3. Ajouter 47,5 ml de méthanol, 2,5 ml d’acide acétique et 0,5 ml de 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) dans le bécher (séché à l’avance), mélanger uniformément, ajouter dans le bocal de coloration et incuber pendant 10 min.
    4. Rincez les lamelles dans le pot de coloration avec du ddH2O au moins trois fois et sonicez pendant 5 min.
    5. Retirez les lamelles une par une, rincez-les au ddH2O, séchez-les au sèche-cheveux à l’azote et mettez-les dans une boîte de Pétri de 10 cm de diamètre pour les préparer à la modification du PEG.
      REMARQUE : La modification APTES doit être effectuée dans un environnement sec.
  4. Modification de la surface de lamelle avec SVA-mPEG-Biotine et SVA-mPEG
    REMARQUE : La modification de la biotine de la surface de la lamelle aide à retenir les protéines biotinylées (ou les protéines se liant à la biotine-anti-His) via la streptavidine.
    1. Dissoudre complètement le SVA-mPEG et le SVA-mPEG-Biotine emballés dans la solution à haute teneur en sel (1 mg correspondant à une solution à haute teneur en sel de 10 μL). Ajouter la solution SVA-mPEG-Biotine à la solution SVA-mPEG dans un rapport de 1:100.
      REMARQUE : Utilisez un vortex pour agiter la solution afin de vous assurer que SVA-mPEG ou SVA-mPEG-Biotine est complètement dissous. La solution aqueuse SVA-mPEG ou SVA-mPEG-Biotine doit être préparée avant utilisation.
    2. Déposez la solution de mélange préparée sur une lamelle et couvrez-la avec une autre lamelle. Ce processus doit éviter la génération de bulles. Incuber complètement les lamelles avec une humidité appropriée pendant plus de 2 h ou toute la nuit.
    3. Séparez les lamelles une fois la modification terminée, rincez-les avec du ddH2O et séchez-les au sèche-cheveux avec de l’azote. Marquez la surface de la lamelle qui n’a pas été modifiée avec SVA-mPEG et SVA-mPEG-biotine.
    4. Placez délicatement la lamelle modifiée dans un tube de microcentrifugation de 50 ml. Conserver à -20 °C après avoir passé l’aspirateur.
      REMARQUE : La lamelle modifiée peut être stockée sous vide pendant 1 mois.

2. Préparation de lames de microscope pour chambre d’immobilisation des protéines

  1. Lavez les lames de microscope comme décrit pour les lamelles à l’étape 1.2.
  2. Séchez les lames de microscope avec de l’azote et placez-les dans des tubes de microcentrifugation de 50 ml.
  3. Stockez les lames de microscope comme décrit à l’étape 1.4.4.

3. Expression et purification des protéines

  1. Préparation
    1. Plasmides : Cloner un membre de la famille de l’atlastine d’intérêt ou la mutation pathogène d’intérêt dans un vecteur d’expression bactérienne, par exemple, pET-28a, et ajouter un Avitag27. Introduire des cystéines à des positions pertinentes par mutagénèse dirigée (par exemple, T51C et K400C27).
    2. Préparez les tampons suivants.
      1. Milieu de culture Luria-Bertani (LB) : Mélanger 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure et 10 g de chlorure de sodium dans 1 L de ddH2O. Autoclave à 121°C pendant 20 min.
      2. Tampon de lyse : Mélanger 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1x cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA, 10 mM d’imidazole et 0,5 mM de TCEP. Conserver à 4 °C.
      3. Tampon de lavage : Mélanger 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 30 mM d’imidazole et 0,5 mM de chlorhydrate de Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP). Conserver à 4 °C.
      4. Tampon d’éluuté : Mélanger 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 150 mM d’imidazole et 0,5 mM de PTCE. Conserver à 4 °C.
      5. Tampon de purification : 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 0,5 mM de TCEP. Conserver à 4 °C.
  2. Purification des protéines
    1. Transférez les plasmides27 dans des cellules E. coli Rosetta (DE3) (Biomed) en utilisant des méthodes de choc thermique par transformation bactérienne. Suspendre les cellules transférées dans un milieu de culture LB avec une concentration finale de 50 μg/μL de kanamycine ajoutée.
      1. Culture à 37 °C jusqu’à ce que l’absorbance du milieu de culture à 600 nm soit de 0,6-0,8. Ajouter de l’isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) à une concentration finale de 50 μM pour induire l’expression de la protéine à 16 °C pendant 20 à 24 h.
        REMARQUE : Le taux de croissance des cultures cellulaires bactériennes ou microbiennes peut être surveillé en mesurant la densité optique (absorbance) de la culture de croissance cellulaire à 600 nm.
    2. Récolter les cellules par centrifugation à 4000 × g pendant 20 min à température ambiante. Jetez le surnageant.
    3. Remettez en suspension la pastille cellulaire avec 30 mL de tampon de lyse. Perturbez les cellules trois fois à l’aide d’un broyeur de cellules à haute pression.
    4. Clarifier les lysats par centrifugation à 2,00 000 × g pendant 1 h à 4 °C à l’aide d’un rotor d’ultracentrifugeuse.
    5. Isolez la protéine à l’aide d’une colonne Ni-NTA. Laver la colonne Ni-NTA avec un tampon de lavage pour 5 volumes de colonne. Protéine d’élution avec tampon d’élution pour un volume de 1 colonne. Recueillir l’éluat et le concentré à l’aide de filtres centrifuges à ~ 500 μL.
    6. De plus, purifier la protéine par chromatographie d’exclusion stérique27. Prélever l’éluat (500 μL par tube).
    7. Confirmer la protéine cible par son poids moléculaire déterminé par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE)27. Prélevez la protéine cible pour une modification ultérieure.

4. Biotinylation des protéines

  1. Préparation
    1. Préparez les solutions mères suivantes.
      1. Dissoudre l’acétate de magnésium tétrahydraté (MgOAc·4H2O) dans 25 mM de tampon HEPES (pH 7,7) à une concentration de 100 mM (10×). Aliquote 100 μL par tube et conserver à -20 °C.
      2. Dissoudre le sel disodique d’adénosine 5-triphosphate (ATP) dans la jdH2O à une concentration de 100 mM (10×). Ajustez le pH à 7,4 à l’aide de NaOH. Aliquote 100 μL par tube et conserver à -80 °C.
      3. Dissoudre la d-biotine dans du ddH2O à une concentration de 500 μM. Aliquote 100 μL par tube et conserver à -20 °C.
      4. Dissoudre la streptavidine dans la jdH2O à une concentration de 1 mg/mL. Aliquote 20 μL par tube et conserver à -20 °C.
    2. Tampon de biotinylation des protéines : Ajouter 25 mM de HEPES (pH 7,7), 200 mM d’acide L-glutamique de potassium et 0,5 mM de TCEP. Conserver à 4 °C.
    3. Purifier la biotine ligase BirA et la conserver à -80 °C.
  2. Biotinylation des protéines
    1. Remplacez le tampon protéique par le tampon de biotinylation protéique. Pour la biotinylation, mélanger 100 μL de 100 mM d’ATP, 100 μL de 100 mM de MgOAc, 100 μL de 500 μM de d-biotine, 10 μL de 100 μM de biotine ligase BirA, 50 μM de protéines jusqu’à un volume final de 1 mL et incuber toute la nuit à 4 °C.
    2. Éliminez la d-biotine libre à l’aide d’un filtre centrifuge MWCO de 10 K.
    3. Incuber 20 μL de protéines biotinylées avec 20 μL de streptavidine 15 μM pendant 20 min sur glace. Détecter l’efficacité de la biotinylation des protéines par SDS-PAGE27.

5. Marquage au fluorophore des protéines

  1. Préparation
    1. Dissoudre les fluorophores LD555 (donneur) et LD655 (accepteur) dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) jusqu’à une concentration finale de 5 mM. Conserver à -20 °C.
    2. Préparez le tampon d’étiquetage : Mélangez 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl et 5 mM de MgCl2. Conserver à 4 °C.
    3. Remplacez le tampon protéique par le tampon d’étiquetage.
  2. Marquage au fluorophore
    1. Pour les tests de smFRET intramoléculaires, mélanger ATL1cyto-TK avec LD555 et LD655 dans un rapport de 1:1,2:1,2 à un volume final de 100 μL (le volume total des fluorophores ne doit pas dépasser 1 μL), et incuber pendant 5 h à 4 °C.
    2. Pour les expériences intermoléculaires smFRET, incuber ATL1cyto-K ou ATL1cyto-T avec DL555 dans un rapport de 1:1,2, et incuber simultanément ATL1cyto-K biotinylée avec LD655 dans un rapport de 1:1,2, pendant 5 h à 4 °C (même volume d’incubation que dans 5.2.1).
      REMARQUE : La co-incubation des protéines et des colorants permet une flexibilité dans les positions de marquage pour DL555 (donneur) et DL655 (accepteur). Le fait que le LD555 soit étiqueté T51C ou K400C n’affecte pas les résultats de l’expérience FRET. Un schéma de principe du donneur étiqueté sur le site T51C est fourni (figures 1C et D).
    3. Éliminer l’excès de fluorophores libres à l’aide de colonnes de dessalage par centrifugation MWCO de 7 K27.
    4. Ajouter du PTCE à des protéines marquées au fluorophore à une concentration finale de 0,5 mM.
    5. Détectez l’efficacité du marquage des protéines à l’aide d’un spectrophotomètre. Mesurez l’absorbance des protéines à 280 nm, l’absorbance DL555 à 555 nm et l’absorbance DL555 à 655 nm, et calculez les concentrations molaires à l’aide de leurs coefficients d’extinction, respectivement. Efficacité du marquage des protéines = (concentration molaire du colorant fluorescent/concentration molaire de la protéine) x 100 %.

6. Imagerie FRET à molécule unique

  1. Préparation
    1. Préparez le tampon d’incubation : Mélangez 25 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de KCl et 5 mM de MgCl2. Conserver à 4 °C.
    2. Préparez 1 mg/mL de streptavidine (dissoute dans de la ddH2O) et 1 mg/mL d’anticorps anti-His biotinylé pour l’immobilisation des protéines.
    3. Préparez 25 mM d’acide benzoïque (pH 7,4 ; dissous dans le tampon tel que décrit en 7.1.1) et 100 mM de protocatéchuate 3,4-dioxygénase (PCD) (dissoute dans une solution de glycérine à 40 %) pour minimiser le photoblanchiment pendant les expériences smFRET.
    4. Préparez 100 mM de sel sodique de guanosine 5'-diphosphate (GDP), de guanosine 5'-O-[gamma-thio]triphosphate (GTPγS) et de solutions mères d’AlCl3 dissoutes dans ddH2O. Préparez 1 M de solution mère de NaF dissoute dans ddH2O.
    5. Sortez la lamelle et la lame de microscope conservées sous vide, et collez-les soigneusement ensemble avec du ruban adhésif double face personnalisé sur un banc propre. Installez les tuyaux et les embouts pour former une chambre microfluidique à six canaux27.
      REMARQUE : N’exposez pas la lamelle modifiée à l’air pendant de longues périodes. Préparez la chambre microfluidique27 avant de commencer les expériences smFRET.
  2. Correction de mappage
    REMARQUE : Au cours de l’expérience, les signaux de fluorescence doivent être collectés à partir des canaux donneur et accepteur, respectivement. En raison de l’utilisation de microscopes, il peut y avoir de légères déviations dans les champs de surveillance des canaux donneur et accepteur. Afin de réduire l’écart dans les champs de surveillance, un étalonnage cartographique doit être effectué avant de commencer l’expérience.
    1. Mélangez soigneusement 10 % de particules de polystyrène (diamètre 3 μm), ajoutez 10 μL de particules à une lame de microscope (non modifiée) et recouvrez d’une lamelle (non modifiée).
    2. Sélectionnez un champ de vision avec autant de particules de polystyrène que possible. Capturez une vidéo sous un champ clair à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF).
      REMARQUE : Un objectif à immersion dans l’huile à grande ouverture numérique (100x) a été utilisé pour l’imagerie à haute résolution. Pour les expériences smFRET, les signaux ont été capturés à des intervalles de 30 ms à l’aide d’une caméra EMCCD.
    3. Utilisez un script personnalisé pour aligner l’emplacement central de la même particule de polystyrène dans le canal donneur et le canal accepteur, puis enregistrez le fichier de carte en tant que fichier txt. Le code MATLAB personnalisé utilisé dans cette étude est disponible à l’adresse https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET).
  3. Immobilisation des protéines dans la chambre
    1. Pour les expériences intermoléculaires smFRET, mélanger ATL1cyto-K ou ATL1cyto-T marqué LD555 et ATL1cyto-K-biotine marquée LD655 dans un rapport de 1:1 avec une concentration finale de 1 mM de GTPγS ou GDP/AlF4-, et incuber pendant 1 h sur glace pour dimériser la protéine.
    2. Pour les expériences intermoléculaires de smFRET ATL1cyto-T et ATL1cyto-K , mélanger ATL1cyto-T marqué LD555 etcyto-K-biotine ATL1 marqué LD655 dans un rapport de 1:1 avec une concentration finale de 1 mM de GTPγS ou GDP/AlF4-, et incuber pendant 1 h sur glace pour obtenir des protéines dimérisées.
    3. Pour les tests smFRET intramoléculaires, incuber lacyto-TK ATL1 marquée LD555 et LD655 avec 1 mM de GDP pendant 1 h sur glace avant d’effectuer les expériences smFRET dans des conditions GDP.
    4. Pour les expériences intermoléculaires de smFRET, incuber 10 μg/mL de streptavidine (diluée avec un tampon d’incubation de 200 μL) pendant 10 min pour immobiliser les protéines. Pour les tests smFRET intramoléculaires, ajoutez 10 μg/mL d’anticorps anti-His biotinylé (dilué avec un tampon d’incubation de 200 μL) et incubez pendant 10 min pour immobiliser les protéines. Rincez le canal une fois avec un tampon d’incubation avant d’ajouter chaque solution.
    5. Diluer le dimère ATL1 à ~0,3 nM ou le monomère à ~1 nM dans un tampon d’incubation de 200 μL, et incuber pendant 10 min pour immobiliser les protéines dans le canal. Rincez le canal avec le tampon d’incubation deux fois. Ajouter de l’acide benzoïque et du PCD dans le canal à une concentration finale de 2,5 mM (dilué avec un tampon de 200 μL).
      REMARQUE : Pour simuler les différentes étapes des molécules decyto ATL1 dans le processus d’hydrolyse du GTP, un nucléotide (GDP, GTPγS et GDP/AlF4-) a été ajouté à une concentration finale de 1 mM aux tampons à chaque étape après avoir immobilisé la protéine dans le canal. L’addition GTPγS imite la liaison GTP, l’addition GDP/AlF4- imite l’hydrolyse GTP, l’addition GDP imite la libération de Pi et l’apo sate représente la libération de GDP.
  4. Imagerie smFRET
    1. Ajustez le plan focal. Utilisez les boutons de mise au point grossière et fine, ajustez le plan focal pour faire la mise au point sur l’échantillon. Ici, un système de mise au point automatisé a été utilisé pour obtenir une mise au point optimale.
    2. Configurez la source d’excitation. Utilisez le laser 532 nm comme source de lumière d’excitation. Ajustez la puissance du laser à un niveau approprié pour exciter les fluorophores. Ici, une puissance laser de 20 à 40 mW a été utilisée.
    3. Connectez la caméra EMCCD au microscope. Réglez l’appareil photo pour qu’il enregistre à un intervalle d’images de 30 ms. Assurez-vous que l’appareil photo est configuré pour capturer des images en mode 16 bits pour des données haute résolution.
    4. Enregistrez le film en veillant à ce que la concentration reste stable tout au long de l’acquisition. Prolongez le temps d’irradiation laser de 532 nm aussi longtemps que possible jusqu’à ce que la plupart des molécules fluorescentes soient éteintes lors de l’enregistrement des signaux de fluorescence.
    5. Sauvegardez les films enregistrés au format TIFF 16 bits pour une analyse plus approfondie.

7. Acquisition et analyse des données

  1. Chargez le fichier txt de la carte pour correction avant d’extraire les trajectoires FRET des films enregistrés. Sélectionnez les trajectoires FRET et enregistrez toutes les données de trajectoire FRET au format txt pour une analyse plus approfondie.
  2. Extrayez les données des fichiers txt et calculez les valeurs FRET à l’aide de scripts faits maison dans Matlab2022a. Le code MATLAB personnalisé est disponible à l’adresse https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET.
    REMARQUE : La valeur FRET est calculée à l’aide de l’équation ILD655/(γILD555+ILD655). ILD555 et ILD655 représentent respectivement les intensités de fluorescence LD555 et LD655. γ est un paramètre obtenu par la formule γ = FA/FD. FA représente la diminution de l’intensité de l’accepteur, et FD est l’augmentation de l’intensité du donneur.
  3. Ajustez les données smFRET de GaussAmp dans Origin 2022 pour obtenir l’histogramme de distribution.
    REMARQUE : Pour les données avec plusieurs états FRET (les données sous condition GTPγS dans le smFRET intermoléculaire ou les données du smFRET intramoléculaire sous condition GDP ou Apo), l’ajustement multi-pics peut être utilisé.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les expériences smFRET ont été réalisées sur un microscope TIRF en capturant l’intensité de fluorescence des fluorophores toutes les 30 ms. La figure 2A-C montre des images représentatives de moléculesATL1 cytogènes marquées LD555 (donneur) et/ou LD655 (accepteur) en l’absence ou en présence de nucléotides différents. Les intensités de fluorescence des deux fluorophores sur des particules individuelles ont été enregistrées, et des centaines de tra...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La technologie FRET est basée sur le transfert d’énergie entre deux colorants fluorescents (donneur et accepteur). Dans le cas de leur proximité l’un de l’autre (généralement de 1 à 10 nm), le donneur excité transfère son énergie à l’accepteur, ce qui entraîne une diminution de l’intensité de fluorescence du donneur et une augmentation de l’intensité de fluorescence de l’accepteur.

Dans les expériences smFRET, les molécules sont diluées à de très faibles conce...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.B. est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32371287), les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (63223043 et 63233053) et le Projet de formation des talents de l’Université de Nankai (035-BB042112). Y.L. est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (12022409 et T2221001) et le CAS Key Research Program of Frontier Sciences (ZDBS-LY-SLH015). L.M. est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32271274 et 31770812).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtres centrifuges 10 KAmiconUFC901096
3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES)  ;Sigma-Aldrich440140
45 Ti
Laser 532 nmLaser Olympus
640 nmColonnes
7 K MWCOThermo Scientific89882
Adénosine 5-triphosphate sel disodique (ATP)Roche11140965001
Acide benzoïqueSigma-Aldrich242381
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
Anticorps biotinylé anti-HisBioss Antibodiesbs-0287R-bio
d-biotineSigma-AldrichB4501
Cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTARoche11873580001
caméra EMCCDAndorIX897
Guanosine 5&prime ;-diphosphate de sodium (GDP)Sigma-Aldrich  ; G7127
Guanosine 5'-O-[gamma-thio]triphosphate (GTP&gamma ; S)Roche10220647001
Objectif à immersion dans l’huile à grande ouverture numériqueNikonNikon, 100x, N.A. 1.49,
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
Isopropyl-&Beta ;-D-ThiogalactosideSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
Acide L-glutamique potassiumSigma-AldrichG1501
Acétate de magnésium tétrahydratéSigma-AldrichM0631
Matlab The MathWorks, Natick, MAhttps://www.mathworks.com/
Verre de couverture de microscopeFisherbrand18834  ;( 24 mm & temps ; 60 mm)
Lames dePersonnalisées, (75 mm & times ; 26 mm & times ; 1 mm) avec 6 paires de trous traversants de 1,2 mm de diamètre
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
Originsoftwarehttps://www.originlab.com/
Particules de polystyrèneQDSphereAG1265
Protocatéchuate 3,4-dioxygénaseSigma-AldrichP8279
StreptavidinSangon BiotechA610492
Superdex 200 Increase (10/300 GL)Cytiva28990944
microscope TIRFNikonTi2
Tris(2-carboxyéthyl)chlorhydrate de phosphine (TCEP)Thermo75259
Rotor de dessalage par spin Olympus microscope

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins. Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).
  2. Kalia, R., Frost, A. Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins. Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).
  3. Ramachandran, R., Schmid, S. L. The dynamin superfamily. Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).
  4. Bryce, S., et al. Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst. J Cell Biol. 222 (7), e202211021(2023).
  5. Crosby, D., et al. Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus. J Cell Biol. 221 (2), e202107070(2022).
  6. Hu, J., et al. A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network. Cell. 138 (3), 549-561 (2009).
  7. Jang, E., et al. Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition. J Cell Biol. 222 (4), e202109090(2023).
  8. Liu, X., et al. Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites. Nat Commun. 10 (1), 568(2019).
  9. Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin. Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).
  10. Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis. Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).
  11. Faust, J. E., et al. The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion. J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).
  12. Liu, T. Y., et al. Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).
  13. Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).
  14. Bian, X., et al. Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).
  15. Byrnes, L. J., et al. Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin. EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).
  16. Byrnes, L. J., Sondermann, H. Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).
  17. Morin-Leisk, J., et al. An intramolecular salt bridge drives the soluble domain of gtp-bound atlastin into the postfusion conformation. J Cell Biol. 195 (4), 605-615 (2011).
  18. Pendin, D., et al. GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).
  19. Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion. J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).
  20. Yan, L., et al. Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion. J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).
  21. Rizo, J. Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release. Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).
  22. Gao, S., Hu, J. Mitochondrial fusion: The machineries in and out. Trends Cell Biol. 31 (1), 62-74 (2021).
  23. Kelly, C. M., Byrnes, L. J., Neela, N., Sondermann, H., O'donnell, J. P. The hypervariable region of atlastin-1 is a site for intrinsic and extrinsic regulation. J Cell Biol. 220 (11), e202104128(2021).
  24. Asher, W. B., et al. GPCR-mediated beta-arrestin activation deconvoluted with single-molecule precision. Cell. 185 (10), 1661-1675.e16 (2022).
  25. Li, M., et al. Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2. Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).
  26. Chen, Y., et al. Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret. Nat Commun. 8, 15744(2017).
  27. Shi, L., et al. Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level. Nat Commun. 15 (1), 2488(2024).
  28. Guelly, C., et al. Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i. Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).
  29. Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila. Front Neurosci. 14, 547746(2020).
  30. Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants. Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).
  31. Zhao, X., et al. Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia. Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

GTPase Atlastinehydrolyse du GTPimmobilisation de prot inesFRET intramol culaireFRET intermol culairefusion du r ticulum endoplasmiquer flexion interne totalecam ra EMCCD

Articles connexes