Ce protocole présente une méthode pour induire une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique et visualiser les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) dans les veinules mésentériques à l’aide de la microscopie intravitale. Le flux sanguin dans l’artère mésentérique supérieure a été limité pendant 1 h, suivi d’une reperfusion, permettant une quantification directe de l’adhésion leucocytaire et de la NETose.
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Article de méthode
Visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique par microscopie intravitale
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’ischémie-reperfusion intestinale (I/R) est une affection aiguë caractérisée par des lésions tissulaires résultant d’un flux sanguin restreint vers les vaisseaux mésentériques, entraînant des pathologies locales et systémiques de mauvais pronostic. L’ischémie et la reperfusion déclenchent toutes deux une série de réponses cellulaires et moléculaires, les cellules inflammatoires servant de régulateurs clés de la pathologie. Ces interactions avec l’endothélium ischémique sont médiées par de multiples récepteurs d’adhésion. Plusieurs modèles animaux ont été établis pour imiter cette pathologie et étudier les voies moléculaires impliquées. Dans cette étude, un modèle microchirurgical de lésion I/R est combiné à la microscopie intravitale pour visualiser le roulement des leucocytes, l’adhésion et la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (NET). Ce modèle est appliqué à des souris transgéniques déficientes en PAR1 endothélial (F2r) afin d’évaluer l’impact de PAR1 sur le roulement des leucocytes et la formation de TNE 1 h après l’ischémie et immédiatement après la reperfusion. In vivo, la coloration leucocytaire à l’orange acridine a été utilisée, et les TNE ont été visualisées à l’aide d’une coloration aux acides nucléiques. Il est intéressant de noter que l’adhésion réduite des leucocytes et la formation de TNE ont été observées chez des souris dépourvues du récepteur endothélial PAR1. Ce modèle permet l’analyse in vivo des principaux régulateurs impliqués dans les lésions I/R.
Introduction
L’ischémie mésentérique aiguë (IAM) est une pathologie rare1 à haut risque de mortalité2, caractérisée par une réduction du flux sanguin dans le mésentère due à une thrombolite dans l’axe cœliaque, ou dans l’artère mésentérique supérieure ou inférieure. Dans 60 à 70 % des cas, les occlusions aiguës de l’artère mésentérique supérieure dues à une thrombose ou à une embolisation sont responsables d’une ischémie intestinale aiguë3. En revanche, dans 5 à 15 % des cas, la thrombose veineuse mésentérique explique une ischémie mésentérique impliquant la veine mésentérique supérieure et, plus rarement, la veine mésentérique inférieure4. L’hypoxie et la malnutrition résultant de l’ischémie entraînent des troubles du métabolisme énergétique au niveau cellulaire5. Par exemple, une fonction mitochondriale altérée active plusieurs voies de signalisation, initiant des mécanismes de mort cellulaire6. Bien que la reperfusion rapide permette la restauration du métabolisme aérobie, la restauration du flux sanguin vers une région ischémique provoque souvent des lésions tissulaires étendues dues à la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)7, à la surcharge calcique8, au dysfonctionnement endothélial9 et aux réponses inflammatoires10.
De nombreux modèles animaux expérimentaux utilisant l’occlusion vasculaire temporaire de l’artère mésentérique supérieure ont été établis pour élucider les mécanismes moléculaires lors d’une lésion d’ischémie-reperfusion (I/R)11. L’utilisation de tels modèles en combinaison avec la microscopie intravitale (MIV) est fondamentale pour mieux comprendre les interactions cellulaires sous-jacentes et la progression de la maladie11. Un dysfonctionnement de la barrière intestinale est observé peu de temps après l’ischémie12, l’épithélium perdant son intégrité13, entraînant une translocation bactérienne vers des sites extra-intestinaux tels que les ganglions lymphatiques mésentériques, la rate, le foie et les reins12,14. La reperfusion aggrave encore la lésion de la muqueuse15. Une réponse inflammatoire dans les artérioles se manifeste par l’adhésion ferme et roulante des leucocytes sur la couche de cellules endothéliales, qui dépend de molécules telles que la L-sélectine16, la P-sélectine (CD62P)17, les plaquettes GPIIb/IIIa et le fibrinogène18. Il est intéressant de noter que l’adhésion des leucocytes aux veinules mésentériques est influencée par la présence du microbiote intestinal19 et de la signalisation10 du récepteur 4 de type Toll. Les lésions I/R déclenchent également la formation de pièges extracellulaires (NET) de neutrophiles10. Le ciblage thérapeutique de l’ADN extracellulaire, provenant de leucocytes activés tels que les neutrophiles, améliore l’issue des lésions intestinales I/R20. Dans le foie, les lésions I/R sont déclenchées par les microphagesrésidents 21, et l’inhibition des microARN atténue considérablement l’apoptose22. Il convient de noter que les lésions I/R dans le mésentère entraînent une dysbiose intestinale, qui est réversible et résolue après revascularisation23.
L’endothélium est également influencé par les effets néfastes des lésions I/R, les ROS jouant un rôle central dans le processus24. L’adhésion des leucocytes à la couche cellulaire endothéliale, des lésions endothéliales et des altérations du métabolisme de l’oxyde nitrique (NO) sont observées9. Cependant, les voies moléculaires impliquées n’ont pas encore été pleinement explorées.
Le récepteur 1 activé par la protéase (PAR1, F2r) est un récepteur membranaire exprimé par une variété de cellules, y compris les cellules endothéliales, et est activé pendant les conditions inflammatoires25. Son activation se produit lorsque les protéases à sérine clivent le récepteur à l’extrémité N-terminale, exposant le ligand attaché qui, à son tour, active le récepteur en se liant à la deuxième boucle extracellulaire de la molécule26. La voie de signalisation EPCR)-PAR1 du récepteur de la protéine C endothéliale a un impact sur l’homéostasie endothéliale du NO et facilite le rétablissement du flux sanguin dans l’ischémie périphérique27.
Dans cette étude, la lésion I/R a été appliquée à un modèle de souris génétique caractérisé par un déficit en PAR1 spécifique des cellules endothéliales afin de visualiser le roulement des leucocytes, l’adhésion et la formation de TNET. La combinaison d’un modèle génétique de souris et d’une microscopie intravitale après une microchirurgie I/R fournit des informations précieuses en mettant en évidence les types de cellules spécifiques impliqués dans la progression de la maladie. L’application des lésions I/R à des modèles génétiques de souris est essentielle pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui peuvent être utilisées pour améliorer l’évolution de la maladie. De plus, l’importance de PAR1 endothélial dans NETosis a été démontrée.
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Protocole
Toutes les procédures impliquant des souris ont été approuvées par le comité local de législation sur les animaux (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Coblence, Allemagne ; G21-1-041). B6 mâle et femelle âgés de 6 à 8 semaines. Des souris FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc ont été utilisées pour l’étude. La régulation spécifique des cellules endothéliales de F2r (PAR1) se produit via le promoteur VE-Cadherin Cre28. Dans cette étude, flox-F2r x VE-Cadherin Cre+ (F2RΔEC) a montré une expression réduite de F2r (PAR1) sur les cellules endothéliales, et flox-F2r x VE-Cadherin Cre- (WT) expriment des niveaux endothéliales normaux de F2r (PAR1). Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Préparation à l’opération
- Stérilisez les instruments chirurgicaux nécessaires (ciseaux extra étroits droits, pinces, pince vasculaire, etc.).
- Préparez le système d’anesthésie à base d’oxygène et d’isoflurane à l’aide d’un cône nasal et d’une plaque chauffante.
2. Préparation des animaux
- Pesez l’animal.
- Effectuer une anesthésie : Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale (i.p.) d’une solution contenant du midazolam (5 mg/kg), de la médétomidine (0,5 mg/mL) et du fentanyl (0,5 mg/kg) (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
- Retirez les poils de la zone d’opération du cou et de l’abdomen avec un rasoir électrique pour petits animaux.
- Positionnez la souris en position dorsale sur le coussin chauffant et connectez-la au système d’oxygène via un cône nasal. Fixez les membres de la souris à un coussin chauffant avec du ruban chirurgical. Assurez-vous que la membrane du cône nasal en latex s’adapte fermement à la tête de la souris. Surveillez la température corporelle de l’animal par voie rectale à l’aide d’un thermomètre spécifique aux rongeurs.
- Appliquez une crème dépilatoire pour enlever tous les poils restants de la zone chirurgicale du cou et essuyez la peau de la zone d’opération avec de l’éthanol à 70 %.
- Effectuez un test de pincement des orteils (réflexe de pédale) pour vous assurer que l’animal est complètement anesthésié.
3. Intervention chirurgicale
- Implantation d’un cathéter dans la veine jugulaire
- Faites une incision transversale (~0,5 cm) sur la trachée, retirez la peau recouvrant le cou et isolez la veine jugulaire droite.
- Utilisez un fil de soie d’environ 5 cm, fermez l’extrémité distale de la veine et fixez-la avec une pince chirurgicale. Placez trois fils de soie à environ 2 cm sous la veine : un près de l’extrémité distale et deux près de l’extrémité proximale de la veine jugulaire. Faites un nœud chirurgical, mais ne fermez pas le vaisseau.
- Préparez un cathéter en polyéthylène (0,28 mm de diamètre intérieur, 0,61 mm de diamètre extérieur) rempli de NaCl à 0,9 % et bouché à l’aide d’une seringue de 1 ml. Utilisez des ciseaux pour percer un trou entre le deuxième et le troisième nœud et implantez le cathéter dans la veine jugulaire. Aspirez la seringue pour vous assurer qu’il y a du sang dans le cathéter.
- Fixez le cathéter dans la veine en attachant le fil de soie, en vous assurant qu’il est solidement fixé. Utilisez du ruban adhésif médical pour fixer la seringue.
- Préparer l’orange acridine : diluer 1:4 une solution mère de 2 mg/mL avec une solution saline stérile (concentration finale de 0,5 mg/mL) dans une seringue de 1 mL. Gardez la seringue dans l’obscurité et injectez 50 μL dans la souris.
- Préparer le colorant d’acide nucléique : diluer une solution mère de 1:1000 à 5 mM avec une solution saline stérile (concentration finale de 5 μM) dans une seringue de 1 mL. Gardez la seringue dans l’obscurité et injectez 50 μL dans la souris.
- Injecter in vivo de l’orange acridine (50 μg/μL, 50 μL par souris) via le cathéter de la veine jugulaire pour visualiser les leucocytes colorés et un colorant fluorescent d’ADN extracellulaire de la même manière que pour colorer les pièges extracellulaires (TNE) des neutrophiles (5 μM, 50 μL par souris). Les TNE et les leucocytes sont imagés simultanément.
- Modèle de lésion mésentérique I/R
- Désinfectez la peau abdominale avec de l’éthanol à 70 %.
- Effectuez une laparotomie de 3 à 5 cm le long de la ligne blanche à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- À l’aide de deux cotons-tiges imbibés d’une solution saline, retirez délicatement l’intestin et identifiez un endroit où la couverture de graisse est minimale. Placez les petites branches intestinales sur une pâte noire pour réduire le signal de fond.
- Acquérez les vidéos avant I/R (pré-ischémie).
- Faites une compresse d’humidité avec du NaCl et placez-y l’intestin. Assurez-vous que l’intestin est entouré par la compresse et qu’il maintient l’humidité pendant l’étape 5.6.
- Occlure l’artère mésentérique supérieure à l’aide d’une petite pince vasculaire.
- Repoussez doucement l’intestin dans la cavité abdominale à l’aide de cotons-tiges humidifiés dans une solution saline et utilisez une suture 7-0 pour fermer la paroi abdominale afin d’éviter la perte d’humidité et de température. Maintenez l’ischémie pendant 60 min, en vérifiant l’anesthésie au moins toutes les 20 min.
- Après 1 h, amorcez la reperfusion en retirant la pince.
REMARQUE : L’exécution correcte de la procédure d’ischémie entraîne un changement visible. Au début, la zone touchée apparaîtra pâle ou blanche en raison du manque de circulation sanguine. Lors du retrait de la pince, le flux sanguin reviendra progressivement vers la région ischémique, qui retrouvera sa couleur normale, signifiant une occlusion réussie. Il est impératif d’observer de près la souris en permanence tout au long de la phase d’ischémie. - Après la période ischémique, appliquez quelques gouttes de solution saline sur la zone coupée, puis retirez délicatement les clips microvasculaires à l’aide d’un applicateur à clip.
- À l’aide d’embouts en coton imbibés de solution saline, retirez à nouveau délicatement l’intestin, positionnez les petites branches de la veine sur une pâte noire, injectez à nouveau 50 μL d’orange d’acridine et capturez les vidéos de la même veine au même endroit (post-ischémie).
4. Microscopie à épifluorescence vidéo intravitale à grande vitesse
- Visualisez les leucocytes et les TNE à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ à grande vitesse équipé d’un condenseur longue distance, d’un monochromateur, d’un objectif à immersion dans l’eau 10x et d’une caméra à dispositif à couplage de charge. L’acquisition de l’image a été réalisée avec un temps d’exposition de 30 ms et des filtres Alexa Fluor 488 (495/519) et Rouge Rhodamine (570/590).
- Utilisez un logiciel d’imagerie pour l’acquisition et l’analyse d’images.
- Quantifier le recrutement cellulaire dans une région d’intérêt de 0,06 mm².
- Quantifier les leucocytes adhérents comme des cellules restant stationnaires ou attachées à la muqueuse endothéliale pendant une période d’observation de 20 s.
- Identifier les TNE comme des structures extracellulaires marquées à l’aide de colorants fluorescents d’acide nucléique leucocytaire et extracellulaire.
- Euthanasier les animaux par luxation cervicale à la fin de l’expérience (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).
5. Isolement des cellules endothéliales hépatiques (LEC) et RT-PCR quantitative
- Isolez les LEC via le tri magnétique des cellules (MACS)29.
- Isolez l’ARN total.
- Effectuez la synthèse d’ADN complémentaire (ADNc)27 en mélangeant 2 μg d’ARN total avec 2 μL de tampon RT, 0,8 μL de mélange dNTP, 2 μL d’amorces aléatoires RT, 1 μL de transcriptase inverse et 4,2 μL de H2O distillé stérile.
- La transcription de l’ADNc a été réalisée dans les conditions suivantes : 25 °C pendant 10 min, 37 °C pendant 120 min, 85 °C pendant 5 min.
- Utilisez 20 ng d’ADNc pour la qPCR.
- Utilisez les amorces suivantes : F2r (avant) : TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r (arrière) : CCAGCAGGACGCTTTTTTTTTT, L32 (avant) : CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (arrière) : TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. Utilisez les conditions suivantes : 95 °C 30 s, 45 cycles de (95 °C pendant 10 s, 60 °C pendant 25 s), 60 °C à 95 °C pendant 6 s avec ΔΤ 1 °C.
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Résultats
Pour étudier les effets dépendants des cellules endothéliales sur le roulement et l’adhésion des leucocytes ainsi que sur la formation de NET, l’efficacité du déficit en F2r inductible par VE-Cadherin Cre a été initialement examinée dans les cellules endothéliales. Le tri magnétique des cellules a été utilisé pour isoler les cellules endothéliales hépatiques. Par la suite, l’ARN a été isolé, suivi d’une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). Les souris F2rΔEC , chez lesquelles la recombina...
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Discussion
La lésion mésentérique I/R combinée à la microscopie intravitale a été appliquée à un modèle murin génétique de déficit en F2r (PAR1) dans les cellules endothéliales pour l’analyse in vivo des leucocytes et des TNE après 1 h d’ischémie. Le modèle de lésion mésentérique I/R est fréquemment utilisé chez les rongeurs, les temps d’ischémie et de reperfusion variant de quelques minutes à plusieurs heures23,31, influe...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne divulguent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
C.R. remercie le financement de la Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz et ReALity (projet MORE), du BMBF Cluster4Future CurATime (projet MicrobAIome ; 03ZU1202CA), de la Wilhelm Sander-Stiftung (n° 2022.131.1) et du Fonds d’innovation Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung (DZG) « Microbiome » (81X2210129). C.R. est scientifique au Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK). C.R. est membre du Center for Translational Vascular Biology (CTVB), du Research Center for Immunotherapy (FZI) et du Potentialbereich EXPOHEALTH de l’Université Johannes Gutenberg de Mayence. C.R. est membre de l’Unité de Recherche DFG 5644 INFINITE (RE 3450/15-1). C.R. a reçu une bourse du Collège de recherche Gutenberg de l’Université Johannes Gutenberg de Mayence. K.K. est soutenu par le programme d’excellence « Promotion des femmes scientifiques » de la DZHK et est membre de Young DZHK. Z.G et O.D. sont doctorants à l’École de recherche en biomédecine translationnelle de Mayence (TransMed).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Orange acridine | Sigma-Aldrich ; | ; A-6014 | |
| Plaque à 96 puits Multiply PCR-Platten ; | Sarstedt | 721977202.00 | |
| Systèmes d’anesthésie pour rongeurs | GROPPLER medizintechnik | Uni Vet -Porta T-8 | |
| Aqua ad injectabilia IVM | B Braun Melsungen | 53402101 | |
| pâte à | noire Staedtler | Pâte à modeler | |
| CD146 Microbilles, souris | Miltenyi Biotec | 130-092-007 | |
| cellSens | Olympus Olympus | cellSense Dimension Desktop 2.3 | logiciel |
| à couplage de charge | appareil photo Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
| appareil tampons en coton | Bö ; ttger | 09-119-9100 | |
| Boîtier incurvé 125mm/5" | Indigo Instruments ; | 22466 | |
| Crème dépilatoire | Balea | sans objet | |
| Dorbene Vet | zoetis | ||
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Éthanol p.a. 99,5 % | Roth | 5504.20 | |
| Ciseaux extra étroits &ndash ; Droit/Sharp-Sharp/10.5 | FST | 14088-10 | |
| Fentanyl | Janssen-Cilag GmBH | ||
| Forceps « Dumont #5 » (Inox, pointe 0.1mm, longueur 11 cm) | FST | 11251-20 | |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Graphpadprism | Graphpad | Prism 10 | software |
| isoflurane ; | Piramal | 4150097146757.00 | |
| iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5ml | BioRad | 1725125.00 | |
| Leukofix medical tape | BSNMedical | 0213600 | |
| Kit de dissociation du foie, souris | Miltenyi Biotec | 130-105-807 | |
| LS-Colonnes de séparation MACS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Smart Strainer 100 et micro ; m | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Microseal B Seal Seals | Biorad | MSB1001 | |
| Midazolam | hameln | 5918501.00 | |
| NaCl | Braun | 2350748 | |
| Porte-aiguille | FST | 12001-13 | |
| Suture en soie tressée non résorbable, Taille : 7/0, 91 Mètres ; | Fine Science Tools | 18020-70 | |
| Olympus BX51WI microscope à fluorescence | Olympus | microscope | |
| PCR pour bandelettes de tubes | Sarstedt | 72985002.00 | |
| Couvercles de tubes PCR | Sarstedt | 65989002.00 | |
| Cathéter en pliéthylène | Smith Medical Deutschland GmbH | 800/100/100 | |
| Prolene (8648G), Polypropylène 6-0, Nahtmaterial ; | Johnson & Johnson Medical GmbH ; | 8695H | |
| Relia Prep RNA Miniprep Systems | Promega | Z6112 | |
| Kit de Tanscription Inversée (ADNc Haute Capacité) | Applied Biosystems | 4368813.00 | |
| Balance pour école ; | KERN & SOHN GmbH | EMB 500-1 | |
| Ciseaux à ressort - Coudés sur le côté | FST | 15006-09 | |
| Stéréomicroscope | Leica | M50 | |
| Hémostats droits 135mm/5.5" | Indigo Instruments ; | 22468 | |
| Seringue 1 mL | Braun | 9166017V | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Régulateur de température TC-1000 | FMI Fö ; hr Medical Instruments GmbH | non applicable | |
| Pince à tissus - 1x2 dents | FST | 18057-14 | |
| pince vasculaire | Fine Science Tools | 18055-02 | |
| Vetiva mini | WAHL | 1584-0480 |
Références
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