Visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique par microscopie intravitale

Résumé

Ce protocole présente une méthode pour induire une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique et visualiser les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) dans les veinules mésentériques à l’aide de la microscopie intravitale. Le flux sanguin dans l’artère mésentérique supérieure a été limité pendant 1 h, suivi d’une reperfusion, permettant une quantification directe de l’adhésion leucocytaire et de la NETose.

Résumé

L’ischémie-reperfusion intestinale (I/R) est une affection aiguë caractérisée par des lésions tissulaires résultant d’un flux sanguin restreint vers les vaisseaux mésentériques, entraînant des pathologies locales et systémiques de mauvais pronostic. L’ischémie et la reperfusion déclenchent toutes deux une série de réponses cellulaires et moléculaires, les cellules inflammatoires servant de régulateurs clés de la pathologie. Ces interactions avec l’endothélium ischémique sont médiées par de multiples récepteurs d’adhésion. Plusieurs modèles animaux ont été établis pour imiter cette pathologie et étudier les voies moléculaires impliquées. Dans cette étude, un modèle microchirurgical de lésion I/R est combiné à la microscopie intravitale pour visualiser le roulement des leucocytes, l’adhésion et la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (NET). Ce modèle est appliqué à des souris transgéniques déficientes en PAR1 endothélial (F2r) afin d’évaluer l’impact de PAR1 sur le roulement des leucocytes et la formation de TNE 1 h après l’ischémie et immédiatement après la reperfusion. In vivo, la coloration leucocytaire à l’orange acridine a été utilisée, et les TNE ont été visualisées à l’aide d’une coloration aux acides nucléiques. Il est intéressant de noter que l’adhésion réduite des leucocytes et la formation de TNE ont été observées chez des souris dépourvues du récepteur endothélial PAR1. Ce modèle permet l’analyse in vivo des principaux régulateurs impliqués dans les lésions I/R.

Introduction

L’ischémie mésentérique aiguë (IAM) est une pathologie rare¹ à haut risque de mortalité², caractérisée par une réduction du flux sanguin dans le mésentère due à une thrombolite dans l’axe cœliaque, ou dans l’artère mésentérique supérieure ou inférieure. Dans 60 à 70 % des cas, les occlusions aiguës de l’artère mésentérique supérieure dues à une thrombose ou à une embolisation sont responsables d’une ischémie intestinale aiguë³. En revanche, dans 5 à 15 % des cas, la thrombose veineuse mésentérique explique une ischémie mésentérique impliquant la veine mésentérique supérieure et, plus rarement, la veine mésentérique inférieure⁴. L’hypoxie et la malnutrition résultant de l’ischémie entraînent des troubles du métabolisme énergétique au niveau cellulaire⁵. Par exemple, une fonction mitochondriale altérée active plusieurs voies de signalisation, initiant des mécanismes de mort cellulaire⁶. Bien que la reperfusion rapide permette la restauration du métabolisme aérobie, la restauration du flux sanguin vers une région ischémique provoque souvent des lésions tissulaires étendues dues à la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)⁷, à la surcharge calcique⁸, au dysfonctionnement endothélial⁹ et aux réponses inflammatoires¹⁰.

De nombreux modèles animaux expérimentaux utilisant l’occlusion vasculaire temporaire de l’artère mésentérique supérieure ont été établis pour élucider les mécanismes moléculaires lors d’une lésion d’ischémie-reperfusion (I/R)¹¹. L’utilisation de tels modèles en combinaison avec la microscopie intravitale (MIV) est fondamentale pour mieux comprendre les interactions cellulaires sous-jacentes et la progression de la maladie¹¹. Un dysfonctionnement de la barrière intestinale est observé peu de temps après l’ischémie¹², l’épithélium perdant son intégrité¹³, entraînant une translocation bactérienne vers des sites extra-intestinaux tels que les ganglions lymphatiques mésentériques, la rate, le foie et les reins^12,14. La reperfusion aggrave encore la lésion de la muqueuse¹⁵. Une réponse inflammatoire dans les artérioles se manifeste par l’adhésion ferme et roulante des leucocytes sur la couche de cellules endothéliales, qui dépend de molécules telles que la L-sélectine¹⁶, la P-sélectine (CD62P)¹⁷, les plaquettes GPIIb/IIIa et le fibrinogène¹⁸. Il est intéressant de noter que l’adhésion des leucocytes aux veinules mésentériques est influencée par la présence du microbiote intestinal¹⁹ et de la signalisation¹⁰ du récepteur 4 de type Toll. Les lésions I/R déclenchent également la formation de pièges extracellulaires (NET) de neutrophiles¹⁰. Le ciblage thérapeutique de l’ADN extracellulaire, provenant de leucocytes activés tels que les neutrophiles, améliore l’issue des lésions intestinales I/R²⁰. Dans le foie, les lésions I/R sont déclenchées par les microphages^{résidents 21}, et l’inhibition des microARN atténue considérablement l’apoptose²². Il convient de noter que les lésions I/R dans le mésentère entraînent une dysbiose intestinale, qui est réversible et résolue après revascularisation²³.

L’endothélium est également influencé par les effets néfastes des lésions I/R, les ROS jouant un rôle central dans le processus²⁴. L’adhésion des leucocytes à la couche cellulaire endothéliale, des lésions endothéliales et des altérations du métabolisme de l’oxyde nitrique (NO) sont observées⁹. Cependant, les voies moléculaires impliquées n’ont pas encore été pleinement explorées.

Le récepteur 1 activé par la protéase (PAR1, F2r) est un récepteur membranaire exprimé par une variété de cellules, y compris les cellules endothéliales, et est activé pendant les conditions inflammatoires²⁵. Son activation se produit lorsque les protéases à sérine clivent le récepteur à l’extrémité N-terminale, exposant le ligand attaché qui, à son tour, active le récepteur en se liant à la deuxième boucle extracellulaire de la molécule²⁶. La voie de signalisation EPCR)-PAR1 du récepteur de la protéine C endothéliale a un impact sur l’homéostasie endothéliale du NO et facilite le rétablissement du flux sanguin dans l’ischémie périphérique²⁷.

Dans cette étude, la lésion I/R a été appliquée à un modèle de souris génétique caractérisé par un déficit en PAR1 spécifique des cellules endothéliales afin de visualiser le roulement des leucocytes, l’adhésion et la formation de TNET. La combinaison d’un modèle génétique de souris et d’une microscopie intravitale après une microchirurgie I/R fournit des informations précieuses en mettant en évidence les types de cellules spécifiques impliqués dans la progression de la maladie. L’application des lésions I/R à des modèles génétiques de souris est essentielle pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui peuvent être utilisées pour améliorer l’évolution de la maladie. De plus, l’importance de PAR1 endothélial dans NETosis a été démontrée.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des souris ont été approuvées par le comité local de législation sur les animaux (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Coblence, Allemagne ; G21-1-041). B6 mâle et femelle âgés de 6 à 8 semaines. Des souris FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc ont été utilisées pour l’étude. La régulation spécifique des cellules endothéliales de F2r (PAR1) se produit via le promoteur VE-Cadherin Cre²⁸. Dans cette étude, flox-F2r x VE-Cadherin Cre⁺ (F2R^ΔEC) a montré une expression réduite de F2r (PAR1) sur les cellules endothéliales, et flox-F2r x VE-Cadherin Cre^- (WT) expriment des niveaux endothéliales normaux de F2r (PAR1). Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation à l’opération

1. Stérilisez les instruments chirurgicaux nécessaires (ciseaux extra étroits droits, pinces, pince vasculaire, etc.).
2. Préparez le système d’anesthésie à base d’oxygène et d’isoflurane à l’aide d’un cône nasal et d’une plaque chauffante.

2. Préparation des animaux

1. Pesez l’animal.
2. Effectuer une anesthésie : Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale (i.p.) d’une solution contenant du midazolam (5 mg/kg), de la médétomidine (0,5 mg/mL) et du fentanyl (0,5 mg/kg) (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
3. Retirez les poils de la zone d’opération du cou et de l’abdomen avec un rasoir électrique pour petits animaux.
4. Positionnez la souris en position dorsale sur le coussin chauffant et connectez-la au système d’oxygène via un cône nasal. Fixez les membres de la souris à un coussin chauffant avec du ruban chirurgical. Assurez-vous que la membrane du cône nasal en latex s’adapte fermement à la tête de la souris. Surveillez la température corporelle de l’animal par voie rectale à l’aide d’un thermomètre spécifique aux rongeurs.
5. Appliquez une crème dépilatoire pour enlever tous les poils restants de la zone chirurgicale du cou et essuyez la peau de la zone d’opération avec de l’éthanol à 70 %.
6. Effectuez un test de pincement des orteils (réflexe de pédale) pour vous assurer que l’animal est complètement anesthésié.

3. Intervention chirurgicale

1. Implantation d’un cathéter dans la veine jugulaire
   1. Faites une incision transversale (~0,5 cm) sur la trachée, retirez la peau recouvrant le cou et isolez la veine jugulaire droite.
   2. Utilisez un fil de soie d’environ 5 cm, fermez l’extrémité distale de la veine et fixez-la avec une pince chirurgicale. Placez trois fils de soie à environ 2 cm sous la veine : un près de l’extrémité distale et deux près de l’extrémité proximale de la veine jugulaire. Faites un nœud chirurgical, mais ne fermez pas le vaisseau.
   3. Préparez un cathéter en polyéthylène (0,28 mm de diamètre intérieur, 0,61 mm de diamètre extérieur) rempli de NaCl à 0,9 % et bouché à l’aide d’une seringue de 1 ml. Utilisez des ciseaux pour percer un trou entre le deuxième et le troisième nœud et implantez le cathéter dans la veine jugulaire. Aspirez la seringue pour vous assurer qu’il y a du sang dans le cathéter.
   4. Fixez le cathéter dans la veine en attachant le fil de soie, en vous assurant qu’il est solidement fixé. Utilisez du ruban adhésif médical pour fixer la seringue.
   5. Préparer l’orange acridine : diluer 1:4 une solution mère de 2 mg/mL avec une solution saline stérile (concentration finale de 0,5 mg/mL) dans une seringue de 1 mL. Gardez la seringue dans l’obscurité et injectez 50 μL dans la souris.
   6. Préparer le colorant d’acide nucléique : diluer une solution mère de 1:1000 à 5 mM avec une solution saline stérile (concentration finale de 5 μM) dans une seringue de 1 mL. Gardez la seringue dans l’obscurité et injectez 50 μL dans la souris.
   7. Injecter in vivo de l’orange acridine (50 μg/μL, 50 μL par souris) via le cathéter de la veine jugulaire pour visualiser les leucocytes colorés et un colorant fluorescent d’ADN extracellulaire de la même manière que pour colorer les pièges extracellulaires (TNE) des neutrophiles (5 μM, 50 μL par souris). Les TNE et les leucocytes sont imagés simultanément.
2. Modèle de lésion mésentérique I/R
   1. Désinfectez la peau abdominale avec de l’éthanol à 70 %.
   2. Effectuez une laparotomie de 3 à 5 cm le long de la ligne blanche à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
   3. À l’aide de deux cotons-tiges imbibés d’une solution saline, retirez délicatement l’intestin et identifiez un endroit où la couverture de graisse est minimale. Placez les petites branches intestinales sur une pâte noire pour réduire le signal de fond.
   4. Acquérez les vidéos avant I/R (pré-ischémie).
   5. Faites une compresse d’humidité avec du NaCl et placez-y l’intestin. Assurez-vous que l’intestin est entouré par la compresse et qu’il maintient l’humidité pendant l’étape 5.6.
   6. Occlure l’artère mésentérique supérieure à l’aide d’une petite pince vasculaire.
   7. Repoussez doucement l’intestin dans la cavité abdominale à l’aide de cotons-tiges humidifiés dans une solution saline et utilisez une suture 7-0 pour fermer la paroi abdominale afin d’éviter la perte d’humidité et de température. Maintenez l’ischémie pendant 60 min, en vérifiant l’anesthésie au moins toutes les 20 min.
   8. Après 1 h, amorcez la reperfusion en retirant la pince.
      REMARQUE : L’exécution correcte de la procédure d’ischémie entraîne un changement visible. Au début, la zone touchée apparaîtra pâle ou blanche en raison du manque de circulation sanguine. Lors du retrait de la pince, le flux sanguin reviendra progressivement vers la région ischémique, qui retrouvera sa couleur normale, signifiant une occlusion réussie. Il est impératif d’observer de près la souris en permanence tout au long de la phase d’ischémie.
   9. Après la période ischémique, appliquez quelques gouttes de solution saline sur la zone coupée, puis retirez délicatement les clips microvasculaires à l’aide d’un applicateur à clip.
   10. À l’aide d’embouts en coton imbibés de solution saline, retirez à nouveau délicatement l’intestin, positionnez les petites branches de la veine sur une pâte noire, injectez à nouveau 50 μL d’orange d’acridine et capturez les vidéos de la même veine au même endroit (post-ischémie).

4. Microscopie à épifluorescence vidéo intravitale à grande vitesse

1. Visualisez les leucocytes et les TNE à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ à grande vitesse équipé d’un condenseur longue distance, d’un monochromateur, d’un objectif à immersion dans l’eau 10x et d’une caméra à dispositif à couplage de charge. L’acquisition de l’image a été réalisée avec un temps d’exposition de 30 ms et des filtres Alexa Fluor 488 (495/519) et Rouge Rhodamine (570/590).
2. Utilisez un logiciel d’imagerie pour l’acquisition et l’analyse d’images.
3. Quantifier le recrutement cellulaire dans une région d’intérêt de 0,06 mm².
4. Quantifier les leucocytes adhérents comme des cellules restant stationnaires ou attachées à la muqueuse endothéliale pendant une période d’observation de 20 s.
5. Identifier les TNE comme des structures extracellulaires marquées à l’aide de colorants fluorescents d’acide nucléique leucocytaire et extracellulaire.
6. Euthanasier les animaux par luxation cervicale à la fin de l’expérience (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).

5. Isolement des cellules endothéliales hépatiques (LEC) et RT-PCR quantitative

1. Isolez les LEC via le tri magnétique des cellules (MACS)²⁹.
2. Isolez l’ARN total.
3. Effectuez la synthèse d’ADN complémentaire (ADNc)²⁷ en mélangeant 2 μg d’ARN total avec 2 μL de tampon RT, 0,8 μL de mélange dNTP, 2 μL d’amorces aléatoires RT, 1 μL de transcriptase inverse et 4,2 μL de H₂O distillé stérile.
4. La transcription de l’ADNc a été réalisée dans les conditions suivantes : 25 °C pendant 10 min, 37 °C pendant 120 min, 85 °C pendant 5 min.
5. Utilisez 20 ng d’ADNc pour la qPCR.
6. Utilisez les amorces suivantes : F2r (avant) : TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r (arrière) : CCAGCAGGACGCTTTTTTTTTT, L32 (avant) : CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (arrière) : TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. Utilisez les conditions suivantes : 95 °C 30 s, 45 cycles de (95 °C pendant 10 s, 60 °C pendant 25 s), 60 °C à 95 °C pendant 6 s avec ΔΤ 1 °C.

Résultats

Pour étudier les effets dépendants des cellules endothéliales sur le roulement et l’adhésion des leucocytes ainsi que sur la formation de NET, l’efficacité du déficit en F2r inductible par VE-Cadherin Cre a été initialement examinée dans les cellules endothéliales. Le tri magnétique des cellules a été utilisé pour isoler les cellules endothéliales hépatiques. Par la suite, l’ARN a été isolé, suivi d’une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). Les souris F2r^ΔEC , chez lesquelles la recombinase Cre exprimée sous le contrôle du promoteur VE-Cadhérine est absente, ont montré des niveaux d’ARNm F2r (PAR1) significativement réduits (environ d’un tiers) par rapport aux témoins WT (Figure 1).

Après confirmation de la déficience dans la lignée de souris, une lésion mésentérique I/R a été réalisée pour examiner l’impact de PAR1 exprimé par les cellules endothéliales vasculaires sur le roulement et l’adhésion des leucocytes, visualisé par microscopie intravitale (Figure 2A,B). Après 1 h d’ischémie, la pince a été retirée et le récipient a été laissé reperfuser. Le roulement et l’adhérence des leucocytes ont été observés et enregistrés (colorés en vert, indiqués par des flèches blanches). Bien que les deux groupes aient montré une augmentation du nombre de leucocytes adhérents après une lésion I/R, le déficit en F2r endothélial (PAR1) a entraîné une diminution marquée mais non significative de l’adhésion des leucocytes à l’endothélium mésentérique activé par I/R, suggérant un rôle actif de l’activation endothéliale de PAR1 dans le recrutement des leucocytes dans les veinules mésentériques ischémiques (Figure 2C).

L’objectif suivant était d’examiner si l’expression endothéliale de PAR1 régule la formation de TNE induite par les lésions I/R. Par conséquent, les acides nucléiques extracellulaires ont été colorés avec un colorant imperméable aux cellules³⁰, et les TNE générées ont été visualisées à l’aide de la microscopie intravitale (indiquée par des flèches noires) (Figure 2A, B). Après une lésion I/R, des TNE n’ont été observées que dans le groupe WT exprimant des niveaux normaux de PAR1 sur les cellules endothéliales, indiquant un rôle régulateur de PAR1 dans la NETosis (Figure 2C, D). Notamment, lorsque l’expression endothéliale de F2r a été supprimée, aucune TNE n’était présente dans les veinules mésentériques endommagées par l’I/R.

Figure 1 : Expression de l’ARNm F2r (PAR1). Expression des cellules endothéliales hépatiques F2r des souris WT (n = 6) et F2r^ΔEC (n = 9) par rapport au gène L32 housekeeping. Les données sont présentées sous forme de médiane avec un intervalle de confiance de 95 %. Le test de Mann-Whitney a été utilisé pour comparer deux groupes indépendants, *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Le PAR1 endothélial affecte l’adhésion des leucocytes et la formation de TNE dans les veinules mésentériques endommagées par l’I/R. Images représentatives de la microscopie intravitale de leucocytes adhérents colorés à l’orange acridine (flèches blanches) et de TNE colorées à l’orange Sytox (flèches noires) de souris WT et F2r^ΔEC avant (avant) et après (post) lésion I/R (A) 10x et (B) grossissement 20x. Barres d’échelle : A, 50 μm ; B, 20 μm. (C) Adhérence des leucocytes et (D) TNE par mm² de souris WT (n = 7) et F2r^ΔEC (n = 4) avant (avant) et après (après) lésion I/R. Toutes les données ont été représentées sous forme de médiane avec un intervalle de confiance de 95 %. Des comparaisons statistiques ont été effectuées à l’aide du test ANOVA à deux facteurs, **p< 0,01, et des tests de comparaison multiples de Sídák pour comparer les moyennes de différents génotypes à chaque point temporel (pré et post-ischémie). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La lésion mésentérique I/R combinée à la microscopie intravitale a été appliquée à un modèle murin génétique de déficit en F2r (PAR1) dans les cellules endothéliales pour l’analyse in vivo des leucocytes et des TNE après 1 h d’ischémie. Le modèle de lésion mésentérique I/R est fréquemment utilisé chez les rongeurs, les temps d’ischémie et de reperfusion variant de quelques minutes à plusieurs heures^23,31, influençant l’issue inflammatoire³² et la mortalité³³. Le modèle dépend également de plusieurs facteurs, notamment le microbiote^19,34, les récepteurs immunitaires 10,35,36,37, le sexe 38,39 et l’âge ³⁵. Outre la variation des temps I/R, une autre variable de ce modèle est la réponse différentielle des différentes parties de l’intestin aux blessures, l’intestin grêle présentant des lésions muqueuses plus importantes que le côlon⁴⁰. Le positionnement de l’attache microvasculaire affectant la région ischémique est crucial pour la reproductibilité de la méthode^32,33. Il est important de noter qu’une occlusion supérieure de l’artère mésentérique combinée à une interruption du flux collatéral produit des taux de mortalité qui sont constamment liés à la durée de l’ischémie⁴¹.

Dans cette étude, des souris ont été soumises à 1 h d’ischémie, et l’adhésion leucocytaire in vivo et la formation de TNE ont été visualisées immédiatement après la reperfusion pour examiner la réponse inflammatoire précoce déclenchée par l’état ischémique en l’absence d’expression endothéliale de F2r . L’application de ces méthodes à des modèles génétiques de souris permet d’étudier comment certaines molécules cibles affectent le comportement cellulaire et la réponse inflammatoire à la fois après l’ischémie et pendant la reperfusion.

Le protocole comporte plusieurs étapes critiques, notamment le maintien de l’intégrité intestinale. La manipulation de l’intestin doit être faite en douceur pour éviter d’endommager les tissus. À cette fin, les cotons-tiges humides sont l’outil approprié pour détacher temporairement l’intestin de la cavité abdominale. Il est crucial que l’intestin reste humide jusqu’à ce qu’il soit repositionné dans l’abdomen. Des blessures mineures dues à la manipulation peuvent déclencher l’activation de divers types de cellules, telles que les plaquettes et les cellules endothéliales, ce qui peut affecter les résultats.

Pour plus de cohérence, il est crucial de visualiser le même site de segments intestinaux avant et après l’ischémie. Cela peut être difficile car l’intestin est repositionné dans la cavité abdominale après une ischémie. Pour résoudre ce problème, une approche consiste à placer un petit morceau de compresse humide sur la partie de l’intestin qui a été visualisée avant l’ischémie.

Pour visualiser le roulement et l’adhésion des leucocytes ainsi que la formation de TNE in vivo, des souris ont reçu une injection d’un colorant de fluorescence de leucocytes et d’un colorant de fluorescence d’acide nucléique via la veine jugulaire. Le colorant leucocytaire (voir tableau des matériaux) est un colorant de fluorescence métachromatique perméable aux cellules qui se lie aux globules blancs mais pas aux globules rouges et a été largement utilisé pour colorer les leucocytes in vivo^17,42. Le colorant est appliqué par voie intraveineuse et procure une forte coloration des leucocytes en quelques secondes. Cependant, la spécificité peut être une limitation car elle colore également d’autres cellules nucléées, telles que les cellules endothéliales. Néanmoins, les cellules circulatoires conservent la coloration plus longtemps en raison d’un effet de lavage⁴³. Le colorant de fluorescence d’acide nucléique (voir Tableau des matériaux) est une coloration d’acide nucléique imperméable aux cellules couramment utilisée pour visualiser la formation de TNE 30,44,45. Il peut également être appliqué par voie intraveineuse, se lie avec une grande affinité et est rapide et facile à utiliser. Encore une fois, la spécificité est un inconvénient car le colorant se liera à toute cellule avec une membrane non intacte. Idéalement, il devrait être associé à un marqueur de neutrophiles (par exemple, CD15, CD11b) ou à un marqueur de NETosis (par exemple, des anticorps anti-citH3) pour améliorer la spécificité. Ces colorants permettent l’imagerie in vivo des leucocytes dans les veinules mésentériques d’animaux de laboratoire.

La principale limitation de la technique est la présence de graisse viscérale, ce qui restreint la visualisation des capillaires intestinaux et entrave considérablement l’acquisition d’images. Pour éviter cette complication, il est nécessaire d’utiliser de jeunes animaux de laboratoire (âgés de 6 à 8 semaines) qui ont une formation de graisse viscérale réduite. De plus, l’analyse histologique ex vivo est entravée par l’utilisation de la coloration in vivo . Une autre limitation est l’impact du microbiote intestinal et de l’alimentation sur ce modèle, qui peut varier fortement entre les différents élevages de souris⁴⁶. Pour remédier à cette limitation, l’étude de modèles murins gnotobiotiques pourrait être considérée^{comme 10}.

Dans cette étude, la réponse cellulaire immédiate a été étudiée après l’ischémie, et une réduction du dépôt de leucocytes à l’endothélium mésentérique activé et la formation de TNE ont été observées in vivo. La dégradation des TNE par administration intraveineuse de DNase 1 h après l’ischémie réduit la réponse pro-inflammatoire précoce et améliore la perturbation de la barrière intestinale⁴⁷. Il convient de noter que le traitement à la thrombomoduline, une glycoprotéine transmembranaire qui inhibe l’activité de la thrombine⁴⁸, a amélioré la survie des souris présentant de graves lésions intestinales I/R, atténuant la réponse inflammatoire de la dysfonction endothéliale et réduisant l’accumulation intense d’histones dans les organes distants⁴⁹. Ici, il a été démontré que le récepteur endothélial de la thrombine influence le résultat I/R, soulignant l’importance de combiner le modèle de lésion intestinale I/R avec la microscopie intravitale chez des souris génétiquement modifiées pour étudier d’importants médiateurs de la pathologie de la maladie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Orange acridine	Sigma-Aldrich  ;	; A-6014
Plaque à 96 puits Multiply PCR-Platten  ;	Sarstedt	721977202.00
Systèmes d’anesthésie pour rongeurs	GROPPLER medizintechnik	Uni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVM	B Braun Melsungen	53402101
pâte à	noire Staedtler		Pâte à modeler
CD146 Microbilles, souris	Miltenyi Biotec	130-092-007
cellSens	Olympus Olympus	cellSense Dimension Desktop 2.3	logiciel
à couplage de charge	appareil photo Hamamatsu Photonics	ORCA-R2
appareil tampons en coton	Bö ; ttger	09-119-9100
Boîtier incurvé 125mm/5"	Indigo Instruments  ;	22466
Crème dépilatoire	Balea	sans objet
Dorbene Vet	zoetis
Dumont Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Éthanol p.a. 99,5 %	Roth	5504.20
Ciseaux extra étroits &ndash ; Droit/Sharp-Sharp/10.5	FST	14088-10
Fentanyl	Janssen-Cilag GmBH
Forceps « Dumont #5 » (Inox, pointe 0.1mm, longueur 11 cm)	FST	11251-20
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-236
Graphpadprism	Graphpad	Prism 10	software
isoflurane  ;	Piramal	4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5ml	BioRad	1725125.00
Leukofix medical tape	BSNMedical	0213600
Kit de dissociation du foie, souris	Miltenyi Biotec	130-105-807
LS-Colonnes de séparation MACS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Smart Strainer 100 et micro ; m	Miltenyi Biotec	130-098-463
Microseal B Seal Seals	Biorad	MSB1001
Midazolam	hameln	5918501.00
NaCl	Braun	2350748
Porte-aiguille	FST	12001-13
Suture en soie tressée non résorbable, Taille : 7/0, 91 Mètres  ;	Fine Science Tools	18020-70
Olympus BX51WI microscope à fluorescence	Olympus		microscope
PCR pour bandelettes de tubes	Sarstedt	72985002.00
Couvercles de tubes PCR	Sarstedt	65989002.00
Cathéter en pliéthylène	Smith Medical Deutschland GmbH	800/100/100
Prolene (8648G), Polypropylène 6-0, Nahtmaterial  ;	Johnson & Johnson Medical GmbH  ;	8695H
Relia Prep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6112
Kit de Tanscription Inversée (ADNc Haute Capacité)	Applied Biosystems	4368813.00
Balance pour école  ;	KERN & SOHN GmbH	EMB 500-1
Ciseaux à ressort - Coudés sur le côté	FST	15006-09
Stéréomicroscope	Leica	M50
Hémostats droits 135mm/5.5"	Indigo Instruments  ;	22468
Seringue 1 mL	Braun	9166017V
SYTOX Orange	Thermo Fisher Scientific	S11368
Régulateur de température TC-1000	FMI Fö ; hr Medical Instruments GmbH	non applicable
Pince à tissus - 1x2 dents	FST	18057-14
pince vasculaire	Fine Science Tools	18055-02
Vetiva mini	WAHL	1584-0480