Utilisation de Mycobacterium smegmatis comme bioindicateur des conditions de croissance limitées en zinc chez les mycobactéries

Allexa D. Burger; Jayna Wong; Endrei Marcantonio; Sladjana Prisic

doi:10.3791/67274

Article de méthode

Utilisation de Mycobacterium smegmatis comme bioindicateur des conditions de croissance limitées en zinc chez les mycobactéries

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DOI :

10.3791/67274

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20 septembre 2024

Allexa D. Burger^*¹ , Jayna Wong^*¹ , Endrei Marcantonio¹ , Sladjana Prisic¹

¹School of Life Sciences, University of Hawaiʻi at Mānoa

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole détaille la préparation de milieux limités en Zn²⁺, de vaisseaux de croissance et de cultures de graines pour produire des ribosomes limités en Zn²⁺ chez les mycobactéries. Des traces de Zn²⁺ conduisent à une croissance limitant le Zn²⁺ et nous décrivons les caractéristiques morphogéniques utilisées comme bioindicateurs pour vérifier la limitation du Zn²⁺ in vitro chez la bactérie modèle, Mycobacterium smegmatis, et l’agent pathogène humain M. tuberculosis.

Résumé

De nombreuses bactéries construisent des ribosomes alternatifs dans des conditions de croissance limitant le Zn²⁺ en remplaçant les protéines ribosomiques liant le Zn²⁺ par des paralogues indépendants du Zn²⁺. La définition d’un système pour étudier ces ribosomes alternatifs s’est avérée difficile car la contamination en Zn²⁺ en laboratoire est courante. Pour résoudre ce problème, des agents chélateurs sont parfois ajoutés aux milieux de croissance, mais cette approche complique la réponse biologique à la limitation progressive de Zn²⁺et est associée à l’hibernation des ribosomes. Vous trouverez ici des instructions détaillées sur la préparation des milieux et l’ensemencement des cultures pour une croissance limitée en Zn²⁺ sans ajout de chélateurs. Selon cette méthode, la bactérie modèle, Mycobacterium smegmatis, subit une morphogenèse, qui dépend de ribosomes alternatifs. Parce que la morphogenèse est traitable et ne se produit que dans des conditions limitantes de Zn²⁺, M. smegmatis peut être utilisé comme bioindicateur pour vérifier les conditions de croissance biologiquement pertinentes. Trois phénotypes de bioindicateurs (densité cellulaire, longueur cellulaire et fluorescence de la coenzyme F₄₂₀) qui indiquent une limitation de Zn²⁺ chez le type sauvage sont décrits, et les changements dans ces bioindicateurs pour un mutant de délétion qui ne peut pas construire de ribosomes alternatifs sont décrits. Étant donné que la contamination à l’état de traces de Zn²⁺ est difficile à contrôler pour chaque lot de milieux, et que la quantification précise du Zn²⁺ dans chaque préparation de milieu est trop lourde, le suivi de ce phénotype de bioindicateur est un moyen accessible de valider la préparation de milieux de croissance limités en Zn²⁺. Afin d’aider à identifier les conditions propices à la croissance limitant le Zn²⁺ et à la production de ribosomes alternatifs, les changements dans les phénotypes bioindicateurs ont également été profilés pour les préparations de milieux limités en Zn²⁺ ou gravement appauvris en Zn²⁺. D’autres détails pour atteindre une croissance limitant le Zn²⁺ et une production alternative de ribosomes chez M. tuberculosis sont présentés, ainsi que le phénotype du bioindicateur associé. Dans l’ensemble, les instructions détaillées et les phénotypes de bioindicateurs décrits ici aideront à normaliser la production de ribosomes alternatifs actifs translationnellement chez les mycobactéries.

Introduction

L’ion zinc (Zn²⁺) est un micronutriment essentiel et un composant standard des milieux microbiologiques. Cependant, de nombreuses bactéries subissent une limitation de Zn²⁺ dans l’environnement, car les conditions de limitation de Zn²⁺ sont répandues ; soil¹, marine², et les niches au sein de host³ sont souvent limitées en Zn²⁺. En tant que telles, la plupart des bactéries ont développé des mécanismes pour surmonter la limitation de Zn²⁺ et préserver la fonction cellulaire⁴. Les systèmes impliqués dans le maintien de l’homéostasie du Zn²⁺ sont soumis à un contrôle transcriptionnel strict⁵ et sont impliqués dans le piégeage du Zn²⁺ à l’aide de systèmes d’importation de Zn²⁺ de haute affinité, la mobilisation des réserves cellulaires de Zn²⁺ et le remplacement de certaines protéines de liaison au Zn²⁺ par des paralogues alternatifs indépendants du Zn²⁺⁶. Un exemple de ce dernier est celui des paralogues de la protéine ribosomique (RP) indépendante du Zn²⁺, qui sont une caractéristique commune des régulons sensibles au Zn²⁺ dans les bactéries⁴. Ces RP hautement divergents indépendants du Zn²⁺ se distinguent de leurs paralogues de liaison au Zn²⁺ par la perturbation du motif CXXC de liaison au Zn²⁺⁷. Plus de la moitié des génomes procaryotes séquencés contiennent au moins une paire de RP dupliqués où, dans beaucoup d’entre eux, un RP se lie à Zn²⁺, tandis que son paralogue ne ⁸. Alors que la notation C+/C- (indiquant la présence/l’absence du motif de liaison au Zn²⁺ riche en cystéine) est couramment utilisée en référence à ces paires de RP paralogues⁷, les RP indépendants du Zn²⁺ ont également été décrits comme des versions alternatives (Alt) des paralogues RP primaires (Prim), liant le Zn²⁺, puisque les AltRP servent de RP alternatifs pour la biogenèse des ribosomes dans le Zn²⁺-limité chez certaines bactéries et c’est un mot-clé avec une meilleure facilité de recherche⁹^,¹⁰^,¹¹.

Comme l’expression d’AltRP est étroitement régulée par Zn²⁺, il est logique de supposer que l’expression d’AltRP offre une redondance fonctionnelle aux protéines ribosomales dépendantes de Zn²⁺ face à la limitation de Zn²⁺. En effet, cette caractéristique des AltRP a été démontrée pour la bactérie modèle du sol Bacillus subtilis, où la croissance est sauvée pendant la limitation de Zn²⁺ par la libération de la surface PrimRP L31 et le remplacement par l’AltRP L31¹²^,¹³. Cependant, certains AltRP sont paralogues aux PrimRP de base, par exemple S14, ce qui signifie que leur incorporation est nécessaire pendant la biogenèse des ribosomes¹²^,¹³. La reconstruction du ribosome avec des AltRP est un programme engagé et énergivore. Bien que ces AltRP centraux puissent servir à libérer Zn²⁺ du ribosome, il est également possible que certains AltRP aient développé une fonction supplémentaire dans l’environnement limité à Zn²⁺. Ceci est soutenu par l’observation que les AltRP sont divergents de leurs PrimRP paralogues ; L’homologie de séquence des gènes AltRP est souvent plus élevée entre homologues de différentes espèces qu’avec la séquence du gène PrimRP liant Zn²⁺ au sein de la même espèce⁷^,¹⁰. Parce que les gènes codant pour des AltRP hautement divergents sont sous contrôle transcriptionnel dépendant de Zn²⁺, ils sont retirés de la pression sélective exercée sur les superopérons ribosomales étroitement régulés et hautement conservés¹⁴. La pression sélective découplée sur l’information génétique codant pour la machinerie ribosomique et les AltRP expose ces RP à des trajectoires évolutives différentes de celles des PrimRP homologues et pourrait permettre une évolution spécifique à la lignée du même AltRP chez différentes bactéries¹⁰^,¹⁵. L’existence généralisée des AltRP chez les bactéries et la régulation génétique découplée de ces RP uniques soulèvent une question intéressante : savoir si l’incorporation des AltRP dans les ribosomes bactériens confère une propriété spéciale aux ribosomes contenant des AltRP (ribosomes Alt).

Les mycobactéries constituent un groupe idéal de bactéries pour étudier les propriétés mécanistes des ribosomes Alt. Tout d’abord, les mycobactéries possèdent un opéron altRP hautement conservé contenant quatre gènes qui codent pour les AltRP : S14-2, S18-2, L28-2 et L33-2⁸^,⁹. Les AltRP mycobactériens sont significativement différents de leurs paralogues PrimRP ; dans les quatre paires PrimRP/AltRP, un gène AltRP donné est plus similaire chez toutes les espèces mycobactériennes qu’il ne l’est au gène PrimRP de la même espèce¹⁰. L’évolution spécifique de la lignée des AltRP est également apparente chez les mycobactéries, comme en témoignent les AltRP S18-2 et L28-2 chez Mycobacterium tuberculosis et M. bovis, qui contiennent des séquences uniques à l’extrémité C-terminale qui ne sont pas présentes chez d’autres mycobactéries¹⁰. Deuxièmement, ce groupe de bactéries très apparentées contient des membres non pathogènes et pathogènes qui résident dans divers environnements, du sol (p. ex., M. smegmatis) à une myriade d’hôtes : humains (p. ex., M. tuberculosis), bovins (p. ex., M. bovis), aquatiques (p. ex., M. marinum) et aviaires (p. ex., M. avium), pour n’en nommer que quelques-uns. La nature hautement conservée de l’opéron altRP chez les mycobactéries, l’évolution spécifique à la lignée de gènes AltRP spécifiques et les environnements très différents dans lesquels les membres de ce groupe existent offrent une occasion unique d’analyser l’évolution conservée et spécifique à la lignée de la fonction AltRP et les propriétés mécanistes des ribosomes Alt. Malgré l’abondance des AltRP dans les génomes procaryotes, le rôle des AltRP et des ribosomes Alt n’a été étudié que chez quelques bactéries ⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. La mise en place d’un système normalisé avec des mesures spécifiques pour valider les conditions de croissance limitant le Zn²⁺ chez les mycobactéries améliorerait les résultats expérimentaux et ferait progresser la compréhension des ribosomes Alt dans le domaine de la recherche sur les ribosomes.

Zn²⁺ est un micronutriment ; par conséquent, des traces de Zn²⁺ contaminant dans les produits chimiques et l’eau contribuent à la biodisponibilité du Zn²⁺, même lorsqu’elles sont omises de la préparation du milieu. Les traces de Zn²⁺ présentes dans l’eau ou les produits chimiques peuvent varier considérablement d’un laboratoire à l’autre, affectant ainsi le résultat de la croissance limitant le Zn²⁺. La quantification empirique du [Zn²⁺] dans chaque préparation indépendante de milieux est trop lourde pour la plupart des laboratoires qui effectuent des essais de croissance de routine, mais un mécanisme permettant d’éliminer la possibilité de contamination par le Zn²⁺ dans les milieux de croissance serait intrinsèquement précieux. À cette fin, nous présentons ici une méthode détaillée pour préparer un milieu limité en Zn²⁺ (ZLM), des vaisseaux de croissance et des cultures de graines chimiquement définis pour la croissance limitant le Zn²⁺ et la production de ribosomes alternatifs chez M. smegmatis et M. tuberculosis. Les principales caractéristiques morphogéniques (densité cellulaire mesurée par OD₆₀₀, longueur cellulaire et fluorescence de la coenzyme F₄₂₀) après croissance dans ZLM sont utilisées pour vérifier que la limitation de Zn²⁺ a été atteinte. La coenzyme F₄₂₀ est un cofacteur de la déazaflavine qui joue un rôle important dans le catabolisme et la défense contre le stress oxydatif chez les méthanogènes et les mycobactéries²⁰^,²¹. Il est important de noter que les mycobactéries sont autofluorescentes lorsqu’elles sont excitées à 420 nm en raison de l’abondance de ce cofacteur ²². Le lien moléculaire entre la fluorescence de [Zn²⁺] et de F₄₂₀ n’est pas résolu, mais le suivi de la fluorescence de F₄₂₀ dans les cultures est un bio-indicateur traitable et fiable.

Chez M. smegmatis, les phénotypes bioindicateurs sont présents chez les bactéries de type sauvage, mais un mutant de délétion dépourvu de l’opéron altRP ne subit pas le même programme morphogénique et peut être utilisé comme bioindicateur différentiel¹⁰. Bien que M. tuberculosis ne suive pas le même programme morphogénique que M. smegmatis pendant la limitation en Zn²⁺, M. tuberculosis a une réponse robuste et globale au Zn²⁺ et un phénotype de bioindicateur clé suivant cette méthode ²³. Ainsi, le système défini ici permet de générer des ribosomes Prim- et Alt- dans les mêmes conditions de croissance (c’est-à-dire une limitation Zn²⁺), facilitant la dissection mécaniste de la fonction des ribosomes Alt et son rôle dans la formation de la physiologie bactérienne. Cette méthode de croissance a été utilisée pour résoudre la structure des ribosomes Alt actifs et démontrer leur activité translationnelle chez M. smegmatis²⁴. De plus, l’expression d’AltRP est nécessaire pour la morphogenèse dépendante de Zn²⁺ et a un effet profond sur le transcriptome et le protéome de M. smegmatis^{Zn²⁺ class="xref">10}^,²⁵. La même méthode, avec des modifications mineures de la quantité d’inoculum et du temps d’incubation, est utilisée pour générer des cultures de M. tuberculosis⁹^,²³. Ici, les protocoles et les phénotypes de bioindicateurs permettant d’atteindre une croissance limitant le Zn²⁺ chez M. smegmatis et M. tuberculosis sont détaillés, en mettant l’accent sur M. smegmatis, car cette bactérie est plus sensible à la contamination par le Zn²⁺ dans les milieux et est plus largement accessible que l’agent pathogène à croissance lente.

Protocole

REMARQUE : Les souches utilisées dans cette étude sont M. smegmatis sauvage mc² 155 (don du Dr Robert Husson, Boston Children's Hospital) et la souche de délétion ΔaltRP (provenant du laboratoire Prisic¹⁰). Elles peuvent être cultivées dans un laboratoire de niveau de biosécurité 1 (BSL1) ou de niveau 2 (BSL2), selon les réglementations locales de biosécurité et les ressources disponibles. Ici, le protocole est rédigé pour un laboratoire BSL2. S’il est réalisé dans un laboratoire BSL1, une technique aseptique avec un bec Bunsen peut remplacer la cabine de sécurité microbiologique. De plus, les chercheurs qui souhaitent inclure d'autres souches ou conditions devront calculer le volume de milieu nécessaire en fonction du nombre total de cultures analysées. Manipuler M. tuberculosis H37Rv pathogène (Mtb-H37Rv ; don du Dr Robert Husson, Boston Children's Hospital) dans un laboratoire BSL3 en portant un respirateur (par exemple, PAPR ou N95). Ne pas réutiliser les flacons lors de la culture de mycobactéries hautement virulentes, telles que Mtb-H37Rv. M. tuberculosis auxotrophe mc²6206 (Mtb-Aux) est atténué et peut être manipulé dans un laboratoire BSL2 (don du Dr William R. Jacobs Jr., Albert Einstein College of Medicine).

1. Préparation des flacons

REMARQUE : Les conditions de croissance limitantes en Zn²⁺ sont obtenues dans des flacons Erlenmeyer en polycarbonate réutilisables (autoclavables) de 250 mL. N'utilisez pas de flacons en verre pour la croissance limitante en Zn²⁺, ou bien étudiez et comparez des procédures rigoureuses de lavage à l'acide aux résultats présentés dans ce protocole¹⁹. Des flacons tout neufs permettent d'obtenir des conditions de croissance limitantes en Zn²⁺, mais il ne faut jamais mélanger des flacons neufs et usagés dans une même expérience. Jetez les flacons qui présentent des signes de fragilité (généralement au niveau des soudures) ou qui ont été utilisés plus d'environ 20 fois. Vérifiez régulièrement l'état des filtres des bouchons et éliminez-les s'ils sont détériorés. S'ils sont présents, jetez les couvercles filetés qui se vissent sur le dessus des bouchons et recouvrent les filtres. Cette méthode décrit les précautions prises pour nettoyer les flacons et les préparer à une réutilisation.

Étiqueter de façon permanente les flacons afin qu'un même jeu ne soit utilisé que pour des conditions de limitation en Zn²⁺. Étiqueter un autre jeu de flacons pour la croissance en présence suffisante de Zn²⁺. L'utilisation de couleurs différentes est utile pour éviter de mélanger les flacons.
Ne jamais laisser résider des résidus de culture séchés dans les flacons. Ajouter de l'eau immédiatement dans les flacons après avoir décanté la culture (par exemple, 100 mL). Si la culture n'est pas récoltée à la fin de la croissance, vider les flacons en versant l'ensemble de la culture dans un récipient de déchets liquides contenant une concentration finale de 10 % d'eau de Javel, après avoir enregistré les phénotypes des bioindicateurs comme décrit dans ce protocole.
Stériliser les flacons en autoclave selon le cycle liquide (au moins 121 °C à 15 psi) pendant 20 min, avec de l'eau à l'intérieur et les couvercles en place.
Après stérilisation, laver les flacons avec un détergent non ionique à faible pouvoir moussant et bien les brosser à l'aide d'une brosse douce. Réserver une brosse exclusivement à laver les flacons utilisés pour la croissance en conditions de limitation en Zn²⁺. S'assurer que les flacons sont propres, sans résidu ni débris. Ne pas frotter ni utiliser de savon sur les bouchons ; rincer délicatement à l'eau déionisée.
Rincer soigneusement les flacons à l'eau du robinet, puis effectuer trois rinçages à l'eau déionisée (type II ou III) et au moins un rinçage supplémentaire à l'eau ultrapure (type I) (18,2 MΩ-cm à 25 °C et ≤ 5 ppb de carbone organique total).
Placer les flacons verticalement à l'envers afin qu'aucune eau ne puisse s'accumuler au fond. Ne pas utiliser les porte-flacons muraux standards, car ils maintiennent les flacons en biais et permettent la formation d'une petite flaque d'eau. Des porte-flacons standards pour vaisselle conviennent. Laisser les flacons et les couvercles sécher complètement.
Une fois secs, visser les bouchons sur les flacons et recouvrir les couvercles de papier d'aluminium. Fixer un morceau de ruban indicateur d'autoclave sur le papier d'aluminium pour indiquer l'état stérile et protéger les filtres des bouchons contre la poussière.
Stériliser à nouveau les flacons nettoyés en autoclave (au moins 121 °C à 15 psi) pendant 20 min, suivis d'un cycle de vide post-autoclavage pour sécher la charge (si l'autoclave dispose de cette fonction). Conserver les flacons au sec et à l'abri de la poussière.

2. Préparation du milieu limité en Zn²⁺ (ZLM)

REMARQUE : Utilisez uniquement des béchers en plastique, des cylindres gradués et tout autre matériel pour préparer les milieux. Réservez un ensemble de matériel de laboratoire utilisé exclusivement pour la préparation de milieux limités en Zn²⁺. Rincez soigneusement tout le matériel avec de l’eau ultrapure (type I) avant et après utilisation. Utilisez des produits chimiques de haute pureté et achetez-les auprès des mêmes fournisseurs, si possible.

Préparer le milieu de Sauton limité en Zn²⁺, sans sels de Zn²⁺ ajoutés²⁶, en mélangeant les produits chimiques suivants avec environ 950 mL d'eau ultrapure dans un bécher en plastique de 1 L muni d'un barreau aimanté :
0,5 g de KH₂PO₄ (0,05 % ; MM : 136,09)
0,5 g de MgSO₄ x 7H₂O (0,05 % ; MM : 246,48)
2 g d'acide citrique anhydre (0,2 % ; MM : 192,12)
4 g de L-asparagine, 99 % (0,4 % ; MM : 132,12)
60 mL de glycérol (6 %)
189 µL de solution de citrate ferrique d'ammonium 1 M (0,005 % ; MM : 265)
1. Ajouter le glycérol à l’aide d’une pipette seringue en plastique jetable de 50 mL. Rincer soigneusement la pipette en aspirant et en expulsant le liquide environ 10 fois dans le milieu, jusqu’à ce qu’aucun résidu de glycérol ne reste dans la pipette.
  REMARQUE : Le glycérol est très visqueux et difficile à mesurer. Alternativement, on peut verser le glycérol dans un cylindre gradué, puis le rincer plusieurs fois avec environ 30 mL d’eau ultrapure, que l’on ajoute ensuite au milieu. Si cette méthode est utilisée, commencer avec un volume inférieur (~600 mL) afin que le volume final n’excède pas environ 950 mL après l’ajout du glycérol et des rinçages du cylindre gradué.
Compléter le volume du milieu à environ 950 mL et bien mélanger. La L-asparagine met quelques minutes à se dissoudre ; attendre qu’il ne reste plus aucun flocon blanc avant de poursuivre.
REMARQUE : La solution de citrate ferrique d'ammonium confère au milieu une couleur jaune pâle.
Préparer 15 mL de solution fraîche de NaOH (~10 % p/v) avec de l’eau ultrapure dans un récipient en plastique (par exemple, un tube conique de 15 mL).
Rincer soigneusement un pH-mètre avec de l’eau ultrapure avant utilisation, puis plonger uniquement la bulbe du pH-mètre dans le milieu. Laisser le pH-mètre dans le milieu sous agitation douce pendant le réglage du pH. À l’aide d’une pipette plastique jetable, ajouter la solution fraîchement préparée de NaOH jusqu’à atteindre un pH final de 7,4.
REMARQUE : Le pH initial du milieu est fortement acide. Un grand volume de solution de NaOH est nécessaire pour porter le pH à la zone neutre. Ajouter initialement 4 à 6 mL de solution de NaOH ; une fois que le pH atteint environ 6,5, ajouter la solution de NaOH goutte à goutte. Ne pas dépasser le pH cible de 7,4. Si cela se produit, ne pas tenter de réajuster avec du HCl ou d’autres acides : jeter le milieu. Il est recommandé de réserver un pH-mètre exclusivement à la préparation du milieu ZLM, afin d’éviter toute contamination de la sonde par d’autres milieux ou tampons.
Transférer le milieu dans un cylindre gradué et compléter jusqu’à un volume final de 1 L avec de l’eau ultrapure. Stériliser le milieu par filtration à travers un filtre jetable de 0,2 µm monté sur un flacon filtrant.
Ajouter aseptiquement 2,5 mL de solution de Tween-80 à 20 %, stérilisée par filtration (concentration finale de 0,05 %). Conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière, jusqu’à 6 mois.

Croissance limitée par le Zn²⁺ chez M. smegmatis

REMARQUE : En raison des variations entre lots de la quantité de Zn²⁺ présente dans le ZLM, il est impératif d'utiliser le même lot de milieu, ou plusieurs lots de milieu soigneusement mélangés ensemble, pour toutes les cultures d'une expérience. En plus du milieu nécessaire pour installer les cultures, environ 100 mL supplémentaires sont nécessaires pour le lavage et la normalisation des cultures initiales.

Réalisez toutes les étapes dans une hotte de sécurité biologique. Préparez les cultures initiales 18 h avant de démarrer l'expérience de croissance. N'utilisez pas de cultures initiales surcroîtées ou formant des agrégats. Une culture initiale par souche est suffisante.
1. Ajoutez aseptiquement 5 mL de milieu 7H9-ADC (bouillon Middlebrook 7H9 contenant 0,05 % de Tween 80 et un enrichissement ADC à 10 % [concentration finale : 0,5 % d'albumine de sérum bovin, 0,2 % de dextrose, 0,085 % de NaCl et, facultativement, 0,0003 % de catalase]) dans un tube de bioréacteur de 50 mL.
2. Ajoutez aseptiquement 10 µL de cellules en stock glycérol décongelées (préparées selon²⁶) directement dans le milieu. Vissez le bouchon sur le tube.
3. Placez fermement les tubes dans un incubateur agité à un angle d'environ 45°, de sorte que le liquide monte à mi-hauteur du tube pendant l'agitation.
4. Incubez les tubes à 37 °C sous agitation à 120 tr/min pendant environ 18 h.
Examinez les cultures initiales de la nuit pour vous assurer qu'elles sont uniformément troubles et ne présentent pas d'agglomération importante. La densité optique à 600 nm (DO₆₀₀) de la culture de la nuit devrait idéalement se situer autour de 0,5-0,8.
Centrifugez les cultures de la nuit dans les tubes de bioréacteur utilisés pour la croissance nocturne, à 3 000 x g pendant 5 min à température ambiante, afin de former un culot.
Décantez ou aspirez le surnageant et resuspendez dans 5 mL de ZLM. Répétez les étapes de centrifugation et de resuspension 2 fois, pour un total de trois lavages.
1. Pendant les étapes de centrifugation, remplissez une cuvette jusqu'au débordement avec de l'éthanol à 70 % pour la stériliser. Laissez la cuvette remplie reposer dans la hotte de sécurité biologique pendant 10 min, puis rincez-la soigneusement 3 fois avec du ZLM à l'aide d'une pipette.
  REMARQUE : Le processus de normalisation des cellules demande du temps et de la pratique pour être réalisé efficacement. En normalisant directement les cellules dans la cuvette stérilisée à l'éthanol, ce processus est grandement accéléré.
2. Préparez suffisamment de cuvettes pour le nombre de souches incluses dans l'étude ; par exemple, ce protocole nécessite deux cuvettes stérilisées, une pour la souche sauvage et une pour le mutant ΔaltRP.
Après trois lavages avec du ZLM, resuspendez chaque culot cellulaire dans 2 mL de ZLM.
Effectuez le blanc d'un spectrophotomètre avec 600 µL de ZLM dans une cuvette. La cuvette n'a pas besoin d'être stérilisée. Mettez-la de côté et utilisez-la pour effectuer le blanc du spectrophotomètre avant de normaliser chaque culture (c'est-à-dire chaque souche).
En travaillant avec une souche à la fois, transférez 600 µL de cellules lavées de l'étape 3.5 dans une cuvette stérilisée préparée à l'étape 3.4.1 et mesurez la DO₆₀₀ initiale. Si la DO₆₀₀ est supérieure à 1, passez à l'étape 3.8. Si la DO₆₀₀ est inférieure à 1, suivez les sous-étapes 3.7.1 et 3.7.2.
1. Si la mesure initiale de DO₆₀₀ obtenue à l'étape 3.7 est inférieure à 1, récupérez toute la culture contenue dans la cuvette, remettez-la dans les cellules initiales lavées restantes dans le tube de centrifugation, puis centrifugez à nouveau la culture comme à l'étape 3.3. Resuspendez la culture dans un volume inférieur à celui utilisé à l'étape 3.5 (par exemple, 1 mL) afin d'obtenir une densité cellulaire plus élevée, puis répétez l'étape 3.7.
2. Si la DO₆₀₀ après l'étape 3.7.1 est toujours inférieure à 1, la culture n'est pas assez dense ; recommencez la procédure à partir de l'étape 3.1. Incubez les cultures plus longtemps ou augmentez la quantité d'inoculum pour préparer les cultures nocturnes, de sorte que la densité finale de la culture nocturne soit d'environ DO₆₀₀ = 0,5-0,8, comme décrit à l'étape 3.2.
Calculez le volume de ZLM à ajouter aux 600 µL de cellules lavées dans la cuvette pour obtenir une DO₆₀₀ de 1, en utilisant l'équation suivante et la DO₆₀₀ mesurée à l'étape 3.7 :
Volume de ZLM (µL) = (DO₆₀₀ initiale - 1) × 600 µL
Ajoutez au tube le volume de ZLM calculé à l'étape 3.8, mélangez bien en pipetant 5 à 10 fois, puis remesurez la DO₆₀₀.
Ajustez la DO₆₀₀ à moins de 5 % de DO₆₀₀ = 1 en suivant les sous-étapes ci-dessous. Utilisez deux pipettes, dont une (de taille P1000) dédiée au mélange de la culture, afin d'éviter d'utiliser trop de pointes à chaque ajustement.
1. Si la DO₆₀₀ est supérieure à 1, ajoutez du ZLM goutte à goutte (~50 µL à la fois), mélangez bien en aspirant et en expulsant 5 à 10 fois, puis mesurez la DO₆₀₀. Répétez ce processus au besoin jusqu'à ce que la culture soit à moins de 5 % de DO₆₀₀ = 1.
2. Si la DO₆₀₀ tombe en dessous de 1 pendant la normalisation, ajoutez davantage de cellules lavées (~20 µL au départ) provenant de l'étape 3.5, mélangez bien en aspirant et en expulsant 5 à 10 fois, puis mesurez la DO₆₀₀. Répétez ce processus au besoin (ou ajoutez davantage de ZLM comme décrit à l'étape 3.10.1 si la DO₆₀₀ dépasse 1) jusqu'à ce que la culture soit à moins de 5 % de DO₆₀₀ = 1.
3. Veillez à ce que le volume dans la cuvette n'excède pas environ 1,5 mL pendant la normalisation cellulaire afin d'éviter tout déversement dans le spectrophotomètre. Retirez de la cuvette le volume de culture nécessaire lors des dilutions, si nécessaire. Assurez-vous également que le volume de culture dans la cuvette est supérieur au volume minimal requis pour mesurer précisément la DO₆₀₀ avec le spectrophotomètre. La plupart des spectrophotomètres nécessitent au moins 600 µL.
Répétez les étapes de normalisation cellulaire (3.6 à 3.10) pour toutes les souches et conditions incluses dans l'étude.
Préparez le nombre total de flacons requis pour une expérience en ajoutant aseptiquement 50 mL de ZLM dans des flacons Erlenmeyer en plastique de 250 mL préparés comme décrit à l'étape 1.
Inoculez les flacons en ajoutant aseptiquement 50 µL de la culture normalisée à DO₆₀₀ = 1 directement depuis la cuvette, afin d'obtenir une DO₆₀₀ finale de 0,001 (dilution 1:1000 de l'inoculum normalisé).
Pour les cultures cultivées sans limitation en Zn²⁺ (c'est-à-dire dans un milieu riche en Zn²⁺, ZRM), ajoutez 30 µL de ZnSO₄ stérile à 10 mM (préparé frais à partir d'une solution mère stérile à 1 M) directement dans les flacons de culture, pour une concentration finale de 6 µM de ZnSO₄.
Incubez les flacons à 37 °C sous agitation à 100 tr/min pendant 3 jours jusqu'à la phase stationnaire (le jour 0 correspond au jour de l'inoculation).
Chaque jour de croissance, utilisez un lecteur de microplaque à monochromateur ou à filtres pour mesurer les paramètres de croissance suivants, en utilisant 200 µL de culture dans une microplaque à 96 puits à fond plat. Effectuez les lectures immédiatement après le prélèvement des aliquotes afin d'éviter tout dépôt des cellules.
REMARQUE : Il n'est pas nécessaire de préchauffer le lecteur de microplaque, car les valeurs absolues de fluorescence sont moins informatives que les rapports et les balayages de fluorescence, et le petit volume mesuré s'équilibre rapidement à la température ambiante pendant la préparation de la plaque. La fluorescence peut être mesurée par le haut ou par le bas de la plaque si la condensation sur le couvercle pose problème, bien que les intensités de fluorescence soient globalement plus faibles lorsqu'elles sont lues par le bas.
1. Densité cellulaire (c'est-à-dire DO₆₀₀) : Pour rapporter la DO₆₀₀ obtenue à partir d'un lecteur de microplaque, établissez une courbe d'étalonnage permettant de convertir la lecture effectuée avec la longueur de trajet optique de la microplaque (pour un volume fixe, par exemple 200 µL) en longueur de trajet optique standard de 1 cm.
2. Fluorescence du cofacteur F₄₂₀ (ex 420 nm/em 475 nm) : Pour les lecteurs de microplaque à filtres, utilisez le jeu de filtres le plus proche (par exemple, ex 430 nm/em 488 nm) et des microplaques noires à 96 puits.
3. Mesurez la fluorescence de fond à 375 nm (ex 375 nm/em 475 nm).
4. Si vous utilisez un monochromateur, effectuez un balayage d'intensité de fluorescence de ex 230 à 440 nm par pas de 5 nm, avec une émission fixe à 475 nm.
5. Si vous utilisez un monochromateur, calculez le pourcentage d'intensité de fluorescence à 375 nm par rapport à 420 nm à l'aide de l'équation suivante :
  F_375/420 (%) = (F₃₇₅/F₄₂₀) × 100

4. Enregistrement et mesure de la longueur des cellules

Au jour 3, visualiser et enregistrer la longueur des cellules. Nettoyer une lame et une lamelle avec un chiffon sans peluches. Déposer une goutte de 10 µL de culture sur la lame, puis poser délicatement la lamelle directement au-dessus de la culture. Appuyer légèrement sur la lamelle afin que la culture s'étale et occupe presque entièrement la surface située sous la lamelle. Préparer les lames et les observer immédiatement pour éviter qu'elles ne s'assèchent.
NOTE : Si la culture ne s'étale pas facilement, les débris empêchent un bon contact et les mouvements du liquide rendront difficile la mise au point sur les cellules. Préparer une nouvelle lame.
À l’aide d’un microscope composé (ou en contraste interférentiel différentiel, voir ci-dessous) équipé d’un objectif à immersion huile 100x et d’oculaires 10x (grossissement total de 1000x) et d’un dispositif caméra, observer la lame préparée.
NOTE : Les cellules sont beaucoup plus faciles à visualiser grâce au contraste offert par la microscopie en contraste interférentiel différentiel (DIC)¹⁰. Utiliser ce type de microscope pour obtenir des images de haute qualité, si possible. Pour une analyse de routine et la vérification de l’état de croissance limité en Zn²⁺, un microscope composé à lumière ordinaire est suffisant.
Prendre des photographies de zones de la lame contenant plusieurs cellules bien mises au point, en plan (c’est-à-dire que toute la longueur de la cellule est visible) et immobiles. Enregistrer suffisamment d’images provenant de différentes zones de la lame (ou de plusieurs lames de la même culture) afin de mesurer au moins 100 cellules.
À l’aide du même microscope et du même objectif, acquérir une image d’une lame de calibration.
Dans Fiji²⁷, utiliser l’outil ligne droite pour tracer une ligne sur la longueur de la lame de calibration. Sélectionner Analyser > Définir l’échelle et indiquer la distance et l’unité connues de la barre d’échelle. Cocher Global pour appliquer cette échelle à toutes les images et mesures futures.
Ouvrir une photographie microscopique. Utiliser l’outil ligne droite pour tracer une ligne sur la longueur d’une cellule, puis appuyer sur la touche M du clavier pour mesurer la cellule. Mesurer au moins 100 cellules pour chaque culture.
Copier les données de longueur provenant de la fenêtre contextuelle de Fiji dans un logiciel tableur ou les enregistrer sous forme de fichier de valeurs séparées par des virgules (.csv) pour une analyse statistique.

5. Modifications pour la culture de M. tuberculosis (Mtb) limitée en Zn²⁺

REMARQUE : Contrairement à Mtb-H37Rv, Mtb-Aux ne peut pas synthétiser la L-leucine ni le D-pantothenate, et ces suppléments sont ajoutés au milieu²⁸. La supplémentation pour Mtb-Aux n'affecte pas la limitation en Zn²⁺, et les deux souches présentent des phénotypes similaires dans le ZLM²³. Ce protocole est une adaptation d'un protocole précédemment publié²³, la principale différence étant que les cultures sont incubées pendant 8 jours au lieu de 10 jours afin de réduire l'agglomération et permettre l'enrichissement en cellules isolées, nécessaire pour des applications ultérieures telles que les infections de macrophages. Pour d'autres différences mineures, veuillez consulter la publication originale²³. La méthode d'inoculation diffère de celle de M. smegmatis en raison de l'inoculum nettement plus élevé requis pour initier la croissance de M. tuberculosis.

Pour Mtb-Aux, ajouter une supplémentation supplémentaire de 50 µg/mL de L-leucine et de 48 µg/mL de D-pantothenate dans tous les milieux. Stériliser par filtration des solutions mères 1000x de 50 mg/mL de L-leucine et de 48 mg/mL de D-pantothenate de calcium à l’aide d’un filtre de 0,2 µm, puis ajouter aux milieux stérilisés.
Ajouter aseptiquement 1 mL de cellules en stock glycérol décongelé à 4 mL de 7H9-ADC dans un tube conique de 14 mL à bouchon vissable (pour Mtb-Aux) ou dans un tube bioreacteur de 50 mL (pour Mtb-H37Rv).
Incuber à 37 °C sans agitation jusqu’à ce que la culture atteigne une DO₆₀₀ d’environ 1. Cela prendra environ 1 semaine. Aérer la culture une fois par jour en ouvrant le tube dans une hotte de sécurité biologique et en pipetant plusieurs fois pour bien mélanger la culture.
Inoculer 1 mL de la culture statique dans 50 mL de 7H9-ADC dans un flacon en plastique aéré de 250 mL. Une culture de 50 mL en 7H9-ADC est suffisante pour des réplicats biologiques en triplicat par souche et par condition (c’est-à-dire sauvage en ZLM et ZRM). Veiller à éviter les gros agrégats (c’est-à-dire de grands amas de cellules) en laissant la culture reposer 5 à 10 minutes avant l’inoculation, afin que les agrégats sédimentent au fond du tube, puis prélever la culture depuis le haut.
NOTE : L’inoculation avec de gros agrégats produit des cultures grumeleuses, ce qui affecte la normalisation et la reproductibilité des cultures.
Incuber à 37 °C avec agitation à 100 tr/min jusqu’à ce que la culture atteigne une DO₆₀₀ comprise entre 0,5 et 0,8 (phase exponentielle moyenne). Cela prendra 3 à 5 jours.
Transférer la culture dans un tube conique de 50 mL et récupérer les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 minutes à température ambiante. Éliminer le surnageant en aspirant 40 mL à l’aide d’une pipette serologique, puis retirer le surnageant restant avec une micropipette P1000.
NOTE : Cette étape est essentielle pour réduire le transfert résiduel de Zn²⁺ provenant du milieu 7H9-ADC.
Resuspendre le culot dans 5 mL de ZLM et compléter le volume total de la culture à 50 mL dans le tube conique avec du ZLM.
Répéter la centrifugation à 3 000 x g pendant 10 minutes à température ambiante pour récupérer les cellules. Éliminer le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire à un volume final de 50 mL comme décrit à l’étape 5.7.
Mesurer la DO₆₀₀ des cellules germinales lavées et calculer le volume nécessaire pour obtenir une DO₆₀₀ initiale de 0,05 (Mtb-H37Rv) ou de 0,08 (Mtb-Aux) dans 50 mL, en utilisant l’équation suivante :

NOTE : La croissance de Mtb-Aux avec une DO₆₀₀ initiale de 0,05 est irrégulière ; par conséquent, une DO₆₀₀ plus élevée de 0,08 est utilisée pour assurer une croissance constante.
Prélever par aliquots le volume de culture germinale calculé à l’étape 5.9 dans un nouveau tube conique de 50 mL et compléter le volume à 50 mL avec du ZLM. Verser la culture lavée et normalisée depuis le tube conique dans des flacons Erlenmeyer en plastique préparés comme décrit à l’étape 1. Répéter l’opération en utilisant le même tube conique pour tous les réplicats biologiques de chaque souche et condition.
Pour les cultures cultivées sans limitation en Zn²⁺ (c’est-à-dire en milieu suffisant en Zn²⁺, ZRM), ajouter directement 30 µL de ZnSO₄ stérile à 10 mM dans les flacons de culture, pour une concentration finale de 6 µM de ZnSO₄.
Incuber les flacons de culture à 37 °C avec agitation à 100 tr/min pendant 8 jours. Mesurer la DO₆₀₀ et la fluorescence F₄₂₀ tout au long de la croissance comme décrit à l’étape 3. Jeter les cultures si elles présentent des grumeaux durant les premiers jours de croissance (c’est-à-dire si la culture n’apparaît pas trouble et que des agrégats sont visibles dans toute la culture).
NOTE : Idéalement, les cultures doivent être majoritairement planctoniques (c’est-à-dire dépourvues de gros agrégats visibles à l’œil nu) durant les premiers jours de croissance. Les cultures de Mtb, en particulier celles en ZLM, deviennent progressivement plus grumeleuses au fil de la croissance, et la présence d’agrégats flottant à la surface du milieu sous forme de flocons est attendue en fin de phase exponentielle²³.

Résultats

Phénotypes bioindicateurs de M. smegmatis
sauvage M. smegmatis cultures cultivées dans du ZLM ayant atteint le Zn²⁺- limitant la croissance présentent trois phénotypes bioindicateurs principaux par rapport aux cellules cultivées en présence de Zn²⁺- conditions de réplétion : [1] diminution de la DO₆₀₀, [2] des cellules allongées et [3] une diminution du pic de fluorescence à 420 nm. Le mutant dépourvu d'AltRPs (ΔaltRP) n'a pas le même Zn²⁺morphogenèse dépendante comme le type sauvage¹⁰^, et son phénotype unique en Zn²⁺Les milieux limités peuvent être utilisés comme bioindicateurs différentiels. Par conséquent, les trois paramètres bioindicateurs doivent d'abord être évalués chez le type sauvage cultivé dans du ZRM et du ZLM. Si le Zn attendu²⁺-un phénotype sauvage limité est observé, le ΔaltRP La souche délétée doit ensuite être évaluée. La croissance en ZLM n'atteint pas toujours le Zn²⁺-des conditions limitées, ce qui est précisément la raison pour laquelle des bioindicateurs sont nécessaires. Souches sauvages uniques et ΔaltRP les phénotypes bio-indicateurs confirment que le Zn est biologiquement pertinent²⁺des conditions limitantes ont été obtenues. Lorsque les cultures cultivées en ZLM n'atteignent pas le Zn²⁺limitation de la croissance due au Zn²⁺ contamination dans le milieu ou les récipients de culture (ZLM-C), ces phénotypes bioindicateurs seront moins prononcés, comme illustré dans Figure 1 et Figure 2. Inversement, si la concentration de Zn²⁺ dans le ZLM est trop faible, la croissance est altérée par le Zn²⁺ appauvrissement (ZLM-D), qui se manifeste par une faible turbidité de la culture et des phénotypes altérés des bioindicateurs, décrit également dans Figure 1 et Figure 2.

La densité cellulaire est un indicateur pertinent de la limitation en Zn²⁺. Les cultures cultivées dans le milieu ZRM atteignent systématiquement une forte turbidité (supérieure à une DO₆₀₀ de 5) après 72 h, parfois avec formation d'agrégats, et apparaissent visiblement plus jaunes (données non montrées) que les cultures cultivées dans le milieu ZLM (Figure 1A). La limitation en Zn²⁺ restreint la croissance (marquée par une diminution de la DO₆₀₀) de toutes les souches par rapport à la condition suffisante en Zn²⁺, et la souche ΔaltRP présente une densité cellulaire inférieure à celle du type sauvage (Figure 1A). La croissance limitée en Zn²⁺ dans le milieu ZLM donne régulièrement une DO₆₀₀ supérieure à 3,5 et inférieure à 5 chez le type sauvage, et inférieure à 3 chez la souche ΔaltRP (Figure 1A). Les cultures cultivées dans le milieu ZLM contenant une contamination en Zn²⁺ (ZLM-C) atteignent une densité cellulaire similaire (DO₆₀₀ supérieure à 5) à celle des cultures suffisantes en Zn²⁺ cultivées dans le milieu ZRM (Figure 1A). Si la [Zn²⁺] dans le milieu ZLM est trop faible, les cultures sont fortement appauvries en Zn²⁺ (ZLM-D), et la croissance est altérée, comme en témoigne la diminution de la densité cellulaire chez les cultures de type sauvage (DO₆₀₀ inférieure à 3 ; Figure 1A). La densité cellulaire du type sauvage (3,5 < DO₆₀₀ < 5) doit constituer le premier critère phénotypique de contrôle pour confirmer des conditions limitantes en Zn²⁺. Seules les cultures de type sauvage ayant atteint la densité cellulaire attendue doivent être prises en compte, et l'analyse de la souche ΔaltRP doit intervenir après avoir vérifié le phénotype indicateur de limitation en Zn²⁺ chez le type sauvage.

Cultures sauvages en phase stationnaire cultivées dans du ZLM limité en Zn²⁺ sont allongées avec une longueur moyenne de cellule d'environ 9 µm, alors que le Zn²⁺- les cultures repues cultivées dans du ZRM sont courtes, avec une longueur cellulaire moyenne d'environ 3 µm (Figure 1B). Des cultures de type sauvage cultivées dans du ZLM avec du Zn²⁺ la contamination (ZLM-C) n'assurent pas une élongation complète mais sont légèrement plus longues que le Zn²⁺- des cellules reconstituées avec une longueur moyenne de 5 µm. Bioindication du Zn²⁺ la contamination de lots entiers de ZLM indique une contamination possible lors de la préparation, tandis que la contamination de cultures individuelles (c’est-à-dire de flacons) indique un défaut de lavage des flacons ou une préparation incorrecte des cultures. Des souches sauvages cultivées dans un ZLM fortement appauvri en Zn²⁺ (ZLM-D) présentent une élongation moins marquée avec une longueur moyenne des cellules d'environ 7 µm (Figure 1B). Le phénotype sauvage allongé n'est pas observé chez le ΔaltRP souche, et ΔaltRP cellules limitées en Zn²⁺ ont une longueur moyenne d'environ 5 µm (Figure 1B). Figure 2 montre des images représentatives de cellules cultivées dans différentes préparations de ZLM ou de ZRM (après l'étape 2) et visualisées au microscope optique composé. Après l'étape 4, les cellules provenant de nombreux champs dans des images telles que celles illustrées dans Figure 2 sont utilisés pour calculer la longueur moyenne des cellules des cultures présentées dans Figure 1B. Le phénotype allongé de type sauvage est spécifique au Zn²⁺- des conditions limitantes ; l'allongement cellulaire n'est pas observé lorsque les cultures sont en présence de Zn²⁺-replet ou gravement déficient en Zn²⁺-appauvri (Figure 1B et Figure 2).

Le phénotype de l'indicateur biologique de fluorescence diminuée de F₄₂₀ est mieux observé sur des analyses de fluorescence (Figure 1C). La diminution de la fluorescence du cofacteur F₄₂₀ est quantifiée en calculant le pourcentage d'intensité de fluorescence à 375 nm (fond) par rapport à 420 nm (autofluorescence du cofacteur F₄₂₀), comme décrit à l'étape 3.16.5, exprimé sous la forme F_375/420. Pour les lecteurs de plaque monocromatiques dépourvus de capacité de balayage fluorescent, des mesures ponctuelles à 375 nm et 420 nm (les deux avec une émission à 475 nm) conviennent pour calculer F_375/420. Les cultures de type sauvage cultivées dans des conditions suffisantes en Zn²⁺ (c'est-à-dire dans ZRM) présentent une valeur F_375/420 très reproductible d'environ 17 % (Figure 1D). La réduction de la fluorescence de F₄₂₀ dans les cultures limitées en Zn²⁺ cultivées dans ZLM se traduit par une augmentation de F_375/420 d'environ 27 % (Figure 1D). La fluorescence de F₄₂₀ chez la souche ΔaltRP limitée en Zn²⁺ est remarquablement plus faible que chez le type sauvage dans les mêmes conditions, ce qui est visuellement évident sur les analyses de fluorescence (Figure 1C). La valeur F_375/420 est plus variable chez la souche ΔaltRP limitée en Zn²⁺, avec une plage allant d'environ 50 % à 80 % (Figure 1D). Les cultures cultivées dans ZLM mais montrant un indice biologique de contamination par le Zn²⁺ (ZLM-C) présentent une réduction de F_375/420 d'environ 21 %, tandis que les cultures appauvries en Zn²⁺ (ZLM-D) ont une valeur F_375/420 d'environ 35 % (Figure 1D).

En résumé, trois phénotypes bioindicateurs doivent être évalués chez les souches de type sauvage et ΔaltRP afin de confirmer l'état de limitation en Zn²⁺ des cultures cultivées dans le milieu ZLM. Les bioindicateurs doivent être les suivants en cas de croissance biologiquement limitée par le Zn²⁺ : [1] la DO₆₀₀ de la souche de type sauvage est comprise entre 3,5 et 5, tandis que celle de la souche ΔaltRP est inférieure à 3, [2] les cellules de type sauvage mesurent environ 10 µm de longueur, alors que les cellules ΔaltRP ont une longueur réduite de moitié, et [3] le rapport F_375/420 de la souche ΔaltRP est élevé, c’est-à-dire supérieur à 50 %.

Phénotypes bioindicateurs de M. tuberculosis
Zn²⁺-limité M. tuberculosis ne présente pas le même programme morphogénique que M. smegmatis. Plus précisément, il n'existe aucune différence dans la DO₆₀₀ entre Zn²⁺-replet et Zn²⁺-cultures limitées, et Zn²⁺les cultures limitées ne présentent aucun phénotype morphologique évident, c'est-à-dire qu'elles n'allongent pas²³De même, il n'existe pas de Zn²⁺-phénotype d'indicateur biologique appauvri (c'est-à-dire une densité cellulaire réduite) dans M. tuberculosis comme observé dans M. smegmatis. Zn²⁺- les cultures limitées présentent un regroupement plus marqué par rapport au Zn²⁺-des cultures complètes, bien que les deux conditions soient nettement grumeleuses au jour 10 (observé à la fois avec Mtb-H37Rv et Mtb-Aux). Le phénotype d'indicateur biologique clé pour le Zn²⁺ limitation dans M. tuberculosis est une diminution du pic de F₄₂₀ fluorescence, comme rapporté précédemment²³Les résultats concernant les cultures incubées pendant 8 jours sont présentés ici au lieu de 10 jours afin de minimiser l'agglutination. Diminution de F₄₂₀ la fluorescence est apparente dans le Zn²⁺-cultures limitées avec lumière monochromatique (Figure 3) et les lecteurs de plaques à filtres. Pour les lecteurs de plaques à filtres, en utilisant Mtb-H37Rv, Zn²⁺les cultures limitantes (c'est-à-dire cultivées dans du ZLM) présentent environ 50 % des valeurs brutes de fluorescence par rapport au Zn²⁺-cultures complètes (c'est-à-dire cultivées dans du ZRM ; données non montrées). En utilisant un lecteur de plaques monochromatique, le mode de lecture par le fond et Mtb-Aux, Zn²⁺- les cultures complètes ont F_375/420 environ 75 %, et Zn²⁺- les cultures ZLM contaminées ont des valeurs similaires. Diminution de F₄₂₀ fluorescence dans le Zn²⁺-les cultures limitées cultivées dans du ZLM se reflètent par F_375/420de plus de 100 %. Le Zn²⁺- limité ΔaltRP la souche présente une croissance et une F similaires₄₂₀ fluorescence observée dans le Zn²⁺-sauvage limité (Figure 3) et n'est pas utile comme bioindicateur dans M. tuberculosis comme il est dans M. smegmatis (Figure 1). Par conséquent, il est conseillé de tester les milieux qui seront utilisés pour cultiver M. tuberculosis avec la croissance rapide M. smegmatis

Courbes de croissance, distribution des longueurs et analyse de fluorescence dans une étude bactérienne ; graphiques et boîtes à moustaches.
Figure 1 : Phénotypes bioindicateurs de M. smegmatis cultivé en conditions de limitation en Zn²⁺ et effet de la contamination par le Zn²⁺ et de l'épuisement en Zn²⁺ sur les phénotypes. Les exemples représentatifs des phénotypes bioindicateurs montrés dans chaque panneau proviennent des mêmes cultures après 72 heures. Les exemples de résultats de croissance en présence de contamination par le Zn²⁺ (ZLM-C), de limitation en Zn²⁺ (ZLM-L) et d'épuisement en Zn²⁺ (ZLM-D) proviennent de préparations indépendantes de milieux, toutes réalisées selon la même méthode décrite ici (étape 2). Les phénotypes représentatifs des souches sauvage limitée en Zn²⁺ et ΔaltRP sont issus d’un même lot de ZLM. Toutes les souches et conditions comprennent trois réplicats biologiques (n=3). (A) Courbes de croissance montrant la densité optique mesurée à 600 nm (OD₆₀₀) et la diminution de la densité cellulaire en conditions de limitation et d'épuisement en Zn²⁺. Les barres d'erreur représentent l'écart-type entre les réplicats. (B) Longueurs cellulaires des souches sauvage et ΔaltRP, illustrant le phénotype allongé de la souche sauvage en conditions de limitation en Zn²⁺. La boîte à moustaches montre l'écart interquartile, les longueurs minimales, maximales et médianes en µm. (C) Scans de fluorescence représentatifs des cultures, montrant une diminution du pic de fluorescence F₄₂₀ en conditions de limitation en Zn²⁺ et une fluorescence F₄₂₀ fortement réduite chez la souche ΔaltRP limitée en Zn²⁺. Un seul culture représentatif parmi les triplicats biologiques de chaque préparation de milieu est présenté. Les scans de fluorescence utilisent une gamme de longueurs d'onde d'excitation de 230 nm à 440 nm avec un pas de 5 nm et une longueur d'onde d'émission de 475 nm. Le panneau en surimpression en haut à gauche est un agrandissement des souches sauvage et ΔaltRP limitées en Zn²⁺, mettant en évidence la diminution du pic de fluorescence à 420 nm chez la souche ΔaltRP limitée en Zn²⁺. Les unités des axes sont identiques à celles du graphique principal. Toutes les légendes sont identiques à celles du panneau (A). (D) Quantification de la diminution de la fluorescence du cofacteur F₄₂₀, calculée à partir du pourcentage de F_375/420. Les pourcentages sont calculés à partir des valeurs obtenues lors des scans de fluorescence présentés en (C). La boîte à moustaches montre l'écart interquartile, les valeurs minimales, maximales et médianes en pourcentage. Les abréviations indiquant le statut relatif au Zn²⁺ du milieu, fournies entre parenthèses après le type de milieu, sont : R = milieu réapprovisionné en Zn²⁺, C = milieu contaminé par le Zn²⁺, L = milieu limité en Zn²⁺, D = milieu épuisé en Zn²⁺ ; les autres abréviations sont : WT = souche sauvage, a.u. = unités arbitraires. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Résultats de l'électrophorèse en fonction du statut en Zn²⁺, WT par rapport à ΔaltRP, analyse de la séparation des protéines.
Figure 2 : Images représentatives d'observations microscopiques de M. smegmatis après 72 h. Les images proviennent des cultures présentées dans la Figure 1. Les cellules ont été observées à l’aide d’un microscope optique composé avec un grossissement total de 1000x, en utilisant un objectif à immersion dans l’huile de 100x. Les barres d’échelle représentent 10 µm. Les abréviations indiquant le statut relatif au Zn²⁺ du milieu, fournies entre parenthèses après le type de milieu, sont : R = milieu suffisant en Zn²⁺, C = milieu contaminé en Zn²⁺, L = milieu limité en Zn²⁺, D = milieu appauvri en Zn²⁺ ; d'autres abréviations sont : WT = souche sauvage. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Graphique du spectre d'excitation de fluorescence ; longueur d'onde contre fluorescence ; analyse d'étude protéique.
Figure 3 : Perte du phénotype de bioindicateur F₄₂₀ chez M. tuberculosis en conditions de limitation en Zn²⁺, démontrée par des analyses représentatives de fluorescence de la souche auxotrophe Mtb mc²6206 (Mtb-Aux). Les exemples de résultats de croissance contaminés en Zn²⁺ et limités en Zn²⁺ proviennent de préparations indépendantes de milieux. Les souches sauvage limitée en Zn²⁺ et ΔaltRP proviennent du même lot de ZLM. Toutes les souches et conditions comprennent trois réplicats biologiques (n=3). Un seul culture représentatif parmi les réplicats biologiques est présenté pour chaque préparation de milieu et chaque souche sur le graphique. Les analyses de fluorescence ont été réalisées en mode de lecture par le fond après 8 jours de croissance, en utilisant une gamme de longueurs d'onde d'excitation de 230 nm à 440 nm avec un pas de 5 nm et une longueur d'onde d'émission de 475 nm. Les abréviations indiquant le statut relatif au Zn²⁺ du milieu, fournies entre parenthèses après le type de milieu, sont : R = milieu réapprovisionné en Zn²⁺, C = milieu contaminé en Zn²⁺, L = milieu limité en Zn²⁺, D = milieu appauvri en Zn²⁺ ; d'autres abréviations sont : WT = souche sauvage, a.u. = unités arbitraires. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Discussion

Une contribution majeure au manque de connaissances sur les fondements mécanistes des ribosomes Alt est la difficulté d’obtenir des conditions limitant le Zn²⁺ in vitro. La contamination à l’état de traces^{Zn 2+} en laboratoire est courante ; il est donc difficile d’obtenir des conditions de croissance reproductibles limitées en Zn²⁺. La contamination par le Zn²⁺ peut provenir de plusieurs sources, bien que la source la plus importante et la plus courante de contamination et de variabilité soit l’eau ultrapure utilisée pour rincer le matériel de laboratoire et fabriquer des milieux. Les systèmes d’eau ultrapure doivent être correctement entretenus et doivent être rincés pendant 1 minute avant de rincer le matériel de laboratoire ou d’utiliser de l’eau pour les fluides. Les flacons qui ne sont pas bien lavés ou rincés avec de l’eau ultrapure peuvent provoquer une contamination par le Zn²⁺ , ce qui se manifestera par l’augmentation de la densité cellulaire dans certains flacons, mais pas dans d’autres du même lot de ZLM. Des flacons neufs peuvent être utilisés pour évaluer si la source de contamination au Zn²⁺ provient de flacons ou de milieux réutilisés. La contamination par le Zn²⁺ dans le ZLM doit être corrigée par un rinçage accru des articles utilisés pour la fabrication des milieux et d’un ensemble désigné de matériaux pour la préparation du ZLM. Si aucune de ces mesures ne permet d’obtenir les phénotypes de bioindicateurs attendus, le [Zn²⁺] dans l’eau ultrapure et le ZLM doit être quantifié pour exclure la possibilité que la source d’eau soit contaminée par du Zn²⁺. Comme indiqué précédemment, le [Zn²⁺] du ZLM est de 115 ± 37 nM²³, et des concentrations inférieures à 70 nM et supérieures à 150 nM ont généralement conduit à des phénotypes appauvris en Zn²⁺ et contaminés en Zn²⁺, respectivement. Cependant, une bonne préparation du milieu n’est qu’un facteur parmi d’autres qui influe sur le résultat, et une quantité insuffisante ou excessive de Zn²⁺ peut se produire en raison d’une préparation inadéquate de l’inoculum et/ou d’une culturation, c’est-à-dire d’une mauvaise décantation du milieu rempli de Zn²⁺ pendant les étapes de lavage. Toutes les cultures de M. smegmatis incluses ici ont été préparées de la même manière - les résultats de croissance contaminés en Zn²⁺ (ZLM-C) et appauvris en Zn²⁺ (ZLM-D) sont inclus pour mettre en évidence la variabilité qui peut se produire entre différents lots de milieux utilisant le même système d’eau ultrapure, même lorsque les expériences sont faites correctement.

Pour s’assurer que la culture de cellules dans ZLM produit des phénotypes de bioindicateurs limitants de Zn²⁺ reproductibles, il est important d’étiqueter de manière unique les flacons, de toujours les utiliser pour la même condition (c’est-à-dire avec ZLM ou ZRM), de suivre les flacons sur plusieurs utilisations et de jeter les flacons qui sont en fin de cycle de vie, ou qui continuent de produire des phénotypes de bioindicateurs contaminés par le Zn²⁺ avec ZLM. Une bonne préparation de l’inoculum est très importante pour obtenir une croissance limitant le Zn²⁺, car le transfert de Zn²⁺ provenant de cellules de semences mal lavées est une source courante de contamination par le Zn²⁺ qui peut être difficile à analyser à partir de ZLM contaminé par le Zn²⁺. Les cultures de M. smegmatis doivent être analysées et récoltées après 72 h de croissance dans les ZLM (et les ZRM cultivées en parallèle). La morphogenèse et les phénotypes des bioindicateurs sont prononcés de 48 à 72 h ; par conséquent, l’évaluation ou la récolte trop tôt (ou trop tard) des cultures pour la limitation de Zn²⁺ peut ne pas produire le phénotype complet du bioindicateur. Les cultures qui sont appauvries en Zn²⁺ présenteront des longueurs cellulaires similaires à celles qui sont contaminées par le Zn²⁺ ; ainsi, la fluorescence F₄₂₀ et OD₆₀₀doivent être utilisées pour différencier les deux. De même, les cultures contaminées par le Zn²⁺ ne se développent pas toujours mieux que les bactéries limitées en Zn²⁺, mais la fluorescence du F₄₂₀ et la longueur cellulaire du type sauvage et du mutant ΔaltRP devraient révéler si la condition limitée en Zn²⁺ est atteinte.

Il en va de même pour M. tuberculosis, car la perte du phénotype bio-indicateur F₄₂₀ dans les cultures limitées en Zn²⁺ est prononcée entre 8 et 10 jours de croissance dans le ZLM. Bien que M. tuberculosis ne présente pas un fort phénotype de bio-indicateur limité en Zn²⁺ comme M. smegmatis, la méthode de croissance présentée ici a été utilisée pour associer la perte du phénotype du bio-indicateur F420 à la croissance limitée en Zn²⁺ à l’aide d’essais fonctionnels et de transcriptomique dans les souches virulentes et atténuées de M. tuberculosis (réf²³et données non publiées). Par conséquent, suivre la fluorescence de_F420 est un moyen accessible de surveiller et de vérifier les conditions biologiques limitantes de Zn²⁺ chez M. tuberculosis. Il est important de noter que le mécanisme conduisant à la réduction de la fluorescence de_F420 dans des conditions de limitation de Zn²⁺ n’est pas résolu, tout comme la distinction selon que la fluorescence réduite est due à une diminution de l’abondance du pool de coenzymes dans son ensemble ou à un changement de son état redox puisque seule la forme oxydée émet une fluorescence²⁹.

Comme démontré ici, la préparation des milieux limitant le Zn²⁺ est nuancée, et de nombreux facteurs peuvent influencer la concentration efficace des ions Zn²⁺ dans le milieu, même en suivant le même protocole et en utilisant les mêmes réactifs. Les traces de Zn²⁺ dans ZLM permettent une croissance et une expression suffisantes du phénotype limitant le Zn²⁺. Cette diminution progressive de Zn²⁺ pour atteindre la limitation est similaire au modèle Wayne de l’hypoxie dans lequel l’oxygène est progressivement consommé par des bactéries cultivées dans un ballon fermé³⁰. Étant donné que l’hypoxie et les phénotypes limités à Zn²⁺ dépendent de la croissance bactérienne, s’il n’y a pas assez d’oxygène, ou dans ce modèle, de Zn²⁺, dans l’inoculum ou le milieu, les bactéries cesseront de croître avant de pouvoir subir le programme morphogénique approprié. Par conséquent, alors que la contamination en Zn²⁺ est un problème plus évident lorsque l’on souhaite atteindre la limitation de Zn²⁺ , l’épuisement en Zn²⁺ pourrait également présenter un problème en raison du retard de croissance et du déclencheur dépendant du Zn²⁺ manqué pendant la croissance active. De plus, l’utilisation de lecteurs de plaques monochromateurs ou à filtre avec des modes de lecture par le haut ou par le bas pour l’intensité de fluorescence affecte légèrement le pourcentage F_375/420 calculé. Par conséquent, les valeurs de chaque laboratoire peuvent ne pas être directement comparables à celles présentées ici, mais elles doivent être similaires et suivre les mêmes tendances. Ainsi, les méthodes et les procédures de fabrication de ZLM qui produit une croissance limitant le Zn²⁺ devraient être optimisées pour chaque laboratoire et système d’eau ultrapure, et les phénotypes de bioindicateurs présentés ici devraient être utilisés comme norme pour définir les conditions limitant le Zn²⁺.

En raison de la difficulté de normaliser et de reproduire les conditions de croissance limitées par le Zn²⁺, une approche accessible pour contourner la contamination par le Zn²⁺ consiste à ajouter un agent chélateur à un milieu préparé sans ajout de Zn²⁺. Cependant, cette approche confond la véritable réponse biologique à la limitation de Zn²⁺, créant souvent un environnement affamé de Zn²⁺ et d’autres micronutriments. Il a été démontré que même les agents chélateurs spécifiques du Zn²⁺ régulent à la hausse la réponse à la carence en fer, en plus de la réponse transcriptionnelle dépendante du Zn²⁺ chez M. tuberculosis²³. De plus, l’utilisation d’agents chélateurs nécessite un titrage et un timing minutieux pour éviter un environnement gravement affamé en Zn²⁺ qui ne reflète pas la réponse biologique lors du passage de conditions riches en Zn²⁺ à des conditions limitées en Zn²⁺ ou la croissance subie dans des environnements où la disponibilité libre de Zn²⁺ est limitée. Enfin, l’ajout d’agents chélateurs peut ne pas être compatible avec les applications en aval (par exemple, les infections de macrophages ou d’animaux). Des conclusions fondamentalement différentes ont été tirées sur la forme et la fonction des ribosomes Alt obtenus avec des agents chélateurs par rapport à la déplétion progressive en Zn²⁺ dans les cultures en croissance active^17,24. On met en évidence ici différents phénotypes résultant de différences relativement mineures de pureté de l’eau dans différents lots de milieux, même lorsque la procédure est effectuée correctement. Le système quantifiable, reproductible et biologiquement pertinent de génération de ribosomes Alt présenté ici, c’est-à-dire dans des cultures de type sauvage limitées en Zn²⁺ sans ajout de chélateurs, offre une méthode standardisée qui sera primordiale pour unifier les contributions à travers le domaine vers une meilleure compréhension de la biologie alternative des ribosomes.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette étude a été financée par le CAREER Award 1844854 de la National Science Foundation (NSF), le prix de l'innovation IA -937538 de l'American Lung Association et le NIAID R21 de l'Institut national de la santé (NIH) AI109293 à S.P. L'adresse actuelle d'Allexa D. Burger est le Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa, Honolulu, Hawaii, États-Unis.

Matériaux

Systèmes de

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
filtration sous vide de 1000 ml, ligne standard	VWR	10040-440
Erlenmeyer Flacons agitateurs	Greiner Bio-One	679501
14 mL Tubes de culture, plastique, avec capuchons à double position VWR		60818-725
Erlenmeyer Flacons agitateurs	Greiner Bio-One	679502
40X-1000X Composé biologique binoculaire de laboratoire Microscope	Omax	M82EZ
50 mL Tubes de bioréaction, stériles	VWR	76211-286
50 mL Tubes à centrifuger haute performance avec capuchons de drapeau	VWR	89039-656
Alcojet Détergent en poudre peu moussant	Alconox	1404
Citrate d’ammonium et de fer (III), brun	Thermo Scientific	AAA1119930 ;	MW : 265 g/mol, pour une solution 1M, ajouter 1,325 g à 5 mL d’eau ultrapure ; conserver à l’abri de la lumière à 4 °C
Albumine sérique bovine	Thermo Scientific	J10857-A1
D-Pantothénate de calcium	Thermo Scientific	AC243300050
Catalase	Sigma-Aldrich	C1345-10G
Acide citrique anhydre, cristallin	Fisher Scientific	BP339-500
Dextrose anhydre	Fisher Scientific	D14-500
Difco Middlebrook 7H9 Broth	BD Diagnostics	271310
DiluPhotometer OD600 pour la détermination de la densité cellulaire et les dosages Bradford	Implen	OD600-10
GENios FL Lecteur de microplaques	Tecan		Discontinued
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
Infinite M200 PRO Lecteur de microplaques multimode	Tecan	LGE140213-20BL
L-Asparagine	Thermo Scientific	AAB2147336
L-Leucine	Thermo Scientific	A1231122
Macrofire SP Caméra CCD	Optronique		À utiliser avec le microscope Olympus
Sulfate de magnésium heptahydraté	VWR	97062-134
Système de purification d’eau Milli-Q Direct 8 Millipore		C85358
Moticam X3	Motic		Abandonné, remplacé par Moticam X5 Plus ; pour utilisation avec un microscope composé
Acide oléique	Thermo Scientific	031997-14
Olympus BX51 microscope droit	Olympus		Abandonné, remplacé par BX53M
Phosphate de potassium, monobasique	Fisher Scientific	BP362-500
Semi-Micro Two-Sided Disposable Plastic Cuvettes	VWR	97000-590
Chlorure de sodium, cristal	VWR	VW1494-01
Hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	S318-500 ;
Tween 80	MP Biomedicals	103170
Sulfure de zinc heptahydraté, cristallin/ACS	MP Biomedicals	219145290

Références

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Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Limitation en zinc ribosomes alternatifs ph notype bioindicateur prot ines ribosomiques morphogen se cellulaire fluorescence de la coenzyme F420 mesure de la longueur cellulaire milieux limit s en zinc Mycobacterium tuberculosis

Utilisation de Mycobacterium smegmatis comme bioindicateur des conditions de croissance limitées en zinc chez les mycobactéries