Mesure de quatre sous-types de cellules NK utérines à l’aide d’une coloration immunohistochimique fluorescente multiplexée chez des femmes présentant des échecs d’implantation répétés

Résumé

Cette étude présente une méthode pionnière pour quantifier les sous-ensembles de cellules tueuses naturelles utérines pendant la fenêtre d’implantation à l’aide de techniques avancées de coloration immunohistochimique par fluorescence multiplexée.

Résumé

L’immunohistochimie (IHC) joue un rôle crucial dans la recherche biologique et le diagnostic clinique, car elle est la méthode la plus couramment utilisée pour identifier et visualiser les antigènes tissulaires. Cependant, les méthodes traditionnelles de coloration IHC ont des limites pour distinguer divers sous-types de cellules immunitaires. Ce défi a poussé les scientifiques à explorer de nouvelles technologies et méthodologies pour l’identification et la différenciation précises des sous-types de cellules immunitaires. Ces dernières années, l’IHC multiplex s’est imposée comme une solution, permettant la détection simultanée de plusieurs antigènes et leur visualisation au sein d’un même échantillon de tissu. Les cellules tueuses naturelles utérines (uNK) jouent un rôle central dans les processus de début de grossesse, notamment la décidualisation, le remodelage des artères spirales utérines et l’implantation d’embryons. Différents sous-types de cellules uNK présentent des fonctions différentes, ce qui leur permet de coordonner divers événements biologiques pour un développement embryonnaire et une grossesse réussis. Par conséquent, des recherches approfondies sur les sous-types de cellules uNK sont essentielles pour élucider les mécanismes de régulation immunitaire pendant la grossesse. De telles études fournissent des informations précieuses et de nouvelles approches pour traiter des conditions connexes telles que l’infertilité et l’échec reproductif récurrent. Cet article présente un protocole détaillé de coloration IHC multiplex pour étudier la densité de quatre sous-types de cellules uNK dans des échantillons d’endomètre pendant la fenêtre d’implantation (WOI). Le protocole comprend la préparation des échantillons, l’optimisation des marqueurs de sous-types, l’imagerie microscopique et l’analyse des données. Ce protocole de coloration IHC multiplexe offre une spécificité et une sensibilité élevées, permettant la détection simultanée de différents sous-types de cellules uNK, fournissant ainsi aux chercheurs un outil puissant pour explorer les subtilités et les mécanismes de la régulation immunitaire pendant la grossesse.

Introduction

La première naissance vivante documentée après fécondation-transfert d’embryons in vitro (FIV-ET) a été signalée en 1978. Au cours des 40 dernières années, il y a eu une forte demande pour l’assistance de la FIV-ET parmi les couples infertiles¹. En 2021, 238 126 patientes ont initié un total de 413 776 cycles de FIV aux États-Unis. Il s’agit d’une augmentation de 25 % par rapport aux 2 années précédentes et de 135 % par rapport à 2012². Cette augmentation est principalement attribuée à la prévalence croissante de l’infertilité et à la planification tardive de la grossesse. Les progrès des techniques de culture d’embryons et des protocoles de superovulation ont conduit à une augmentation du taux de naissances vivantes par cycle TE, atteignant 30 % à 50 % chez les femmes de moins de 40 ans et moins de 30 % chez les femmes de plus de 40 ans². Cependant, malgré ces progrès, plus de la moitié des embryons transférés ne s’implantent toujours pas. L’échec répété de l’implantation, généralement défini comme un échec après trois tentatives consécutives ou plus de transfert d’embryons de haute qualité, touche 15 % des femmes qui subissent une FIV-ET³. Les couples atteints de RIF sont extrêmement vulnérables et plus enclins à subir des procédures coûteuses et inutiles qui peuvent les exposer à des risques excessifs⁴. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les causes du RIF et d’améliorer l’implantation embryonnaire pour améliorer le succès de la FIV-ET, en particulier pour les femmes atteintes de FIV. La préparation de l’endomètre est essentielle pour une implantation réussie de l’embryon. Ce processus est caractérisé par une accumulation importante de cellules tueuses naturelles utérines (uNK), qui passent de la constitution de 30 % des lymphocytes totaux de l’endomètre au cours de la phase médio-sécrétoire à 70 % à 80 % du décidua au début de la grossesse⁵. Notamment, les cellules uNK diffèrent des cellules NK périphériques, qui sont des lymphocytes cytotoxiques essentiels au système immunitaire inné pour provoquer la mort des cellules infectées par lyse ou apoptose. Bien que les fonctions exactes des cellules uNK ne soient pas encore entièrement comprises, plusieurs sources de preuves suggèrent qu’elles sont impliquées dans le remodelage de l’angiogenèse, l’invasion du trophoblaste et le développement fœtal⁶. L’association entre le pourcentage de cellules uNK par rapport aux cellules stromales et RIF a suscité beaucoup d’intérêt au cours des 20 dernières années. Une méta-analyse récente, qui comprenait 8 études portant sur 604 femmes, a démontré que la densité des cellules CD56+uNK pendant la phase lutéale moyenne est significativement augmentée chez les femmes atteintes de RIF par rapport aux témoins fertiles⁷. Cependant, il est important de noter que les caractéristiques des cellules uNK au cours de la phase lutéale moyenne diffèrent considérablement de celles des cellules NK déciduales (dNK). Bien que les cellules uNK puissent se différencier en divers sous-ensembles de cellules dNK après la grossesse, la mesure des cellules uNK seule ne représente pas avec précision les cellules dNK⁸. Les cellules uNK subissent une différenciation dynamique et jouent différents rôles dans le cycle menstruel et les processus de décidualisation, ce qui les rend plus complexes que ce qui peut être identifié par CD56 seul. Plusieurs marqueurs sont nécessaires pour obtenir une compréhension complète du comportement des cellules uNK pendant la préparation de l’endomètre. Notre étude récente a utilisé le séquençage de l’ARN unicellulaire pour identifier la diversité des cellules uNK tout au long des cycles menstruels. Les résultats, validés par cytométrie en flux, ont montré la présence de quatre sous-types distincts de cellules uNK, chacun présentant des changements dynamiques au cours du cycle menstruel⁹. L’analyse de l’enrichissement génétique et l’enrichissement fonctionnel de l’ontologie génétique indiquent que ces sous-ensembles uNK remplissent des fonctions différentes à différents stades de la menstruation. Néanmoins, la cytométrie en flux n’est pas universellement accessible dans les laboratoires cliniques, et le traitement immédiat du tissu endométrial frais pour la digestion enzymatique rend impossible la répétition des étapes expérimentales en cas d’erreur.

L’objectif de cette étude était donc d’étudier la mesure de ces quatre sous-populations de cellules NK à l’aide d’un test de coloration multiplexe, qui fournit une approche diagnostique plus pratique. Dans la coloration multiple, différents anticorps spécifiques contre chaque cible sont liés à différents marqueurs fluorophores qui émettent différentes longueurs d’onde de lumière lorsqu’ils sont excités par une longueur d’onde spécifique de lumière. Par rapport à la méthode traditionnelle de coloration IHC, cette méthode peut comparer quantitativement l’abondance relative et la distribution de plusieurs cibles dans un échantillon et fournir des informations sur l’interaction et la co-localisation de différentes cibles, ce qui nous permet d’identifier différents sous-types de cellules uNK. Cette approche permettra non seulement d’approfondir notre compréhension de la relation entre les cellules uNK et le RIF, mais aussi d’approfondir l’étude d’autres sous-populations de cellules immunitaires dans les maladies liées à l’endomètre.

Protocole

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche clinique du Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster (CREC ref no. : 2022.581). Les femmes atteintes de RIF ont été recrutées au Centre de technologie de procréation assistée de l’hôpital Prince of Wales de l’Université chinoise de Hong Kong. Le RIF a été défini comme l’échec d’une grossesse clinique après le transfert d’au moins 4 embryons de bonne qualité en un minimum de 3 cycles frais ou congelés chez une femme de moins de 40 ans¹⁰. Le consentement éclairé des participantes a été obtenu avant de prélever les biopsies de l’endomètre.

1. Acquisition et traitement d’échantillons d’endomètre

1. Moment du prélèvement de l’échantillon d’endomètre
   1. Prélever des échantillons d’endomètre en suivant un protocole strict pour assurer la cohérence entre les participants à l’étude. Pour les patientes ayant des cycles naturels, effectuer une analyse d’urine à partir du 9^e jour du cycle menstruel et effectuer une biopsie de l’endomètre le 7^e jour après le pic de LH (LH+7)¹¹ . Pour les patientes subissant un traitement hormonal substitutif (THS), administrer 6 mg de valérate d’œstradiol par voie orale par jour à partir du jour 2 du cycle menstruel.
   2. Évaluer l’épaisseur de l’endomètre par échographie au 13e jour du cycle menstruel. Lorsque l’épaisseur de l’endomètre atteint ou dépasse 8 mm, administrer la progestérone par voie transvaginale et effectuer une biopsie de l’endomètre 5 jours après l’administration de la progestérone¹².
2. Prélèvement et fixation d’échantillons d’endomètre : introduire un échantillonneur à pipette dans la cavité utérine, en l’amenant vers la région fundique ; Appliquez une aspiration en tirant vers le bas sur le piston interne, en grattant simultanément la surface de l’endomètre par des mouvements rotatifs et verticaux dans la cavité utérine. Rincez les échantillons prélevés avec une solution saline normale pour éliminer les sécrétions cervicales et utérines. Mesurez les échantillons et évaluez leur taille. Pour les échantillons de 3 mm x 15-25 mm, les immerger immédiatement dans 10 ml de formol tamponné neutre à 10 % et les fixer à température ambiante pendant 24 à 48 h.
3. Déshydratation : Une fois la fixation terminée, soumettre les échantillons à une séquence de déshydratation conçue pour remplacer l’eau par de l’éthanol. Pour ce faire, plongez les mouchoirs dans des bains à 70%, 80%, 90% et 100% éthanol pour assurer une déshydratation complète. Après le dernier bain d’éthanol, nettoyez les échantillons dans du xylène pour éliminer tout alcool résiduel et les préparer à l’infiltration de paraffine.
4. Embedding : Après avoir placé le tissu à plat sur le fond du moule, faites fondre la paraffine et ajoutez-la soigneusement aux échantillons pour vous assurer que le tissu endométrial est complètement encapsulé dans la matrice de paraffine. Après avoir rempli les moules de cire de paraffine, refroidissez-les sur une table de congélation pour favoriser la solidification de la cire de paraffine. Une fois que les blocs de paraffine durcissent, conservez-les à température ambiante jusqu’à ce qu’un traitement supplémentaire soit nécessaire.
   REMARQUE : Les moules utilisés ont été spécifiquement choisis pour s’adapter à la taille des échantillons d’endomètre obtenus afin de permettre au tissu endométrial de reposer à plat sur le fond sans se plier, assurant ainsi une orientation optimale pour la section ultérieure et sans créer d’excès inutile.
5. Sectionnement : Pour préparer le sectionnement, réfrigérez les blocs de paraffine à 4 °C pendant 2 h. Coupez les échantillons en sections de 4 μm à l’aide d’un microtome, puis aplatissez les tranches à la surface de l’eau distillée chauffée à 42 °C et montez-les sur des lames de verre adhésives. Placez les tranches sur un séchoir à lames pendant la nuit et conservez-les à température ambiante avant utilisation.

2. Optimisation des conditions d’immunohistochimie multiplex

1. Validation IHC : Pour la validation des paramètres de coloration IHC, adoptez une approche systématique pour affiner les conditions de récupération de l’antigène, la concentration d’anticorps et les temps d’incubation.
   1. Dans les plages de dilution recommandées par le fabricant, testez 2 à 3 concentrations pour chaque anticorps. Optimisez la récupération de l’antigène en comparant les tampons à pH 6 et pH 9, et évaluez les protocoles d’incubation à la température ambiante pendant 1,5 h et pendant la nuit à 4 °C.
   2. Évaluez méticuleusement chaque condition, en vous concentrant sur l’intensité de la coloration, la spécificité et le bruit de fond. Sélectionnez la combinaison optimale pour obtenir la coloration la plus claire et la plus spécifique avec un minimum de liaison non spécifique. Cette validation rigoureuse a permis d’assurer une précision et une reproductibilité maximales dans le protocole IHC.
2. Coloration monoplexe par amplification du signal tyramide (TSA) : après avoir déterminé les paramètres de coloration optimaux pour des anticorps individuels, optimisez l’appariement des anticorps avec différents colorants TSA. Associez le marqueur avec une expression plus élevée à un colorant avec un niveau d’intensité de fluorescence plus faible, ou vice versa. Au cours de cette phase, ajustez la concentration d’anticorps et le temps d’incubation en fonction de l’intensité du signal de fluorescence observé. Si une coloration de fond importante ou non spécifique est observée, changez le colorant^{apparié 13}.
3. Coloration multiplex TSA : Pour le protocole d’immunohistochimie multiplex (m-IHC), l’ordre séquentiel de coloration a été soigneusement défini selon des principes établis. Pour s’assurer que le processus de multiplexage reflète la sensibilité et la spécificité de la coloration à marquage unique, la priorité a été donnée aux anticorps ayant des niveaux d’expression plus faibles au début de la séquence de coloration. Placez les anticorps qui nécessitent une réparation de base pour la récupération de l’antigène à la fin de la séquence de coloration, car la réparation de base est robuste par rapport aux méthodes à base d’acide, qui peuvent, dans certains cas, amplifier les artefacts de coloration non spécifiques.
4. À l’aide des résultats des étapes 2.1 et 2.2, décider des anticorps à utiliser et à quelle étape, en fonction de leurs exigences de récupération d’antigènes et de leurs densités d’expression. Par exemple, l’anticorps CXCR4, qui nécessite une réparation de base pour la récupération de l’antigène, a été placé dans les dernières étapes de la coloration. À l’inverse, l’anticorps CD49a, qui se caractérise par une densité d’expression plus faible, a reçu la première position dans la séquence de coloration. Maximisez les chances de réussite de la détection et minimisez les effets de masquage qui pourraient se produire dans les dernières étapes de la procédure de multiplexage.
5. Pour les anticorps restants, testez différentes combinaisons au cours de la phase d’optimisation afin de déterminer la séquence la plus efficace qui équilibre à la fois sensibilité et spécificité. Les résultats de ces analyses comparatives guideront la composition finale du panneau multiplex, comme détaillé dans le tableau 1, en veillant à ce que le panneau sélectionné offre des performances optimales tout en minimisant le bruit de fond.

3. Processus m-IHC

1. Déparaffinage, hydratation et fixation : Cuire les sections de tissu à 60 °C pendant 2 h, puis immersion séquentielle dans du xylène I (10 min), du xylène II (10 min), de l’éthanol à 100 % (5 min), de l’éthanol à 95 % (5 min), de l’éthanol à 80 % (5 min), de l’éthanol à 75 % (5 min), du jdH₂O (2 min pour 3x), du formol tamponné neutre à 10 % (au moins 20 min), et jjH₂O (2 min pour 3x).
2. Récupération de l’antigène : Ajouter 200 ml du tampon AR6 ou AR9 respectif, tel qu’indiqué dans le tableau 1 pour chaque anticorps, dans une cassette de récupération d’antigène résistante à la chaleur. Placez les sections dans le tampon de récupération d’antigène approprié et faites chauffer au micro-ondes à puissance élevée pendant environ 2 minutes jusqu’à ébullition. Ensuite, couvrez la cassette sans serrer, chauffez à faible puissance pendant 15 min et laissez refroidir à température ambiante. Rincez les sections avec du ddH₂O et du PBST.
3. Dessin de la barrière hydrophobe : Après avoir retiré l’excès de solution avec du papier absorbant, tracez un cercle complet autour du tissu à l’aide d’un stylo barrière hydrophobe.
4. Inactivation de l’activité enzymatique endogène : Traiter les sections avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % et incuber pendant 8 min à température ambiante. Laver avec PBST 3x pendant 2 min chacun.
5. Blocage des sites non spécifiques : Après séchage avec du papier absorbant, appliquer une solution de blocage (1x Diluant d’Anticorps/Bloc) et incuber pendant 10 min à température ambiante.
6. Incubation avec l’anticorps primaire : Après le retrait de la solution bloquante, appliquer 150 μL du premier anticorps primaire, CD49a, sur chaque lame à une dilution de 1:1000 dans 1x Diluant d’anticorps. Incuber comme précédemment optimisé dans la section 2. Après l’incubation, laver les lames avec du PBST 3x pendant 2 min chacune. Pour les anticorps restants, voir le tableau 1 pour les taux de dilution spécifiques.
7. Incubation avec un anticorps secondaire : Avant d’appliquer l’anticorps secondaire, utilisez du papier absorbant pour éliminer l’excès d’humidité afin d’éviter la dilution du réactif. Ajouter 4 à 5 gouttes (environ 150 μL) de l’anticorps secondaire 1x Anti-Ms + Rb HRP sur chaque lame, suivie d’une incubation de 10 minutes à température ambiante. Effectuez trois lavages avec PBST pendant 2 minutes chacun après l’incubation.
   REMARQUE : Veuillez noter que l’anticorps secondaire 1x Anti-Ms + Rb HRP est spécifique des anticorps primaires de lapin et de souris.
8. Amplification du signal avec un colorant TSA : Après avoir éponger l’excès d’humidité, diluez le colorant TSA 1:100 dans le diluant d’amplification. Ajouter 150 μL de cette solution diluée de colorant TSA à chaque lame. Incuber 10 min à température ambiante. Laver avec PBST 3x pendant 2 min chacun.
9. Répétez les étapes 3.2 et 3.5-3.8 pour la procédure TSA en utilisant l’anticorps et le colorant correspondants.
10. Coloration des noyaux : Après avoir coloré le dernier anticorps, éliminer les fluorophores non liés en les faisant passer au micro-ondes des sections de 200 mL de tampon AR6 à l’intérieur d’une cassette résistante à la chaleur, en les faisant bouillir pendant 2 min, puis en les chauffant à faible puissance pendant 15 min. Refroidissez les échantillons à température ambiante et rincez-les avec du ddH₂O et du PBST. Ajouter 150 μL de solution de travail DAPI diluée dans du PBST (1:10) goutte à goutte, incuber pendant 10 min à température ambiante et rincer 2 fois avec du ddH₂O.
11. Montage : Une fois que les sections sont entièrement séchées à l’air libre dans un endroit sombre pendant environ 30 minutes, appliquez une seule goutte (environ 30 μL) de l’agent de montage fluorescent anti-trempe et placez les lamelles.
    REMARQUE : Protégez toutes les opérations de la lumière après la première application de colorant TSA. L’observation rapide et la capture d’images étaient essentielles à l’achèvement de la post-coloration pour éviter l’extinction de la fluorescence.

4. Acquisition et analyse d’images

1. Temps d’exposition : Capturez des images à l’aide d’un imageur qui hérite des longueurs d’onde d’excitation et d’émission correspondant aux fluorophores. Lors du réglage des temps d’exposition, vérifiez les diapositives avec un large éventail d’expressions de marqueur pour garantir la précision. Pour chaque combinaison marqueur/filtre, faites la mise au point manuellement sur différentes zones de la diapositive. Utilisez la fonction d’exposition automatique pour régler le temps d’exposition.
2. Sélectionnez les filtres en fonction des colorants TSA et examinez plusieurs diapositives pour déterminer les temps d’exposition optimaux par canal. Appliquez ces paramètres de manière cohérente à toutes les acquisitions ultérieures afin de maintenir la comparabilité tout au long de l’imagerie.
3. Sélection des zones de capture : Pour assurer un échantillonnage non biaisé sur toutes les coupes de tissus et une inclusion cohérente de l’épithélium luminal dans chaque champ analysé, sélectionnez au hasard la zone initiale pour l’acquisition de l’image, le critère critique étant la présence du bord de l’épithélium luminal.
4. Après la capture de cette trame initiale, sélectionnez systématiquement les zones suivantes en déplaçant une trame vers la gauche ou la droite du point de départ (en omettant une trame entre chaque image capturée) tout en conservant la bordure épithéliale luminale à l’intérieur du cadre. Répétez ce processus pour capturer au moins cinq zones différentes, chacune contenant au moins une partie de l’épithélium luminal, afin de maintenir une profondeur d’analyse constante sur¹⁴. Cette approche visait à inclure un minimum d’environ 10 000 cellules stromales dans tous les champs capturés afin d’assurer une collecte de données complète et représentative.
5. Analyse d’images
   1. Préparation de l’image : pour importer et analyser des images multispectrales, accédez d’abord à Fichier > Ouvrir l’image dans l’interface du logiciel pour charger les fichiers et la diapositive Autofluorescence (AF). Après avoir téléchargé les images, procédez au démélange des fluorophores en cliquant sur le bouton Sélectionner les fluors et en sélectionnant la bibliothèque spectrale appropriée. Une fois tous les fluorophores sélectionnés, cliquez sur OK pour confirmer la sélection. Pour isoler le spectre AF, utilisez l’outil Pipette AF pour échantillonner une zone représentative du tissu à partir de l’image AF, en prenant soin d’exclure tout pixel non tissulaire. Après l’échantillonnage, cliquez sur Préparer l’image ou Tout préparer dans le coin inférieur gauche de l’interface¹⁵.
   2. Segmentation tissulaire : lancez le processus de segmentation en délimitant manuellement une ligne de base de 3 à 5 régions par type de tissu dans l’image, y compris les zones épithéliales contenant des cellules épithéliales, les zones stromales contenant des cellules stromales et les zones vides sans contenu cellulaire. Si les résultats initiaux de la segmentation ne sont pas satisfaisants, annotez manuellement des régions supplémentaires pour améliorer l’ensemble de données d’entraînement, augmentant ainsi la précision et la fiabilité des analyses ultérieures. Cet ajustement dynamique des régions et des paramètres garantit que le logiciel peut identifier automatiquement des structures similaires dans les images actuelles et les autres images importées avec une précision accrue.
      REMARQUE : L’annotation initiale sert d’ensemble de données d’entraînement pour le logiciel afin d’apprendre les caractéristiques de chaque composant tissulaire. Les capacités de segmentation du logiciel sont ensuite affinées de manière itérative en fonction de la complexité et de la variabilité du tissu.
   3. Segmentation des cellules : cliquez sur Segmenter les cellules pour commencer la segmentation des cellules. Dans le paramètre Segmentation cellulaire, sélectionnez Noyaux et membrane. Choisissez DAPI pour identifier les noyaux cellulaires et ajustez le réglage d’intensité pour détecter tous les noyaux cellulaires sans bruit de fond. Sélectionnez les signaux CD16, CD49a et CD56 pour trouver la membrane et utilisez ce signal pour aider à la séparation nucléaire. Utilisez la fonction de séparation des composants nucléaires pour distinguer les noyaux situés à proximité.
      REMARQUE : DAPI met en évidence l’intérieur des cellules. La fonction de division des composants nucléaires permet de distinguer les noyaux cellulaires lorsqu’ils sont proches les uns des autres ou semblent fusionnés. Cette étape est importante pour obtenir des numérations cellulaires fiables et maintenir l’intégrité de l’analyse.
   4. Phénotypage cellulaire : Adoptez quatre marqueurs de surface cellulaire différents, notamment CD56, CD49a, CXCR4 et CD16, pour différencier différents sous-types de cellules NK. Dans le schéma de phénotypage, étiquetez ces quatre marqueurs comme les phénotypes à procéder. Dans la section Vue associée, attribuez des couleurs spécifiques à chacun des phénotypes pour l’identification. À l’aide du bouton Ajouter, classez les cellules comme exprimant positivement ou négativement les marqueurs ; par exemple, dans le phénotype CD56, les cellules peuvent être étiquetées comme CD56+ ou CD56-. Étiquetez manuellement au moins cinq cellules pour chaque phénotype pendant le processus d’entraînement. Effectuez un étiquetage manuel supplémentaire si la formation initiale ne donne pas de résultats efficaces.
   5. Une fois la configuration du phénotypage cellulaire définie, chaque cellule de l’image indiquera si les quatre marqueurs de surface sont exprimés positivement ou négativement. Exportez les données résultantes vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.
   6. Traitement des données : importez les données obtenues à partir de toutes les images dans une feuille de calcul pour traitement. Calculez les pourcentages de tous les sous-types de cellules uNK par rapport au nombre total de cellules de l’image. Le nombre final de cellules représente le nombre moyen sur plusieurs images, fournissant un aperçu complet de la population des différents sous-types de cellules uNK au sein de l’échantillon.

Résultats

Afin de maintenir une cohérence dans le moment du prélèvement d’échantillons d’endomètre pour les femmes subissant le cycle naturel, un test d’urine a été effectué pour détecter avec précision leur poussée d’hormone lutéinisante (LH), avec des biopsies de l’endomètre effectuées 7 jours après la poussée de LH. Pour les femmes subissant des cycles de THS, les échantillons ont été programmés précisément 5 jours après le début de la supplémentation en progestérone. Pour quantifier différents sous-types de cellules NK dans l’endomètre, la coloration m-IHC a été utilisée. Un schéma de la procédure expérimentale est illustré à la figure 1.

L’optimisation de la procédure expérimentale est essentielle pour obtenir des résultats de coloration m-IHC de haute qualité afin de garantir la précision et la cohérence des résultats de l’expérience. Initialement, l’IHC a été utilisé pour déterminer la concentration d’anticorps appropriée, avec la sélection de solutions de récupération d’antigènes AR6 ou AR9. Pour les anticorps tels que CD56, CD16 et CD49, une solution de récupération d’antigène avec un pH de 6 est recommandée, tandis que pour l’anticorps CXCR4, des résultats de coloration supérieurs ont été obtenus en utilisant une solution de réparation d’antigène avec un pH de 9 par rapport à un tampon de pH 6. Une fois que les paramètres, y compris le taux de dilution des anticorps, le temps d’incubation et les conditions de récupération de l’antigène, ont été déterminés, le colorant TSA le plus approprié peut être sélectionné en fonction de l’affinité de l’anticorps. Un colorant avec une faible luminosité de fluorescence doit être choisi pour compléter la haute affinité de l’anticorps. Les données de référence sur l’intensité du signal des colorants TSA se trouvent dans le tableau 2. Une fois l’essai de monoplexe TSA terminé, l’ordre du multiplex TSA peut être déterminé. Étant donné que les quatre anticorps sont conçus pour identifier différents sous-types de cellules uNK, la co-localisation entre les anticorps est inévitable. Pour réduire au minimum le chevauchement spectral et prévenir le brouillage entre les fractions fluorescentes, la stratégie suivante a été employée : choisir des fractions fluorescentes dont les longueurs d’onde sont aussi éloignées que possible, comparer la position et le nombre de signaux positifs du multiplex TSA avec ceux du monoplexe TSA pour garantir leur identité (figure 2) et assurer un arrière-plan clair (figure 3)¹⁶.

Après l’optimisation et l’achèvement des procédures de coloration m-IHC, le poste de travail d’imagerie a été utilisé pour l’acquisition d’images et le logiciel d’analyse d’images a été utilisé pour l’analyse approfondie des images (Figure 4). Pour la classification des cellules uNK, des méthodes traditionnelles et innovantes ont été utilisées. La classification traditionnelle divise les cellules NK en deux catégories, CD56+CD16- et CD56+CD16+¹⁷, en fonction du niveau d’expression de CD16. Sur cette base, nous avons cherché à délimiter davantage l’hétérogénéité des cellules NK à l’aide d’une nouvelle stratégie de classification. À l’aide du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) de nos recherches précédentes, nous avons isolé des cellules NK individuelles par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et effectué un séquençage de l’ARN pour capturer les profils transcriptomiques de chaque cellule. Notre analyse a révélé quatre sous-types distincts de cellules NK : NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-) et NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). Ces sous-types ont été caractérisés par l’expression différentielle de CD49a et CXCR4, CD56 servant de marqueur universel pour toutes les cellules NK. CD49a a été spécifiquement détecté dans les sous-types NK1 et NK2, tandis que CXCR4 était présent dans les sous-types NK2 et NK4. Pour valider cette classification, nous avons effectué une analyse par cytométrie en flux afin de garantir la précision de notre méthode de sous-typage (Figure 5)⁹. La proportion de chaque sous-type de cellules uNK est présentée en pourcentage par rapport au nombre total de cellules stromales.

Figure 1 : Schéma du déroulement de l’analyse des cellules NK de l’endomètre. Les principales étapes comprennent l’acquisition et la collecte de l’endomètre, l’optimisation du panel m-IHC, la coloration m-IHC de l’endomètre, ainsi que l’acquisition et l’analyse de l’image. Créé avec BioRender.com Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images représentatives pour la quantification des biomarqueurs via la coloration DAB, TSA monoplex et TSA multiplex. Des images représentatives de chacun des anticorps colorés par le DAB (panneaux de gauche), le TSA monoplex IHC (panneaux du milieu) et le TSA multiplex IHC (panneaux de droite) ont montré une déviation minimale lors du développement du m-IHC. Les images IHC simulées par la TSA ci-dessous imitent fortement les images en fond clair correspondantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résultats expérimentaux après coloration m-IHC de l’endomètre. (A) Une image non mélangée a été acquise à l’aide de l’imageur à un grossissement de 200x. (B) Agrandissement supplémentaire de cette image non mélangée. (C-F) Des images ont été observées dans les canaux TSA dye 570 (CD16), TSA dye 650 (CD56), TSA dye 620 (CXCR4) et TSA dye 520 (CD49a) après démixage à l’aide du logiciel d’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyser les images colorées au m-IHC. Les images ont été analysées à l’aide de la segmentation tissulaire (A), de la segmentation cellulaire (B) et des fonctions phénotypiques cellulaires (C) du logiciel d’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Analyse des sous-types de cellules NK de l’endomètre. (A) Les cellules NK de l’endomètre conventionnelles peuvent être classées en cellules CD56+CD16-NK et cellules CD56+CD16+NK en fonction de l’expression de CD16. (B) La méthode innovante d’analyse des sous-types a classé les cellules NK de l’endomètre en quatre catégories : NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-) et NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cycle de coloration	Marqueur	Clone	Compagnie	Produit	Dilution des anticorps	Tampon AR	Fluorophore
1	CD49a	Référence CL7207	Novus Biologicals	NBP2-76478	1:1000	AR6	TSA 520
2	CD56	CD564	Leica	NCL-L-CD56-504	1:100	AR6	TSA 650
3	CD16	SP175	ABCAM	AB183354	1:100	AR6	TSA 570
4	CXCR4	44716	R&D	MAB172	1:100	AR9	TSA 620

Tableau 1 : Liste des concentrations des anticorps et du colorant TSA utilisés dans le m-IHC.

Fluorophore	Mantra
Colorant TSA 520	Haut
Colorant TSA 540	Douleur moyenne
Colorant TSA 570	Douleur moyenne
Colorant TSA 620	Douleur moyenne
Colorant TSA 650	Haut
Colorant TSA 690	Bas

Tableau 2 : Colorants TSA et intensité de fluorescence correspondante.

Discussion

L’implantation embryonnaire implique une interaction complexe entre l’embryon et l’endomètre. Le statut immunologique de l’homéostasie de l’endomètre joue un rôle central dans la détermination de la réceptivité de l’endomètre. Au cours de l’OIO, la population leucocytaire prédominante dans l’endomètre est constituée de cellules NK. Environ 90 % des cellules uNK présentent une expression élevée de CD56, mais ne contiennent pas de CD16. Cependant, un sous-ensemble mineur de cellules uNK ressemble aux cellules NK du sang périphérique, affichant une faible expression de CD56 mais une expression positive de CD16¹⁸. Ces deux sous-types de cellules uNK présentent des fonctions distinctes. Le sous-type CD56+CD16- contribue principalement à la production de cytokines, au remodelage vasculaire et aux interactions avec les cellules trophoblastiques, qui sont cruciales pour l’établissement et le maintien de la grossesse. En revanche, le sous-type CD56+CD16+ présente une cytotoxicité plus élevée. À l’aide du séquençage de l’ARN unicellulaire, notre étude récente a catégorisé les cellules uNK en quatre sous-ensembles, en sous-regroupant les cellules NK régulatrices CD56+CD16- en trois sous-populations en fonction de leurs phénotypes et fonctions spécifiques⁹. Le sous-ensemble NK1, caractérisé par CD56+CD49a+CXCR4-, est impliqué dans le remodelage tissulaire. Le sous-ensemble NK2, identifié par CD56+CD49a+CXCR4+, régule la réponse immunitaire. Le sous-ensemble NK3, marqué par CD56+CD49a-CXCR4-, interagit avec les trophoblastes. Le sous-ensemble NK4, présentant CD56+CD49a-CXCR4+, partage des similitudes avec les cellules NK CD56+CD16+, présentant des fonctions cytotoxiques⁹. Dans la présente étude, pour la première fois, nous avons réussi à établir un protocole permettant d’identifier ces quatre sous-ensembles distincts de cellules NK en utilisant la coloration m-IHC.

La coloration IHC conventionnelle et la cytométrie en flux sont les méthodes les plus couramment utilisées pour identifier les cellules immunitaires, chacune ayant ses propres forces et limites¹⁹. Alors que l’IHC conventionnelle est largement utilisée en milieu clinique en raison de sa facilité d’accès, elle est confrontée à des défis pour détecter simultanément plusieurs antigènes et quantifier les signaux positifs. Cela représente un obstacle important à la caractérisation précise des phénotypes des cellules immunitaires, qui nécessitent souvent l’utilisation de plusieurs marqueurs pour une mesure précise. D’autre part, la cytométrie en flux est capable de détecter simultanément plusieurs marqueurs cellulaires, mais elle nécessite un grand volume d’échantillons frais et ne fournit pas d’informations spatiales sur l’emplacement des cellules dans le tissu. Notamment, les cellules immunitaires de l’endomètre ne sont pas uniformément dispersées dans le tissu endométrial ; par exemple, les cellules uNK sont plus densément agrégées près de la couche basale de l’endomètre par rapport aux zones proches de la cavité luminale²⁰. Ces limites de l’IHC conventionnelle et de la cytométrie en flux peuvent être résolues grâce à la m-IHC et à la plateforme d’analyse d’images conjuguée à des algorithmes d’apprentissage automatique pour réaliser la segmentation tissulaire, la segmentation cellulaire et l’identification des cellules positives. Cette approche améliore l’efficacité en analysant des dizaines de milliers de cellules en quelques minutes, minimise le biais de l’observateur en identifiant automatiquement les cellules positives et permet une analyse plus précise à l’aide de plusieurs marqueurs. De plus, il élimine le besoin d’échantillons frais et permet des expériences par lots ou des analyses répétées si nécessaire.

La réalisation d’une évaluation complète des phénotypes des cellules uNK à l’aide de la technique m-IHC peut fournir une compréhension plus profonde de la corrélation entre les cellules uNK et l’implantation d’embryons, ainsi que de leurs changements chez les femmes atteintes de RIF. Outre les cellules uNK, d’autres cellules immunitaires de l’endomètre contribuent également à l’homéostasie immunitaire locale. Par exemple, les lymphocytes T régulateurs (cellules Treg) maintiennent la tolérance immunitaire en libérant des facteurs inhibiteurs, tels que l’IL-10 et le TGF-β, qui suppriment l’activité des cellules Th1 et Th2²¹. La différenciation des macrophages M2, régulés par les stéroïdes et les cytokines Th2, contribue au statut immunotolérant en régulant à la hausse l’activité de l’arginase et en inhibant la production d’oxyde nitrique²². De plus, les cellules dendritiques (DC) se différencient en cellules tolérogènes matures dans l’utérus, libérant des facteurs tels que sFLT1 et TGF-β1 qui régulent la néogenèse vasculaire et inhibent la fonction des lymphocytes T CD8+, maintenant ainsi l’homéostasie immunitaire et soutenant le développement de l’embryon¹⁸. À l’instar des cellules uNK, ces cellules immunitaires sont également hétérogènes, et un seul marqueur ne peut pas identifier avec précision leurs phénotypes. L’application de la m-IHC pour l’évaluation des sous-ensembles de cellules uNK illustre le potentiel d’identification de sous-ensembles de ces cellules immunitaires endométriales.

En plus de l’endomètre, cette méthode peut être appliquée à divers tissus pour identifier les phénotypes des cellules immunitaires. Lors de son application sur d’autres tissus, seuls des ajustements mineurs sont nécessaires pour assurer une coloration optimale. De plus, si les chercheurs ont l’intention de remplacer certains marqueurs, le panneau d’origine peut être modifié pour répondre aux exigences expérimentales spécifiques. La polyvalence et la flexibilité de ce panel en font un outil adaptable pour l’étude de différents tissus ou de différents sous-ensembles cellulaires.

Cette technologie facilite non seulement la compréhension des changements détaillés dans les cellules immunitaires de l’endomètre pour disséquer le mécanisme sous-jacent de la non-réceptivité de l’endomètre, mais offre également un potentiel pour le développement de tests de diagnostic. La relative facilité d’obtention et de conservation des blocs et des sections de paraffine a ouvert la voie à l’utilisation généralisée de cette technique. Grâce à des panneaux de coloration standardisés, les hôpitaux peuvent tirer parti de la technologie de coloration automatisée en conjonction avec des algorithmes logiciels sophistiqués pour améliorer considérablement l’efficacité de leurs procédures d’analyse. Les avantages de la technologie m-IHC en font une option viable pour les cabinets cliniques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Anticorps primaires
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Anticorps primaires
CD16	abcam	ab183354	Anticorps primaires
CXCR4	R& D	MAB172	Anticorps primaires
Diluant d’amplification	Akoya Biosciences	Série FP1498	Tampon de dilution de fluorophore
Diluants d’anticorps	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Diluer l’anticorps
Solution tamponnée au citrate, pH 6,0 /9,0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Solution de récupération d’antigène
inForm logiciel d’analyse d’images avancé	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Logiciel d’analyse de données
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Imagerie spectrale
micro-ondes	Akoya Biosciences inverter Akoya Biosciences		Stripping micro-ondes
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	réactifs fluorescents adaptés à base de tyramide
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Réactifs fluorescents à base de tyramide
adaptés TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Réactifs fluorescents à base de tyramide adaptés
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Réactifs fluorescents à base de tyramide adaptés
Lames enrobées de poly-L-lysine	Fisher Technologies	120-550-15	Lames à usage histologique de routine
PolyHRP Anticorps Perkin	Elmer	à	Anticorps secondaires
Invitrogen&trade ;   ; Fluoromount-G&commerce ; Support de montage	ThemoFisher Science	495802	Installation
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Coloration des acides nucléiques