Method Article

Ablation par laser à deux photons d’ostéoblastes chez des larves de poisson-zèbre en développement

DOI:

10.3791/67279

⸱

September 6th, 2024

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une approche d’ablation laser à deux photons réalisée chez des larves de poisson-zèbre, qui sert de modèle pour étudier la régénération osseuse et les effets de la réponse immunitaire à l’ablation.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le poisson-zèbre (Danio rerio) a une capacité exceptionnelle à régénérer différents organes et appendices. La régénération osseuse chez le poisson-zèbre a été étudiée à l’aide de différentes méthodes telles que l’amputation des nageoires, l’épilation des écailles, la trépanation du crâne et les approches microscopiques. À l’aide d’une configuration de balayage laser confocal équipée d’un laser à deux photons, une méthode d’ablation laser a été développée comme paradigme de lésion pour ablater les cellules formant l’os (ostéoblastes) dans l’opercule en développement des larves de poisson-zèbre. La méthode décrite ici permet l’ablation des cellules de manière précise, car la surface, la forme et la profondeur peuvent être ajustées avec précision. De plus, cette méthode permet d’imager la zone avant et juste après l’ablation, de sorte que les effets à court terme de la blessure peuvent être analysés. Dans ce dispositif expérimental, la réponse immunitaire après ablation des ostéoblastes dans la zone lésée a été étudiée. Une augmentation du recrutement des macrophages a été observée après l’ablation, indiquant la pertinence de leur présence lors de la régénération osseuse.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le poisson-zèbre régénère divers organes tels que la rétine, le cerveau, le cœur et le pancréas1. De plus, le poisson-zèbre régénère les éléments squelettiques, c’est pourquoi il a été utilisé pour étudier la régénération des nageoires, des écailles et des calvaires (calottes crâniennes)2. Différents paradigmes expérimentaux ont été utilisés pour étudier la régénération tissulaire et osseuse, tels que la résection de la nageoire (amputation), la fracture de la nageoire, la trépanation du crâne 3,4, la cryolésion 5,6 ou l’ablation génétique 7,8,9. Récemment, les approches d’ablation au laser ont été largement utilisées chez le poisson-zèbre pour étudier la réponse de guérison et de régénération après une blessure 10,11,12,13,14.

L’ablation médiée par laser a été utilisée dans différents domaines de la recherche biologique, tels que la mécanobiologie, la biologie du développement, la recherche sur la régénération et la chirurgie tumorale 10,11,12,15,16,17,18,19. Il existe différentes méthodologies d’ablation laser, telles que l’utilisation de lasers YAG (yttrium et aluminium grenat), UV (ultraviolet) ou 2p (deux photons)20. L’ablation au laser permet d’enlever des cellules uniques ou de plus grandes portions de tissus de manière très précise, ce qui permet d’étudier différents processus, tels que la réponse du système immunitaire à l’ablation tumorale21 ou lors de la régénération de l’opercule du poisson-zèbre. Dans ce dernier exemple, l’ablation a été confirmée par la disparition du signal fluorophore nucléaire et cytoplasmique et la coloration de la nécrose10,22.

Il est bien connu que la réponse immunitaire innée et sa cinétique régulée sont essentielles à une régénération tissulaire appropriée. Les neutrophiles et les macrophages sont les premières cellules à être recrutées sur le site de la lésion, où ils jouent différents rôles, tels que la libération de cytokines et de facteurs de croissance, l’élimination des débris cellulaires et le remodelage de la matrice extracellulaire23. Ce recrutement et la fonctionnalisation ultérieure des macrophages ont également été observés chez les nageoires de poisson-zèbreamputées 24 et l’opercule en développement, qui a été soumis à une « nanodissection » laser conduisant à l’ablation des ostéoblastes10. Dans cette dernière expérience, la récupération du nombre d’ostéoblastes, le développement normal de l’opercule et le recrutement de cellules immunitaires innées (neutrophiles, macrophages et cellules de type ostéoclaste) dans la zone blessée ont été observés après une ablation par laser UV et par laser à deux photons10. Des expériences chez le poisson-zèbre dans lesquelles le système immunitaire a été pharmacologiquement supprimé par l’utilisation de glucocorticoïdes ont montré une altération de la régénération en cas d’immunité mal régulée, soutenant le rôle fonctionnel du système immunitaire dans la réparation des tissus 3,10,25,26.

Ici, une méthodologie d’ablation par laser à deux photons pour étudier la biologie de la régénération osseuse dans les os de poisson-zèbre en développement est décrite. En particulier, l’effet de l’approche d’ablation des ostéoblastes dans l’opercule est montré en termes de réponse immunitaire, qui est étudiée en surveillant le recrutement des macrophages sur le site d’ablation.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole d’étude a reçu l’approbation de la Landesdirektion Sachsen, numéros de permis 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Les souches de poisson-zèbre utilisées ont été maintenues conformément à la législation nationale et dans des conditions normalisées comme décrit précédemment27,28. Les détails de tous les réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation des matériaux et des solutions

  1. Conservez les embryons dans 1x milieu E3. Préparez le média 1x E3 en diluant 170 ml d’un bouillon 60x E3 dans 10 L d’eau désionisée et en ajoutant 2 ml de bleu de méthylène à 0,1 %.
    1. Préparez le support 60x E3 en mélangeant 17,2 g de NaCl, 0,76 g de KCl, 2,90 g de CaCl2·2 H2O, 4,90 g de MgSO4·7 H2O dans 1 L d’eau autoclavée désionisée.
  2. Pour l’enrobage des larves, préparez à l’avance des aliquotes d’agarose à bas point de fusion (LMA) à 1 % et conservez-les à température ambiante.
    1. Pour préparer des aliquotes, dissoudre le LMA dans 1 milieu E3, p. ex., 500 mg de LMA dans 50 ml de 1 X E3 dans un erlenmeyer, chauffer la solution au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement, et la distribuer dans des aliquotes de 1 mL dans des tubes de 1,5 mL.

2. Élevage de poissons-zèbres et collecte d’embryons

REMARQUE : Des larves de poisson-zèbre double transgénique signalant la présence d’ostéoblastes engagés [osterix :nGFP = Tg(Ola.Sp7 :NLS-GFP)zf132]29 et de macrophages [mpeg :mCherry = Tg(mpeg :mCherry)gl23] ont été utilisés ici30 (Figure 1A).

  1. Installez le poisson-zèbre parental avec les transgènes uniques souhaités dans des cages d’accouplement standard la veille de l’accouplement.
    REMARQUE : Les cages d’accouplement standard permettent aux œufs de passer dans un compartiment inférieur où le poisson-zèbre parental ne peut pas les atteindre.
    1. Gardez les mâles et les femelles séparés jusqu’à l’accouplement à l’aide d’un séparateur dans la cage d’accouplement. Retirez le séparateur le matin du lendemain pour commencer l’accouplement.
  2. À midi, au plus tard, retirez les poissons-zèbres parentaux des bassins d’élevage et collectez les embryons, en filtrant l’eau de la cage d’accouplement à travers un tamis.
    REMARQUE : Dans le cas où l’âge exact des larves est décisif, récoltez les embryons à intervalles réguliers d’environ 30 minutes. Les compagnons de couvée doivent être utilisés dans des expériences avec différents groupes expérimentaux.
  3. Placez les embryons dans une boîte de 100 mm de diamètre contenant 1 milieu E3 et conservez-les dans un incubateur à 28 °C31.
  4. Retirez les ovules non fécondés et les embryons morts de la boîte à l’aide d’une pipette en plastique à l’aide d’un stéréomicroscope et changez 1x milieu E3 par jour.
  5. Avant l’expérience, triez les larves positives pour les transgènes rapporteurs à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence.

3. Intégration des larves dans l’agarose à bas point de fusion

  1. Faire fondre les aliquotes de LMA dans un thermobloc ou un bain-marie à 65 °C. Une fois que le LMA est fondu, maintenez-le à 42 °C jusqu’à ce qu’il soit intégré (Figure 1B). Ajouter 50 μL de MS-222 à 0,4 % à 1 mL d’aliquote de LMA fondue pour obtenir une concentration de MS-222 de 0,02 % pour l’anesthésie.
  2. Anesthésier 4 dpf (jours après la fécondation) larves (ou larves plus âgées) dans un milieu MS-222 E3 à 0,02 %.
  3. Transférez les larves anesthésiées dans une boîte à micropuits à fond de verre à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique de 3 mL et retirez l’excédent de milieu E3 avec la même pipette (figure 1B). Évitez le dessèchement des larves.
    REMARQUE : Plus d’une larve peut être incrustée dans une boîte simultanément ; Il est recommandé d’encastrer 3 à 5 larves pour laisser suffisamment de temps pour la mise en place.
  4. Prenez l’agarose LMA fondue du bain-marie/thermobloc et ajoutez une goutte (rafraîchissante) de LMA dans le plat, en recouvrant le fond de verre où les larves étaient positionnées. Faites attention à ce que le LMA ne soit pas trop chaud mais toujours liquide.
  5. Ensuite, placez les larves dans la position latérale souhaitée avant que l’agarose ne se solidifie. Ici, assurez-vous d’une position latérale dans laquelle l’opercule est aussi proche que possible du fond en verre de la boîte en préparation à la configuration du microscope inversé (Figure 1B).
  6. Laissez l’agarose se solidifier, puis ajoutez du milieu E3 (contenant un maximum de 0,02 % de MS-222) dans le plat pour éviter le dessèchement de l’agarose (figure 1B).

figure-protocol-1
Figure 1 : Représentation schématique de la procédure d’enrobage. (A) Double transgénique Tg(osterix :nGFP ; 29,30 larves de poisson-zèbre avec des ostéoblastes operculaires marqués en vert et des macrophages marqués en rouge ont été utilisés. (B) Le flux de travail de la procédure d’intégration, tel que décrit à l’étape 3 du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Imagerie in vivo des larves et ablation laser

  1. Pour ablater au laser des ostéoblastes dans l’opercule en développement du poisson-zèbre transgénique Tg(osterix :nGFP ; mpeg1 :mCherry)29,30, utilisez un microscope à balayage laser à deux photons inversé avec un objectif à eau 25x/0,95 ou une configuration équivalente.
  2. Placez la boîte avec les larves incrustées sur la platine microscopique du microscope inversé et positionnez la région souhaitée pour l’ablation au centre du champ de vision. L’opercule peut être facilement identifié à l’aide du signal de fluorescence GFP.
  3. Une fois que l’opercule est focalisé et centré dans le champ de vision du microscope, choisissez les paramètres de pile z (souvent des intervalles z de 1 à 2 μm sont utilisés) pour imager toute la largeur de l’opercule. Dans le même temps, choisissez la zone dans un plan z spécifique à ablater (généralement dans la zone postérieure de l’opercule). L’ablation laser à deux photons n’est exercée que dans ce plan.
    REMARQUE : Une résolution plus élevée dans la dimension z entraînera des temps d’imagerie plus longs, mais permettra des analyses volumétriques des données acquises plus tard.
  4. Imagez la zone d’intérêt de l’opercule avant l’ablation. Pour la détection GFP, utilisez un laser à lumière blanche à 488 nm et un détecteur hybride allant de 495 nm à 550 nm ou équivalent. Imagez les macrophages à l’aide d’une excitation de 555 nm (laser à lumière blanche), avec une portée de détection mCherry de 595 à 780 nm sur un détecteur hybride (ou équivalent).
    1. Utilisez le format d’image 512 x 512 pour un bon rapport qualité/temps (d’autres formats peuvent être utilisés si une résolution plus élevée ou une vitesse plus élevée sont souhaitées).
      REMARQUE : Un incubateur à température contrôlée installé au microscope peut être utilisé et réglé, par exemple, à 28 °C.
  5. Dessinez une région circulaire d’un diamètre de 25 μm (d’autres formes et tailles peuvent être sélectionnées en fonction de l’expérience) dans un plan 2D sélectionné, en mettant l’opercule en focus à l’aide de l’outil ROI.
  6. Pour effectuer l’ablation, appliquez une puissance d’ablation (mesurée sans objectif) à 450 mW et exposez la zone sélectionnée au laser à deux photons à une vitesse de balayage de 400 Hz et une durée totale de 10 s. Lors de l’ablation, la zone peut être visualisée à l’aide d’un détecteur hybride dans la gamme de 401 à 443 nm ou équivalent.
  7. Après l’ablation, confirmez la structure de l’ablation en imageant à nouveau la même pile z avec les mêmes paramètres que ceux utilisés avant l’ablation. La zone ablatée ne contient plus de cellules fluorescentes.

5. Récupération des larves et imagerie pour suivre le recrutement des cellules immunitaires

  1. Si l’imagerie du recrutement des cellules immunitaires doit être effectuée avec un certain retard, récupérer les larves de l’imagerie et de l’anesthésie. Retirez soigneusement les larves de la LMA à l’aide d’une pince ou d’une aiguille de dissection.
    1. Tout d’abord, retirez une couche d’agarose recouvrant les larves. Deuxièmement, retirez l’agarose en contact direct avec les larves. Omettez cette étape si l’imagerie immédiate du recrutement des cellules immunitaires a lieu.
  2. Remettez les larves dans un plat avec un milieu E3 pur et vérifiez leur récupération. Le rétablissement est évident par la nage des larves.
  3. À 4 ou 6 hpl (heures après la lésion), imagez à nouveau la zone de l’opercule en utilisant les mêmes réglages au même microscope pour vérifier les effets de l’ablation sur le recrutement des macrophages. Pour ce faire, répétez l’intégration (étape 3) et l’imagerie comme effectué précédemment (étape 4).
  4. Après l’imagerie, retirer les larves de la LMA. Le sacrifice des larves peut être effectué soit par incubation dans de l’eau glacée, soit par surdosage de MS-222 dans E3, selon les exigences légales. Les échantillons peuvent ensuite être utilisés pour des études de suivi ou être éliminés.

6. Analyse d’images et analyse statistique

  1. Traitez les images à l’aide d’un logiciel de traitement d’images tel que Fiji32. En fonction de la résolution z des données acquises, les analyses peuvent être effectuées en 2D ou en 3D.
  2. Quantifiez les macrophages manuellement en incluant des cellules clairement séparées, par exemple en discernant les corps cellulaires principaux, ou en quantifiant les cellules avec un marqueur nucléaire ou en mesurant l’aire en cas de chevauchement des cellules (étape suivante).
  3. Pour quantifier la zone, créez un masque englobant les macrophages. Pour ce faire, utilisez l’outil Image > Adjust > Threshold et créez un ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add) aux Fidji. Exclure les petites particules en arrière-plan pour la quantification.
    1. Ensuite, mesurez la surface (Analyser > Mesurer). Déterminez si les zones de fluorescence cellulaire qui se chevauchent doivent être incluses dans la mesure.
      REMARQUE : Ici, la zone d’ablation circulaire a été omise des mesures de zone car les macrophages recrutés ne peuvent pas être distingués dans cette zone.
  4. Générez des graphiques traçant les résultats de mesure à l’aide d’un logiciel approprié. Pour comparer les données avant et après l’ablation, effectuez un test statistique approprié (ici, un test t unilatéral apparié a été effectué).
    REMARQUE : Les figures peuvent être préparées à l’aide d’un logiciel de retouche photo et de conception graphique.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’ablation au laser a été effectuée comme indiqué dans le protocole ci-dessus. Le signal GFP des ostéoblastes dans la zone ablée a disparu instantanément après l’ablation. Pour étudier la réponse de l’ablation des ostéoblastes en termes de réponse immunitaire, la présence de macrophages chez les larves de 6 dpf avant et à 6 hpl a été imagée. Avant l’ablation, très peu de macrophages ont été observés dans la zone de l’opercule10 (Figure 2). À 6 hpl, une forte accumulation de macrophages dans la région de l’opercule ablaté et un nombre accru de macrophages dans le champ de vision, y compris l’opercule et la zone entourant l’opercule, ont été détectés10 (Figure 2).

figure-results-1
Figure 2 : Recrutement de macrophages à 6 hpl chez 6 larves de poisson-zèbre dpf. Zone de l’opercule sans ablation et à 6 hpl. Les ostéoblastes operculaires sont marqués en vert, les macrophages en magenta, et le cercle pointillé indique la zone ablée au laser. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le recrutement des macrophages a également été analysé chez des larves de 4 dpf avec des opercules beaucoup plus petits à 4 hpl, observant des résultats similaires (figure 3). La quantification du nombre de macrophages (en dehors du site d’ablation laser immédiat) a montré une augmentation dans la période étudiée (4,00 ± 2,37 macrophages avant l’ablation contre 7,00 ± 2,76 macrophages à 4 hpl) (Figure 3B). De même, la surface des macrophages (mesurée en μm2, 785,8 μm2 ± 723,1 μm2 avant ablation contre 1553 μm2 ± 869,9 μm2 à 4 hpl) a augmenté (Figure 3C). Comme les macrophages sont parfois difficiles à distinguer, il est recommandé de mesurer la surface des macrophages au lieu du nombre de macrophages, comme cela a été fait ici.

figure-results-2
Figure 3 : Recrutement de macrophages à 4 hpl chez 4 larves de poisson-zèbre dpf. (A) Région de l’opercule sans ablation et à 4 hpl. Les ostéoblastes operculaires sont marqués en vert, les macrophages en magenta, et le cercle pointillé indique la zone ablée au laser. Barre d’échelle : 50 μm. (B) Quantification du nombre de macrophages dans la zone de l’opercule directement avant (0 hpl) et après l’ablation (4 hpl). (C) Quantification de la surface des macrophages (site d’ablation laser exclu). Tests t unilatéraux appariés. Chaque point représente les données d’une larve, et la moyenne ± SD est indiquée, n = 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’ablation au laser a été appliquée dans diverses disciplines de la recherche biologique. En particulier, il a été utile comme méthode pour étudier la régénération tissulaire 10,11,12. Par exemple, le recrutement et les changements phénotypiques des cellules immunitaires innées ont récemment été analysés au fil du temps à l’aide d’un laser UV ou de tests d’ablation laser à deux photons, ainsi que la récupération d’ostéoblastes au site d’ablation au laser10. L’imagerie en direct du recrutement des cellules immunitaires a été réalisée jusqu’à 12 h post-lésion (HPL) ; Cependant, des périodes d’imagerie plus longues peuvent être envisagées avec des ajustements appropriés de l’anesthésie et l’approbation des autorités respectives. Dans Geurtzen et al., des analyses ont été effectuées jusqu’à plusieurs jours après l’ablation au laser et ont permis de définir le milieu inflammatoire au site d’ablation, ainsi que d’établir le rôle de soutien des macrophages dans la régénération osseuse10. De nombreuses autres applications, telles que l’étude du rôle des espèces réactives de l’oxygène libérées33 lors de la mort cellulaire dans le tissu osseux, sont envisageables.

L’un des avantages de l’utilisation de l’ablation cellulaire médiée par laser à deux photons est la possibilité de la combiner avec l’imagerie confocale. Le logiciel utilisé ici (voir la table des matériaux) peut être réglé sur un mode (Live Data Mode) dans lequel l’imagerie et l’ablation se produisent consécutivement, ce qui accélère le processus. Un autre avantage de la technologie est la précision de l’ablation. La taille et la forme de l’ablation peuvent être facilement ajustées dans le logiciel de manière très précise. Dans le cadre expérimental présenté ici, une zone circulaire d’un diamètre de 25 μm a été choisie pour l’ablation. Cependant, d’autres expériences d’ablation chez la drosophile ont utilisé des ablations linéaires de 25 μm afin de réduire la tension tissulaire dans l’épithélium embryonnaire en coupant les jonctions cellulaires voisin-voisin34. Cette précision permet l’ablation d’un nombre spécifique et contrôlé de cellules, de cellules uniques ou même de membranes cellulaires.

Notamment, le type de lésion réalisée avec un laser à deux photons ne ressemble pas aux blessures et à la mort cellulaire qui se produisent naturellement, ce qui doit être gardé à l’esprit dans la recherche sur la régénération mais aussi dans d’autres disciplines. En particulier, les ablations au laser créent des lésions très ciblées en détruisant complètement (brûlant) les cellules de la région d’intérêt20 avec des dommages minimes dans les tissus environnants, tandis que les lésions mécaniques ou autres ont tendance à affecter plusieurs types et couches de tissus à plus grande échelle. Cela peut entraîner de multiples conséquences impliquant différents types de mort cellulaire (par exemple, nécrose, apoptose, autophagie)35 et différents résultats régénératifs. De plus, les réactions à l’ablation au laser peuvent différer en termes cellulaires et moléculaires. Par exemple, il a été démontré que même si les cellules entourant le site de la lésion laser peuvent perdre l’intégrité de la membrane plasmique, elles peuvent survivre aux dommages et restaurer l’intégrité36. L’ablation au laser conduit également à des zones de la matrice extracellulaire endommagées, qui peuvent résulter d'«explosions thermiques » au centre même du faisceau laser appliqué et également d’une forte exposition à la chaleur dans les cellules directement voisines10,37. Néanmoins, les cellules entourant les sites d’ablation au laser montrent un nombre accru de corps apoptotiques, comme le montre le tissu cardiaque ablé au laser38, et une réponse immunitaire est déclenchée, comme le montre ici. En plus des différences décrites, une autre limite des tests d’ablation assistée par laser pourrait être la profondeur à laquelle la blessure peut être réalisée et la taille limitée des échantillons. Les structures cachées dans les échantillons épais peuvent ne pas être correctement ablatées et l’imagerie sera difficile. Cependant, cela dépendra beaucoup du microscope et du laser utilisés, ainsi que de l’objectif et de l’encastrement.

Il est essentiel d’intégrer les larves de manière à ce que l’opercule soit placé à proximité du fond en verre de la parabole en cas d’utilisation d’une configuration inversée, comme dans le protocole présenté. De plus, il est très important de tester la température du LMA avant de l’appliquer pour couvrir les larves (étape 3.4) car l’agarose chaude endommagera les larves. Pour éviter cela, prélevez l’aliquote LMA du thermobloc tôt, par exemple en retirant le média E3 restant de la parabole à fond de verre, et testez la température, par exemple sur la peau du poignet. La LMA est censée être chaude mais pas chaude.

Une fois que les larves sont recouvertes de LMA, il est important de les mettre rapidement dans la bonne position avant que la LMA ne commence à se solidifier. La position latérale est la plus facile à réaliser ; Dans l’étude présentée, la position souhaitée était latérale avec une légère inclinaison vers la face ventrale. Dans le cas où le LMA se solidifie avant que les larves ne soient correctement positionnées, il est possible de retirer le LMA (comme à l’étape 5.1) et de répéter l’enrobage. De même, il est important que la zone à imager (et à ablater au laser) soit aussi proche que possible du fond en verre de la parabole pour une qualité d’image maximale et une ablation cellulaire, bien que cela dépende également de la distance de travail de l’objectif.

Il est possible d’intégrer plus d’une larve dans la même boîte pour l’imagerie. Cela permettra de gagner du temps et de mieux utiliser la LMA. Le nombre de larves qui peuvent être intégrées dépendra de l’expérience de l’expérimentateur, mais 3 à 5 larves sont recommandées.

L’ablation au laser peut également être réalisée avec des configurations microscopiques verticales utilisant des lentilles plongeantes. Dans ce cas, il est important d’ancrer les larves avec une vue légèrement ventrale (d’en haut) pour permettre une bonne qualité d’imagerie et le succès de l’ablation laser de l’opercule. De plus, seule une fine couche de LMA doit recouvrir les larves pour permettre une bonne excitation et une détection des signaux fluorescents.

Dans ce protocole, une configuration d’ablation par laser à deux photons pour les ostéoblastes est décrite comme une méthodologie pour effectuer des lésions dans les os en développement, en particulier dans l’opercule. Cette méthode peut être adaptée pour ablater des cellules dans d’autres os de poisson-zèbre en développement. De plus, il s’agit généralement d’une approche utile pour étudier la régénération des tissus lésés11,12. La facilité d’effectuer des ablations et des coupes de tissus de différentes tailles et formes permet son utilisation dans différents montages expérimentaux et domaines de recherche 15,17,18,19,21,34. Dans l’ensemble, l’ablation par laser à deux photons est une méthode très adaptable - pour différents tissus, organismes et même dans des contextes in vitro - et elle représente un outil important dans la recherche biologique.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) Transregio 67 (projet 387653785), la DFG SPP 2084 μBone (projet KN 1102/2-1) à FK. Ce travail a été soutenu par l’installation de microscopie optique (projet DFG 413875620), une installation centrale de la plate-forme technologique CMCB à l’Université technique de Dresde. Les travaux de l’université technique de Dresde ont été cofinancés par des recettes fiscales basées sur le budget approuvé par le Parlement saxon (Landtag).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chlorure de calcium dihydraté, CaCl2· ; H2OCarl Roth5239.1
Antenne parabolique de culture cellulaire, PS, 100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51Forme de l’embout droit, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm
Falcon Plaque à 6 puitsCorning353502
Antenne à micropuits à fond de verreMatTekP35G-1.5-14-CAntenne parabolique de 35 mm, lamelle de recouvrement n° 1,5, diamètre du verre de 14 mm,
laser multiphotonique Insight X3Spectra-Physics
Leica Application SuiteLAS X, Leica Microsystems
Agarose à faible point de fusion.Biozyme840101Biozym Plaque Agarose
Sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO4· ; 7H2OSigma-AldrichM5921
d’accouplementde nombreuses variétés, p.ex. Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
Chlorure de potassium, KClPanReac AppliChem131494
Chlorure de sodium, NaClCarl Roth3957.1
SP8 FALCON  ;Leica MicrosystemsEquipé d’un laser multiphotonique Insight X3 et du logiciel Leica Application Suite
Acier inoxydable Dissect NeedleBochem12010140 mm
Stereo Microscope System SZX16OlympusEquipé d’une base d’éclairage LED SZX2-ILLTQ
Armoires thermostatiques TS - WTWxylemTS 608/2-iPour l’incubation (embryon)
Transfert pipette, 3,5 mLSARSTEDT861171155 x 15 mm, LD-PE, transparente
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.Zeiss équipé d’unecaméra Axiocam MRm et d’un
non revêtu, , ,Cages logiciel AxioVision

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692(2019).
  2. Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).
  3. Geurtzen, K., Knopf, F. Adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue. J Vis Exp. (140), e58429(2018).
  4. Sousa, S., Valerio, F., Jacinto, A. A new zebrafish bone crush injury model. Biol Open. 1 (9), 915-921 (2012).
  5. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  6. Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biol Open. 5 (6), 819-828 (2016).
  7. Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Dev Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. Ando, K., Shibata, E., Hans, S., Brand, M., Kawakami, A. Osteoblast production by reserved progenitor cells in zebrafish bone regeneration and maintenance. Dev Cell. 43 (5), 643-650.e3 (2017).
  10. Geurtzen, K., López-Delgado, A. C., Duseja, A., Kurzyukova, A., Knopf, F. Laser-mediated osteoblast ablation triggers a pro-osteogenic inflammatory response regulated by reactive oxygen species and glucocorticoid signaling in zebrafish. Dev. 149 (8), 1998030(2022).
  11. Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. J Vis Exp. (159), e60966(2020).
  12. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845(2011).
  13. Goldstein, A. M., Fishman, M. C. Notochord regulates cardiac lineage in zebrafish embryos. Dev Biol. 201 (2), 247-252 (1998).
  14. Zhang, J., Jeradi, S., Strähle, U., Akimenko, M. A. Laser ablation of the sonic hedgehog-a-expressing cells during fin regeneration affects ray branching morphogenesis. Dev Biol. 365 (2), 424-433 (2012).
  15. Marshall, A. R., et al. Two-photon cell and tissue level laser ablation methods to study morphogenetic biomechanics. Methods Mol Biol. 2438, 217-230 (2022).
  16. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  17. Lee, J., Lee, S., Truong, V. G., et al. Laser ablation of pancreatic cancer using a cylindrical light diffuser. Lasers Med Sci. 37 (6), 2615-2621 (2022).
  18. Luther, E., Mansour, S., Echeverry, N., et al. Laser ablation for cerebral metastases. Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 537-547 (2020).
  19. Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods Mol Biol. 1189, 219-235 (2015).
  20. Vogel, A., Venugopalan, V. Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues. Chem Rev. 103 (2), 577-644 (2003).
  21. Wu, F. Heat-based tumor ablation: Role of the immune response. Adv Exp Med Biol. 880, 131-153 (2016).
  22. Renvoizé, C., Biola, A., Pallardy, M., Bréard, J. Apoptosis: Identification of dying cells. Cell Biol Toxicol. 14 (2), 111-120 (1998).
  23. Julier, Z., Park, A. J., Briquez, P. S., Martino, M. M. Promoting tissue regeneration by modulating the immune system. Acta Biomater. 53, 13-28 (2017).
  24. Petrie, T. A., Strand, N. S., Tsung-Yang, C., Rabinowitz, J. S., Moon, R. T. Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration. Dev. 141 (13), 2581-2591 (2014).
  25. Geurtzen, K., Vernet, A., Freidin, A. Immune suppressive and bone inhibitory effects of prednisolone in growing and regenerating zebrafish tissues. J Bone Miner Res. 32 (12), 2476-2488 (2017).
  26. Fleischhauer, L., López-Delgado, A. C., Geurtzen, K., Knopf, F. Glucocorticoid effects in the regenerating fin reflect tissue homeostasis disturbances in zebrafish by affecting Wnt signaling. Front Endocrinol. (Lausanne). 14, 1122351(2023).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. https://books.google.de/books?id=Iy8PngEACAAJ (2002).
  28. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  29. Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Dev. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. JoVE Science Education Database. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  32. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  34. Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions. Dev. 151 (10), dev202862(2024).
  35. Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. Diversity and complexity of cell death: A historical review. Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).
  36. O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds. PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).
  37. Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues. APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).
  38. Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).

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