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Article de méthode

Ablation par laser à deux photons d’ostéoblastes chez des larves de poisson-zèbre en développement

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⸱

DOI :

10.3791/67279

⸱

6 septembre 2024

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une approche d’ablation laser à deux photons réalisée chez des larves de poisson-zèbre, qui sert de modèle pour étudier la régénération osseuse et les effets de la réponse immunitaire à l’ablation.

Résumé

Le poisson-zèbre (Danio rerio) a une capacité exceptionnelle à régénérer différents organes et appendices. La régénération osseuse chez le poisson-zèbre a été étudiée à l’aide de différentes méthodes telles que l’amputation des nageoires, l’épilation des écailles, la trépanation du crâne et les approches microscopiques. À l’aide d’une configuration de balayage laser confocal équipée d’un laser à deux photons, une méthode d’ablation laser a été développée comme paradigme de lésion pour ablater les cellules formant l’os (ostéoblastes) dans l’opercule en développement des larves de poisson-zèbre. La méthode décrite ici permet l’ablation des cellules de manière précise, car la surface, la forme et la profondeur peuvent être ajustées avec précision. De plus, cette méthode permet d’imager la zone avant et juste après l’ablation, de sorte que les effets à court terme de la blessure peuvent être analysés. Dans ce dispositif expérimental, la réponse immunitaire après ablation des ostéoblastes dans la zone lésée a été étudiée. Une augmentation du recrutement des macrophages a été observée après l’ablation, indiquant la pertinence de leur présence lors de la régénération osseuse.

Introduction

Le poisson-zèbre régénère divers organes tels que la rétine, le cerveau, le cœur et le pancréas1. De plus, le poisson-zèbre régénère les éléments squelettiques, c’est pourquoi il a été utilisé pour étudier la régénération des nageoires, des écailles et des calvaires (calottes crâniennes)2. Différents paradigmes expérimentaux ont été utilisés pour étudier la régénération tissulaire et osseuse, tels que la résection de la nageoire (amputation), la fracture de la nageoire, la trépanation du crâne 3,4, la cryolésion 5,6 ou l’ablation génétique 7,8,9. Récemment, les approches d’ablation au laser ont été largement utilisées chez le poisson-zèbre pour étudier la réponse de guérison et de régénération après une blessure 10,11,12,13,14.

L’ablation médiée par laser a été utilisée dans différents domaines de la recherche biologique, tels que la mécanobiologie, la biologie du développement, la recherche sur la régénération et la chirurgie tumorale 10,11,12,15,16,17,18,19. Il existe différentes méthodologies d’ablation laser, telles que l’utilisation de lasers YAG (yttrium et aluminium grenat), UV (ultraviolet) ou 2p (deux photons)20. L’ablation au laser permet d’enlever des cellules uniques ou de plus grandes portions de tissus de manière très précise, ce qui permet d’étudier différents processus, tels que la réponse du système immunitaire à l’ablation tumorale21 ou lors de la régénération de l’opercule du poisson-zèbre. Dans ce dernier exemple, l’ablation a été confirmée par la disparition du signal fluorophore nucléaire et cytoplasmique et la coloration de la nécrose10,22.

Il est bien connu que la réponse immunitaire innée et sa cinétique régulée sont essentielles à une régénération tissulaire appropriée. Les neutrophiles et les macrophages sont les premières cellules à être recrutées sur le site de la lésion, où ils jouent différents rôles, tels que la libération de cytokines et de facteurs de croissance, l’élimination des débris cellulaires et le remodelage de la matrice extracellulaire23. Ce recrutement et la fonctionnalisation ultérieure des macrophages ont également été observés chez les nageoires de poisson-zèbreamputées 24 et l’opercule en développement, qui a été soumis à une « nanodissection » laser conduisant à l’ablation des ostéoblastes10. Dans cette dernière expérience, la récupération du nombre d’ostéoblastes, le développement normal de l’opercule et le recrutement de cellules immunitaires innées (neutrophiles, macrophages et cellules de type ostéoclaste) dans la zone blessée ont été observés après une ablation par laser UV et par laser à deux photons10. Des expériences chez le poisson-zèbre dans lesquelles le système immunitaire a été pharmacologiquement supprimé par l’utilisation de glucocorticoïdes ont montré une altération de la régénération en cas d’immunité mal régulée, soutenant le rôle fonctionnel du système immunitaire dans la réparation des tissus 3,10,25,26.

Ici, une méthodologie d’ablation par laser à deux photons pour étudier la biologie de la régénération osseuse dans les os de poisson-zèbre en développement est décrite. En particulier, l’effet de l’approche d’ablation des ostéoblastes dans l’opercule est montré en termes de réponse immunitaire, qui est étudiée en surveillant le recrutement des macrophages sur le site d’ablation.

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Protocole

Le protocole d’étude a reçu l’approbation de la Landesdirektion Sachsen, numéros de permis 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Les souches de poisson-zèbre utilisées ont été maintenues conformément à la législation nationale et dans des conditions normalisées comme décrit précédemment27,28. Les détails de tous les réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation des matériaux et des solutions

  1. Conservez les embryons dans 1x milieu E3. Préparez le média 1x E3 en diluant 170 ml d’un bouillon 60x E3 dans 10 L d’eau désionisée et en ajoutant 2 ml de bleu de méthylène à 0,1 %.
    1. Préparez le support 60x E3 en mélangeant 17,2 g de NaCl, 0,76 g de KCl, 2,90 g de CaCl2·2 H2O, 4,90 g de MgSO4·7 H2O dans 1 L d’eau autoclavée désionisée.
  2. Pour l’enrobage des larves, préparez à l’avance des aliquotes d’agarose à bas point de fusion (LMA) à 1 % et conservez-les à température ambiante.
    1. Pour préparer des aliquotes, dissoudre le LMA dans 1 milieu E3, p. ex., 500 mg de LMA dans 50 ml de 1 X E3 dans un erlenmeyer, chauffer la solution au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement, et la distribuer dans des aliquotes de 1 mL dans des tubes de 1,5 mL.

2. Élevage de poissons-zèbres et collecte d’embryons

REMARQUE : Des larves de poisson-zèbre double transgénique signalant la présence d’ostéoblastes engagés [osterix :nGFP = Tg(Ola.Sp7 :NLS-GFP)zf132]29 et de macrophages [mpeg :mCherry = Tg(mpeg :mCherry)gl23] ont été utilisés ici30 (Figure 1A).

  1. Installez le poisson-zèbre parental avec les transgènes uniques souhaités dans des cages d’accouplement standard la veille de l’accouplement.
    REMARQUE : Les cages d’accouplement standard permettent aux œufs de passer dans un compartiment inférieur où le poisson-zèbre parental ne peut pas les atteindre.
    1. Gardez les mâles et les femelles séparés jusqu’à l’accouplement à l’aide d’un séparateur dans la cage d’accouplement. Retirez le séparateur le matin du lendemain pour commencer l’accouplement.
  2. À midi, au plus tard, retirez les poissons-zèbres parentaux des bassins d’élevage et collectez les embryons, en filtrant l’eau de la cage d’accouplement à travers un tamis.
    REMARQUE : Dans le cas où l’âge exact des larves est décisif, récoltez les embryons à intervalles réguliers d’environ 30 minutes. Les compagnons de couvée doivent être utilisés dans des expériences avec différents groupes expérimentaux.
  3. Placez les embryons dans une boîte de 100 mm de diamètre contenant 1 milieu E3 et conservez-les dans un incubateur à 28 °C31.
  4. Retirez les ovules non fécondés et les embryons morts de la boîte à l’aide d’une pipette en plastique à l’aide d’un stéréomicroscope et changez 1x milieu E3 par jour.
  5. Avant l’expérience, triez les larves positives pour les transgènes rapporteurs à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence.

3. Intégration des larves dans l’agarose à bas point de fusion

  1. Faire fondre les aliquotes de LMA dans un thermobloc ou un bain-marie à 65 °C. Une fois que le LMA est fondu, maintenez-le à 42 °C jusqu’à ce qu’il soit intégré (Figure 1B). Ajouter 50 μL de MS-222 à 0,4 % à 1 mL d’aliquote de LMA fondue pour obtenir une concentration de MS-222 de 0,02 % pour l’anesthésie.
  2. Anesthésier 4 dpf (jours après la fécondation) larves (ou larves plus âgées) dans un milieu MS-222 E3 à 0,02 %.
  3. Transférez les larves anesthésiées dans une boîte à micropuits à fond de verre à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique de 3 mL et retirez l’excédent de milieu E3 avec la même pipette (figure 1B). Évitez le dessèchement des larves.
    REMARQUE : Plus d’une larve peut être incrustée dans une boîte simultanément ; Il est recommandé d’encastrer 3 à 5 larves pour laisser suffisamment de temps pour la mise en place.
  4. Prenez l’agarose LMA fondue du bain-marie/thermobloc et ajoutez une goutte (rafraîchissante) de LMA dans le plat, en recouvrant le fond de verre où les larves étaient positionnées. Faites attention à ce que le LMA ne soit pas trop chaud mais toujours liquide.
  5. Ensuite, placez les larves dans la position latérale souhaitée avant que l’agarose ne se solidifie. Ici, assurez-vous d’une position latérale dans laquelle l’opercule est aussi proche que possible du fond en verre de la boîte en préparation à la configuration du microscope inversé (Figure 1B).
  6. Laissez l’agarose se solidifier, puis ajoutez du milieu E3 (contenant un maximum de 0,02 % de MS-222) dans le plat pour éviter le dessèchement de l’agarose (figure 1B).

figure-protocol-1
Figure 1 : Représentation schématique de la procédure d’enrobage. (A) Double transgénique Tg(osterix :nGFP ; 29,30 larves de poisson-zèbre avec des ostéoblastes operculaires marqués en vert et des macrophages marqués en rouge ont été utilisés. (B) Le flux de travail de la procédure d’intégration, tel que décrit à l’étape 3 du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Imagerie in vivo des larves et ablation laser

  1. Pour ablater au laser des ostéoblastes dans l’opercule en développement du poisson-zèbre transgénique Tg(osterix :nGFP ; mpeg1 :mCherry)29,30, utilisez un microscope à balayage laser à deux photons inversé avec un objectif à eau 25x/0,95 ou une configuration équivalente.
  2. Placez la boîte avec les larves incrustées sur la platine microscopique du microscope inversé et positionnez la région souhaitée pour l’ablation au centre du champ de vision. L’opercule peut être facilement identifié à l’aide du signal de fluorescence GFP.
  3. Une fois que l’opercule est focalisé et centré dans le champ de vision du microscope, choisissez les paramètres de pile z (souvent des intervalles z de 1 à 2 μm sont utilisés) pour imager toute la largeur de l’opercule. Dans le même temps, choisissez la zone dans un plan z spécifique à ablater (généralement dans la zone postérieure de l’opercule). L’ablation laser à deux photons n’est exercée que dans ce plan.
    REMARQUE : Une résolution plus élevée dans la dimension z entraînera des temps d’imagerie plus longs, mais permettra des analyses volumétriques des données acquises plus tard.
  4. Imagez la zone d’intérêt de l’opercule avant l’ablation. Pour la détection GFP, utilisez un laser à lumière blanche à 488 nm et un détecteur hybride allant de 495 nm à 550 nm ou équivalent. Imagez les macrophages à l’aide d’une excitation de 555 nm (laser à lumière blanche), avec une portée de détection mCherry de 595 à 780 nm sur un détecteur hybride (ou équivalent).
    1. Utilisez le format d’image 512 x 512 pour un bon rapport qualité/temps (d’autres formats peuvent être utilisés si une résolution plus élevée ou une vitesse plus élevée sont souhaitées).
      REMARQUE : Un incubateur à température contrôlée installé au microscope peut être utilisé et réglé, par exemple, à 28 °C.
  5. Dessinez une région circulaire d’un diamètre de 25 μm (d’autres formes et tailles peuvent être sélectionnées en fonction de l’expérience) dans un plan 2D sélectionné, en mettant l’opercule en focus à l’aide de l’outil ROI.
  6. Pour effectuer l’ablation, appliquez une puissance d’ablation (mesurée sans objectif) à 450 mW et exposez la zone sélectionnée au laser à deux photons à une vitesse de balayage de 400 Hz et une durée totale de 10 s. Lors de l’ablation, la zone peut être visualisée à l’aide d’un détecteur hybride dans la gamme de 401 à 443 nm ou équivalent.
  7. Après l’ablation, confirmez la structure de l’ablation en imageant à nouveau la même pile z avec les mêmes paramètres que ceux utilisés avant l’ablation. La zone ablatée ne contient plus de cellules fluorescentes.

5. Récupération des larves et imagerie pour suivre le recrutement des cellules immunitaires

  1. Si l’imagerie du recrutement des cellules immunitaires doit être effectuée avec un certain retard, récupérer les larves de l’imagerie et de l’anesthésie. Retirez soigneusement les larves de la LMA à l’aide d’une pince ou d’une aiguille de dissection.
    1. Tout d’abord, retirez une couche d’agarose recouvrant les larves. Deuxièmement, retirez l’agarose en contact direct avec les larves. Omettez cette étape si l’imagerie immédiate du recrutement des cellules immunitaires a lieu.
  2. Remettez les larves dans un plat avec un milieu E3 pur et vérifiez leur récupération. Le rétablissement est évident par la nage des larves.
  3. À 4 ou 6 hpl (heures après la lésion), imagez à nouveau la zone de l’opercule en utilisant les mêmes réglages au même microscope pour vérifier les effets de l’ablation sur le recrutement des macrophages. Pour ce faire, répétez l’intégration (étape 3) et l’imagerie comme effectué précédemment (étape 4).
  4. Après l’imagerie, retirer les larves de la LMA. Le sacrifice des larves peut être effectué soit par incubation dans de l’eau glacée, soit par surdosage de MS-222 dans E3, selon les exigences légales. Les échantillons peuvent ensuite être utilisés pour des études de suivi ou être éliminés.

6. Analyse d’images et analyse statistique

  1. Traitez les images à l’aide d’un logiciel de traitement d’images tel que Fiji32. En fonction de la résolution z des données acquises, les analyses peuvent être effectuées en 2D ou en 3D.
  2. Quantifiez les macrophages manuellement en incluant des cellules clairement séparées, par exemple en discernant les corps cellulaires principaux, ou en quantifiant les cellules avec un marqueur nucléaire ou en mesurant l’aire en cas de chevauchement des cellules (étape suivante).
  3. Pour quantifier la zone, créez un masque englobant les macrophages. Pour ce faire, utilisez l’outil Image > Adjust > Threshold et créez un ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add) aux Fidji. Exclure les petites particules en arrière-plan pour la quantification.
    1. Ensuite, mesurez la surface (Analyser > Mesurer). Déterminez si les zones de fluorescence cellulaire qui se chevauchent doivent être incluses dans la mesure.
      REMARQUE : Ici, la zone d’ablation circulaire a été omise des mesures de zone car les macrophages recrutés ne peuvent pas être distingués dans cette zone.
  4. Générez des graphiques traçant les résultats de mesure à l’aide d’un logiciel approprié. Pour comparer les données avant et après l’ablation, effectuez un test statistique approprié (ici, un test t unilatéral apparié a été effectué).
    REMARQUE : Les figures peuvent être préparées à l’aide d’un logiciel de retouche photo et de conception graphique.

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Résultats

L’ablation au laser a été effectuée comme indiqué dans le protocole ci-dessus. Le signal GFP des ostéoblastes dans la zone ablée a disparu instantanément après l’ablation. Pour étudier la réponse de l’ablation des ostéoblastes en termes de réponse immunitaire, la présence de macrophages chez les larves de 6 dpf avant et à 6 hpl a été imagée. Avant l’ablation, très peu de macrophages ont été observés dans la zone de l’opercule10 (Figure 2). À 6 hpl, une forte accumulat...

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Discussion

L’ablation au laser a été appliquée dans diverses disciplines de la recherche biologique. En particulier, il a été utile comme méthode pour étudier la régénération tissulaire 10,11,12. Par exemple, le recrutement et les changements phénotypiques des cellules immunitaires innées ont récemment été analysés au fil du temps à l’aide d’un laser UV ou de tests d’ablation laser à deux photons, ainsi qu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) Transregio 67 (projet 387653785), la DFG SPP 2084 μBone (projet KN 1102/2-1) à FK. Ce travail a été soutenu par l’installation de microscopie optique (projet DFG 413875620), une installation centrale de la plate-forme technologique CMCB à l’Université technique de Dresde. Les travaux de l’université technique de Dresde ont été cofinancés par des recettes fiscales basées sur le budget approuvé par le Parlement saxon (Landtag).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorure de calcium dihydraté, CaCl2· ; H2OCarl Roth5239.1
Antenne parabolique de culture cellulaire, PS, 100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51Forme de l’embout droit, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm
Falcon Plaque à 6 puitsCorning353502
Antenne à micropuits à fond de verreMatTekP35G-1.5-14-CAntenne parabolique de 35 mm, lamelle de recouvrement n° 1,5, diamètre du verre de 14 mm,
laser multiphotonique Insight X3Spectra-Physics
Leica Application SuiteLAS X, Leica Microsystems
Agarose à faible point de fusion.Biozyme840101Biozym Plaque Agarose
Sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO4· ; 7H2OSigma-AldrichM5921
d’accouplementde nombreuses variétés, p.ex. Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
Chlorure de potassium, KClPanReac AppliChem131494
Chlorure de sodium, NaClCarl Roth3957.1
SP8 FALCON  ;Leica MicrosystemsEquipé d’un laser multiphotonique Insight X3 et du logiciel Leica Application Suite
Acier inoxydable Dissect NeedleBochem12010140 mm
Stereo Microscope System SZX16OlympusEquipé d’une base d’éclairage LED SZX2-ILLTQ
Armoires thermostatiques TS - WTWxylemTS 608/2-iPour l’incubation (embryon)
Transfert pipette, 3,5 mLSARSTEDT861171155 x 15 mm, LD-PE, transparente
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.Zeiss équipé d’unecaméra Axiocam MRm et d’un
non revêtu, , ,Cages logiciel AxioVision

Références

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