Article de méthode

Un essai toxicologique et écotoxicologique basé sur la motilité des hémocytes de la moule (Mytilus galloprovincialis)

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DOI :

10.3791/67285

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13 décembre 2024

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1Department of Biological and Environmental Sciences and Technologies (DiSTeBA), University of Salento, 2NBFC, National Biodiversity Future Center

Dans cet article

Résumé

L’article propose une nouvelle méthode in vitro pour l’évaluation rapide et sensible de la toxicité et de l’écotoxicité des polluants, basée sur la motilité des hémocytes de Mytilus galloprovincialis . La méthode vise à contribuer au développement d’essais d’exposition toxicologiques et écotoxicologiques plus éthiques et plus sensibles.

Résumé

Les hémocytes sont les cellules immunitaires circulantes chez les mollusques bivalves et jouent un rôle clé dans plusieurs fonctions importantes de l’immunité innée à médiation cellulaire. Au cours des premiers stades de la réponse immunitaire, les hémocytes migrent activement vers le site de l’infection. Cette motilité inhérente est une caractéristique fondamentale de ces cellules. Il représente une fonction cellulaire clé qui intègre de multiples processus, tels que l’adhésion cellulaire, la signalisation cellulaire, la dynamique du cytosquelette et les changements de volume cellulaire. Par conséquent, les altérations de la motilité cellulaire à la suite d’une exposition à des médicaments ou à des polluants peuvent servir de paramètre toxicologique utile. Malgré le rôle fondamental de la motilité cellulaire dans la physiologie cellulaire, elle a été peu étudiée d’un point de vue toxicologique. Ce travail propose une nouvelle méthode in vitro pour l’évaluation rapide et sensible de la toxicité et de l’écotoxicité des polluants, basée sur l’évaluation de la motilité des hémocytes de Mytilus galloprovincialis. Nous avons mis au point un test de motilité cellulaire sur des hémocytes adhérant au fond d’une microplaque de polystyrène de 96 puits. Suite à une exposition à des concentrations croissantes de médicaments, les trajectoires cellulaires et les vitesses ont été quantifiées par suivi cellulaire sous microscopie time-lapse, ce qui nous a permis de mesurer les effets sur la motilité des hémocytes. En raison de la facilité de collecte des hémocytes sur les animaux d’une manière relativement non invasive, la méthode proposée offre un test alternatif pour dépister les effets et les mécanismes d’action des polluants et des médicaments. Il s’aligne sur les critères des 3R (remplacement, réduction et raffinement), en répondant aux préoccupations éthiques et en contribuant à la réduction des essais in vivo sur les animaux vertébrés.

Introduction

Les méthodes fondées sur les effets, telles que les essais biologiques in vitro et in vivo, représentent des outils novateurs pour la détection des effets des polluants chimiques environnementaux dans les organismes vivants et pour leur utilisation comme outils de surveillance environnementale et d’évaluation des risques 1,2,3,4. Ils complètent l’approche chimique analytique classique en surmontant certaines de ses limites. Par exemple, les méthodes basées sur les effets peuvent évaluer la biodisponibilité des polluants, leur impact sur la santé des organismes et les effets toxicologiques combinés des mélanges. Ces effets combinés peuvent ne pas être prévisibles sur la seule base de l’analyse chimique5.

Ces dernières années, l’écotoxicologie des polluants préoccupants émergents (polluants émergents) représente un domaine où les méthodes basées sur les effets peuvent être des outils utiles pour détecter l’exposition et évaluer l’impact sur le biote 1,5,6,7. Plusieurs méthodes fondées sur les effets utilisent des mollusques bivalves comme organismes d’essai dans le cadre de la surveillance et de l’évaluation environnementales 8,9. Certaines caractéristiques rendent ces organismes aptes aux études écotoxicologiques, telles que leur large distribution, leur nature filtrée, leur mode de vie sessile, la capacité de bioaccumulation d’un large éventail de polluants environnementaux et de développer des réponses détectables aux polluants, la possibilité de travailler avec différents stades de vie et de maintenir dans des conditions de laboratoire7. Ils sont très sensibles à l’exposition à la pollution et réagissent diverses fois aux contaminants toxiques selon l’espèce, le stade de vie et les conditions environnementales 8,9,10. Par conséquent, plusieurs directives environnementales utilisent des espèces de bivalves comme espèces d’essai normalisées10,11.

Parmi les mollusques bivalves, le très répandu Mytilus galloprovincialis est l’une des espèces les plus utilisées dans le domaine écotoxicologique en raison de sa capacité à développer des réponses précoces détectables à l’exposition à la pollution chimique, y compris l’induction de métallothionéine, l’altération de l’enzyme antioxydante, la déstabilisation de la membrane lysosomale, la peroxydation lipidique, l’accumulation de lipofuscine, l’augmentation de la fréquence des micronoyaux, l’induction de l’anhydrase carbonique 12,13,14, 15. Traduction Les hémocytes, les cellules hémolymphhatiques immunocompétentes, sont largement utilisés pour étudier les impacts toxicologiques des polluants environnementaux chez les mollusques bivalves 4,13,16,17. Ces cellules sont cruciales pour la réponse immunitaire de l’organisme, remplissant plusieurs fonctions importantes de l’immunité innée à médiation cellulaire. Il s’agit notamment de l’élimination des microbes par phagocytose et de diverses réactions cytotoxiques, telles que la libération d’enzymes lysosomales, de peptides antimicrobiens et la production de métabolites de l’oxygène lors de l’explosion respiratoire 18,19,20. Les hémocytes sont des cellules intrinsèquement mobiles 21,22,23 capables de migrer vers le site de l’infection au cours du stade précoce de la réponse immunitaire de l’organisme. En général, la motilité est une caractéristique fondamentale qui caractérise toutes les cellules immunitaires puisqu’elle permet l’immunosurveillance de ces cellules pour protéger l’organisme24. La recherche sur diverses espèces de mollusques démontre que la motilité des hémocytes est un élément essentiel de leur réponse immunitaire, de la cicatrisation des plaies et de l’interaction avec les agents pathogènes. Cette motilité est régulée par des voies moléculaires spécifiques, mettant en évidence la complexité et la spécialisation des fonctions hémocytaires chez les mollusques 21,25,26,27.

Malgré l’importance fondamentale de la motilité dans la physiologie des hémocytes, très peu d’études ont examiné la sensibilité de la motilité des hémocytes aux polluants chimiques environnementaux 23,28,29,30. Récemment, notre groupe a caractérisé le mouvement spontané des hémocytes de Mytilus galloprovincialis dans une microplaque de polystyrène à 96 puits traitée par culture tissulaire et a examiné la sensibilité de la motilité des hémocytes à l’exposition in vitro au paracétamol23. Les hémocytes de M. galloprovincialis ont montré un mouvement cellulaire aléatoire basé sur des lamellipodes et des changements de forme rapides, comme précédemment observé chez une autre espèce de moule, Mytilus edulis 21,22,23,28, et déjà décrit dans les cellules immunitaires humaines31. Il a récemment été démontré que la motilité des hémocytes est sensible aux facteurs de stress chimiques23,28. Sur la base de ces résultats précédents, ce travail propose une nouvelle méthode in vitro pour l’évaluation rapide et sensible de la toxicité et de l’écotoxicité des polluants basée sur l’évaluation de la motilité des hémocytes de M. galloprovincialis et de ses altérations, par analyse vélocimétrique de la motilité cellulaire (quantification de la vitesse moyenne, de la distance migrée, de la distance euclidienne et de la directivité). La méthode offre la possibilité de dépister in vitro la toxicité de plusieurs substances, soit dans des essais à court terme (d’une durée de 1 à 4 h), soit dans des essais d’exposition prolongée d’une durée de 24 à 48 h.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la législation italienne sur le bien-être animal (D.L.26/2014) qui met en œuvre la directive du Comité européen du Conseil (2010/63 CEE). Mytilus galloprovincialis est un bivalve filtreur, communément appelé moule méditerranéenne. Il est originaire de la mer Méditerranée et de la côte atlantique du sud de l’Europe. Il a été introduit et est répandu dans l’ouest de l’Amérique du Nord, en Asie et en Afrique du Sud. Il s’agit d’une espèce importante de la pêche commerciale dans plusieurs régions du monde. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation d’eau de mer artificielle (ASTM) ou d’eau de mer naturelle filtrée

  1. Pour la préparation d’eau de mer artificielle ASW selon ASTM D1141-98 (2021)32, dissoudre les sels suivants dans de l’eau distillée (g pour 1 L) : 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO3, 3,33 MgCl2· 6H2O, 2,66 Na2SO4, 0,733 CaCl2 · 2H2O, 0,466 KCl, 0,067 KBr, 0,02 H3BO3, 0,013 SrCl2·6H2O, 0,0019 NaF. La solution ASW a un pH de 7,80.
  2. Pour la préparation de l’eau de mer naturelle filtrée (FSW), filtrer l’eau de mer naturelle 37 PSU, prélevée sur un site non impacté par les activités anthropiques avec des filtres de 0,2 μm.

2. Acclimatation animale

  1. Acclimater des spécimens de moules adultes (Mytilus galloprovincialis Lam.) pendant 24 h dans des bassins statiques (en cas de famine) contenant de la ASW ou du FSW aéré (1 L/animal) à 15 °C dans une salle thermostatique avant l’utilisation expérimentale.

3. Préparation du réactif pour l’évaluation de la motilité des hémocytes

  1. Préparez de l’eau de mer filtrée (FSW) comme ci-dessus ou une solution saline physiologique standard (SPS). Dissoudre HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine-éthanesulfonique) 4,77 g, NaCl 25,48 g, MgSO4 13,06 g, KCl 0,75 g, CaCl2 1,47 g dans environ 800 ml d’eau distillée, puis augmenter à 1 L par l’ajout d’eau distillée. Ajustez le pH à 7,36 avec 1 M de NaOH.
  2. Préparez une solution mère de rouge neutre de 20 mg/mL dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO).
  3. Préparez une solution de coloration rouge neutre : Ajoutez 5 μL d’une solution mère de rouge neutre à 995 μL de FSW ou de SPS.
  4. Préparer le FSW ou le SPS complété par 2 mM de L-glutamine, 40 UI/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine comme suit : Ajouter 100 μL de 2 mM de L-glutamine et 100 μL de mélange de pénicilline/streptomycine à 10 mL de FSW/SPS.
  5. Préparez du bleu de trypan à 0,4 % dans du FSW ou du SPS.
    REMARQUE : La solution mère de rouge neutre a été préparée conformément à Martínez-Gómez et al.33. La solution mère Neutral Red dure environ 2 à 3 semaines lorsqu’elle est conservée à 4 °C. Une solution de coloration rouge neutre et du bleu de trypan à 0,4 % doivent être préparées juste avant le dosage.

4. Échantillonnage de l’hémolymphe

  1. Préremplir une seringue avec 0,5 mL d’eau de mer filtrée FSW ou de SPS physiologique physiologique standard (à 15 °C).
  2. Séparez légèrement et soigneusement les valves le long de la surface ventrale à l’aide d’un scalpel. Maintenez le scalpel en position ou utilisez une pointe de pipette. Laissez l’aiguille d’une seringue hypodermique pénétrer dans l’espace entre les valves.
  3. Prélever délicatement 0,5 mL d’hémolymphe du muscle adducteur postérieur avec la seringue préremplie conformément à l’UNEP/RAMOGE34.
  4. Retirez l’aiguille de la seringue et transférez le contenu de la seringue dans un microtube.
  5. Prélever l’hémolymphe de 3 ou 4 moules et regrouper les échantillons d’hémolymphe dans un tube à 15 °C en utilisant le même rapport entre les individus.
    REMARQUE : Le préremplissage de la seringue est utilisé pour diluer immédiatement l’hémolymphe 1:1 pendant l’échantillonnage. La dilution de l’hémolymphe avec le FSW ou le SPS dans un rapport de 50:50 est couramment utilisée pour prévenir l’agrégation des hémocytes, selon Martínez-Gómez et al.33.

5. Placage et culture des hémocytes

  1. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
  2. Diluer l’hémolymphe à la concentration de 1 × 106 cellules/mL avec FSW ou SPS.
  3. Evaluer la viabilité des hémocytes en suspension par coloration au bleu de Trypan : Ajouter 100 μL de bleu de Trypan à 0,4 % dissous dans le FSW ou le SPS à 100 μL de suspension d’hémocytes. Incuber 5 min à 15 °C.
  4. Ensuite, ajoutez une goutte de suspension dans un hémocytomètre et comptez les cellules non colorées (viables) et colorées (non viables) sous observation microscopique.
  5. Évaluer la viabilité des hémocytes en pourcentage de cellules viables calculé sur le nombre total de cellules comptées35.
  6. Utiliser la formule suivante pour l’évaluation de la viabilité cellulaire35 :
    Cellules viables ( %) = [nombre de cellules viables/nombre total de cellules (viables + non viables)] x 100
  7. S’assurer que la viabilité des hémocytes doit être supérieure à 95 % pour poursuivre le protocole.
  8. Ajouter 50 μL d’hémolymphe diluée dans chaque puits d’une microplaque de polystyrène à fond plat de 96 puits traitée TC de culture cellulaire. Couvrez l’assiette avec son couvercle.
  9. Laisser les hémocytes adhérer au fond des puits pendant 30 min à 15 °C pour former une monocouche.
  10. Retirez l’excès d’hémolymphe en aspirant doucement avec une micropipette.

6. Essai à court terme

  1. Pour les essais à court terme (dans un délai de 1 à 4 heures), incuber immédiatement les cellules adhérentes au fond des puits avec 100 μL de la substance d’intérêt résolue dans le FSW ou le SPS à différentes concentrations à 15 °C. Utilisez au moins trois puits pour trois déterminations répétées de chaque condition expérimentale.
  2. Après l’incubation, évaluez la motilité cellulaire en suivant l’étape 8.

7. Essai d’exposition prolongée

  1. Dans le cas d’expositions prolongées, c’est-à-dire d’essais d’exposition de 24 à 48 heures, incuber les cellules adhérentes en culture à des concentrations croissantes de la substance d’essai dissoute dans le milieu de culture (FSW ou ASW) complétée par 2 mM de L-glutamine (40 UI/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine) à 15 °C. Utilisez au moins trois puits pour trois déterminations répétées de chaque condition expérimentale.
  2. Après l’incubation, évaluez la motilité cellulaire en suivant l’étape 8.

8. Évaluation de la motilité cellulaire par microscopie time-lapse

  1. Insérez la plaque multipuits contenant les hémocytes vivants adhérents dans un lecteur multimode.
  2. Évaluez la motilité des cellules vivantes adhérentes par imagerie en temps réel sur la plaque grâce à la microscopie time-lapse : capturez des images de la même région d’intérêt (ROI) (dimension du ROI utilisé : 720 μm x 720 μm) dans chaque puits à raison de 1 image toutes les 1 min pendant 10 min à l’aide du lecteur multimode sous grossissement 20x et visualisation en fond clair couleur.
  3. Pour une meilleure visualisation des hémocytes, colorez les cellules avec le colorant vital Neutral Red juste avant la microscopie à intervalle de temps comme suit :
    1. Retirer le milieu d’incubation de chaque puits.
    2. Ajouter 100 μL de solution de coloration de Rouge Neutre dissous dans une solution saline physiologique standard contenant la substance d’intérêt dans les puits de la plaque contenant les cellules adhérentes.
    3. Incuber les cellules à 15 °C pendant 15 min. Lavez l’excès de colorant.
    4. Ajouter 100 μL de la substance d’intérêt résolue dans le FSW ou le SPS. Visualisez les cellules pour l’évaluation de la motilité.
      REMARQUE : L’utilisation d’un lecteur multimode permet l’acquisition simultanée d’images à partir d’un grand nombre de puits, ce qui permet la détection simultanée de la motilité de toutes les conditions expérimentales et répétitions contenues dans le puits. Le colorant rouge neutre est retenu à l’intérieur des lysosomes, qui apparaissent comme de petites taches orange dans le cytoplasme, tandis que le noyau apparaît comme un trou translucide puisque le colorant vital acidophilus ne le tache pas. L’acquisition de l’image a été effectuée pendant 10 min à une température ambiante de 20 °C.

9. Suivi des cellules et calcul des paramètres vélocimétriques

  1. Analysez les images de la même région d’intérêt acquises en microscopie time-lapse par l’image J pour chaque puits.
  2. Enregistrez les images dans un dossier sans espace dans le nom. Les images peuvent être au format JPEG ou PNG.
  3. Ouvrez ImageJ. Cliquez sur Fichier > importer > séquence d’images.
  4. Effectuez le suivi de cellules sur des cellules individuelles à l’aide du plug-in de suivi manuel d’ImageJ. Les positions des cellules individuelles sont marquées dans des images consécutives, ce qui permet de suivre les changements de position au fil du temps.
  5. Analysez au moins 40 cellules par puits, à l’exclusion des cellules qui échappent au champ enregistré de l’analyse.
  6. Importez des ensembles de données à partir du plug-in ImageJ, « Suivi manuel », dans le logiciel Chemotaxis et Migration Tool disponible gratuitement.
  7. Quantifiez les paramètres vélocimétriques tels que la vitesse moyenne, la distance euclidienne, la distance migrée et la directivité à l’aide du logiciel Chemotaxis and Migration Tool selon les instructions détaillées rapportées dans le guide de l’utilisateur du logiciel36disponible gratuitement ou les étapes fournies ci-dessous :
    1. Importez des jeux de données du plug-in ImageJ « Suivi manuel » dans le logiciel Chemotaxis et Migration Tool.
    2. Sélectionnez le nombre de tranches souhaité (par exemple, le nombre d’images utilisées pour le suivi).
    3. Calibrez le logiciel en réglant la taille de pixel x/y et l’intervalle de temps. L’étalonnage x/y indique la longueur du bord d’un pixel en μm, tandis que l’intervalle de temps représente la durée entre chaque tranche.
    4. Après avoir ajusté les valeurs et les paramètres, cliquez sur Appliquer les paramètres.
    5. Tracez des trajectoires et exportez-les sous forme d’image. Cliquez sur le bouton Valeurs mesurées pour voir les valeurs mesurées. Enregistrez-le.
    6. Cliquez sur le bouton Statistiques et enregistrez la vitesse et la franchise de la série de pistes.
  8. Comparer les paramètres vélocimétriques calculés pour les cellules témoins avec ceux des hémocytes exposés à la substance d’essai à différentes concentrations.
    REMARQUE : La distance de migration (mesurée en μm) fait référence à la longueur du chemin de migration pendant la période d’observation (10 min). La distance euclidienne (également mesurée en μm) représente la distance en ligne droite entre le point de départ et le point d’arrivée de la cellule. La vitesse moyenne (exprimée en μm min-1) est calculée comme le rapport entre la distance migrée et la durée du suivi de chaque cellule. La directivité est définie comme le rapport entre la distance euclidienne et la distance accumulée pour chaque trajectoire.

Résultats

L’étude introduit une nouvelle méthode in vitro pour évaluer rapidement et avec sensibilité la toxicité et l’écotoxicité des polluants, en utilisant la motilité des hémocytes de Mytilus galloprovincialis. La figure 1A-C montre une imagerie représentative en accéléré des hémocytes après 30 min de fixation au fond du puits. Les cellules de la figure ont été colorées au rouge neutre juste avant l’évaluation de la motilité. Les mouvements cellulaires ont été suivis à l’aide de la microscopie optique à raison d’une image toutes les minutes pendant 10 min, sous un grossissement de 20x, avec un lecteur multimode. La figure 1A-C affiche trois des 11 images capturées à partir de la même région d’intérêt (ROI) à 0 min, 5 min et 10 min. Les mêmes cellules sont numérotées dans les trois figures pour mettre en évidence leur mouvement, et la numérotation reste cohérente sur toutes les figures pour illustrer clairement leurs trajectoires.

Les cellules montrent des mouvements unicellulaires basés sur l’activité des lamellipodes et des changements de forme rapides. Les cellules ont été marquées avec le colorant vital Neutral red pour améliorer leur visualisation pendant le suivi. Le rouge neutre est un colorant amphiphile et faiblement cationique qui peut facilement imprégner la membrane cellulaire. Une fois à l’intérieur des cellules, le colorant est piégé dans les lysosomes en raison de la protonation. Les hémocytes de moules, en particulier les granulocytes, présentent un système lysosomal bien développé ; par conséquent, ils sont bien visualisés par une coloration en rouge neutre, le cytoplasme riche en plusieurs lysosomes marqués en rouge et le noyau (non marqué par le colorant) apparaissant comme un trou translucide.

Grâce à l’application du protocole, deux principaux morphotypes d’hémocytes peuvent être observés selon Udayan et al.23 : (1) des cellules étalées en forme de haricot bipolaire et parfois un contour amiboïde, et des cellules rondes plus petites en forme d’étoile (cellules n = 3 et 10). Dans les deux types de cellules, le mouvement était caractérisé par des changements continus de forme, avec une extension et une rétraction continues des pseudopodes et des filopodes.

L’application du protocole permet d’évaluer avec succès la motilité des hémocytes en construisant des tracés de trajectoire, comme indiqué à la figure 2, et en calculant les principaux paramètres vélocimétriques tels que la vitesse moyenne et la directivité. Ceux-ci correspondaient respectivement à 6,46 ± 0,2 μm/min et 0,56 ± 0,02 (moyenne ± SEM) pour les cellules étalées et à 5,18 ± 0,34 μm/min et 0,37 ± 0,03 pour les petites cellules, respectivement dans des conditions physiologiques basales après 30 min de fixation au fond du puits. Par conséquent, le protocole permet de classer différentes populations d’hémocytes sur la base de paramètres vélocimétriques.

Grâce à l’application du protocole, des altérations du paramètre vélocimétrique de la motilité des hémocytes peuvent être détectées suite à une exposition à des médicaments ou à des polluants. La figure 3A-D montre des résultats représentatifs de l’exposition in vitro des hémocytes de moules au paracétamol, qui est l’un des produits pharmaceutiques rejetés dans l’environnement (PiE) avec la plus forte concentration et les fréquences de détection les plus élevées dans les rivières du mondeentier 31.

Selon Udayan et al.23, dans les cellules témoins, une augmentation significative de la vitesse avec le temps a été observée dans les deux morphotypes cellulaires, suggérant une activation des hémocytes pendant la culture de 24 heures, évoquant probablement la réponse inflammatoire induite expérimentalement par le retrait et le placage dans l’environnement de culture. Lorsque les cellules ont été exposées au médicament, l’activation de la motilité des hémocytes a été significativement réduite dans les cellules étalées (Figure 3A) après 24 heures, mais pas dans les petites cellules rondes (Figure 3C), caractérisées par une vitesse basale moyenne plus faible (telle qu’évaluée au temps 0). De plus, le protocole a permis de détecter des altérations de la trajectoire cellulaire suite à une exposition au médicament, comme l’indique l’augmentation significative de la directivité des petites cellules après 24 h et la diminution de la directivité après 1 h d’exposition dans les cellules étalées (Figure 3C,D).

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Figure 1 : Imagerie représentative en accéléré d’hémocytes neutres colorés en rouge après 30 min de fixation au fond du puits. Les cellules ont été colorées avec le colorant vital Neutral Red juste avant l’évaluation de la motilité. Les mouvements cellulaires ont été surveillés à l’aide de la microscopie optique à raison d’une image toutes les minutes pendant 10 minutes sous un grossissement de 20x. Par souci de concision, les panneaux A, B et C affichent trois des 11 images capturées à partir de la même région d’intérêt (ROI) à 0 min, 5 min et 10 min. Les mêmes cellules sont numérotées dans les trois figures pour illustrer leur mouvement, et les flèches indiquent les intervalles de temps. Les barres d’échelle représentent 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Tracé de trajectoire représentatif des hémocytes de M. galloprovincialis. Les trajectoires montrées proviennent d’un seul puits. Les trajectoires de 25 cellules sont représentées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Effet de l’exposition au paracétamol (24 h) sur la vitesse et la directivité des cellules étalées (A, B) et des petites cellules rondes en forme d’étoile (C, D). Les données sont exprimées en moyenne ± MEB. La signification statistique des données a été évaluée par ANOVA à un facteur et post-test de Tukey. *p < 0,05 vs. contrôle (p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit dans ce travail représente une nouvelle méthode in vitro adaptée à l’évaluation rapide et sensible de la toxicité des médicaments et des polluants basée sur l’évaluation de la motilité des hémocytes de M. galloprovincialis et de ses altérations. La motilité est un aspect particulier de la fonction immunitaire de ces cellules 21,22,23,37,38, par conséquent, toute altération de la motilité cellulaire peut présager des altérations de la fonction immunitaire de ces cellules. La motilité est une fonction cellulaire essentielle qui intègre plusieurs processus cellulaires, tels que l’adhésion cellulaire, la signalisation cellulaire, l’activité du cytosquelette, la signalisation intracellulaire et la régulation du volume cellulaire, et nécessite l’intégration et la coordination de signaux biochimiques et biomécaniques complexes 39,40,41. Chacun de ces processus ou les composants de chaque processus peuvent être des cibles potentielles de l’action toxique des médicaments et des polluants. Par conséquent, les altérations de la motilité de la vitesse et/ou de la trajectoire de la cellule représentent des points d’évaluation sensibles intégrant les effets sur plusieurs cibles cellulaires.

Le protocole convient à l’évaluation in vitro des effets des substances d’essai, soit dans le cadre d’essais à court terme (d’une durée de 1 à 4 heures), soit d’essais d’exposition prolongée, d’une durée de 24 à 48 heures, ce qui permet d’évaluer rapidement les polluants et les médicaments pour détecter les effets toxiques potentiels. En utilisant une plaque à 96 puits, la méthode facilite l’essai simultané de plusieurs substances ou de concentrations variables d’une même substance, ce qui permet d’économiser du temps et des réactifs. De plus, le protocole peut également être adapté pour être utilisé avec d’autres équipements, tels qu’un microscope à contraste de phase ou un microscope fluorescent. Dans ce cas, les cellules pourraient être imagées sans aucune coloration ou à l’aide de colorants vitaux fluorescents.

Bien que la méthode offre des alternatives nouvelles et sensibles pour le dépistage toxicologique, certaines limites de la méthode doivent être prises en compte pour des applications plus larges. Tout d’abord, la température est un aspect critique de l’application du protocole. On sait que les hémocytes des moules sont sensibles aux changements de température. Les effets de la température sur les hémocytes sont complexes, les températures élevées et basses ayant un impact négatif sur leurs fonctions immunitaires 42,43,44. Comme observé lors de la mise en place de la méthode, la phase critique concernant l’effet de la température sur la motilité cellulaire est la phase préliminaire de la récolte cellulaire, de l’adhésion et de la culture sur le substrat, qui doit suivre la température d’acclimatation des organismes. Des augmentations de température de quelques degrés au cours de cette première phase au-dessus de la température d’acclimatation peuvent être critiques pour l’acquisition de la forme et de la motilité des cellules étalées. Par conséquent, une température de 15 °C est recommandée pour la culture des hémocytes. L’acquisition d’images en accéléré pour l’évaluation de la motilité a été effectuée pendant 10 minutes à une température ambiante de 20 °C. D’après l’observation préliminaire lors de la mise en place de la méthode, l’exposition des cellules cultivées pendant cet intervalle de temps à 20 °C ne modifie pas significativement la motilité des hémocytes. Une autre limite de la méthode concerne le suivi manuel des hémocytes, qui peut introduire une variabilité dépendante de l’utilisateur et nécessiter beaucoup de temps et d’attention aux détails. Cependant, l’utilisation du colorant vital rouge neutre améliore la visualisation des cellules et, par conséquent, le suivi cellulaire grâce à la visualisation du système lysosomal bien développé. Le noyau n’est pas coloré par le colorant et se présente sous la forme d’un trou vide facilement reconnaissable et facilement pointable lors du suivi manuel de la cellule. Une autre limitation de la méthode est liée à sa nature in vitro. Bien que la condition in vitro fournisse un environnement contrôlé pour évaluer la motilité, elle peut ne pas reproduire complètement les interactions et les réponses complexes qui se produisent in vivo, en particulier dans les réponses immunitaires de l’organisme entier.

Ces dernières années, de nouvelles approches et méthodologies sont devenues couramment utilisées dans les sciences de la vie, dans le but d’améliorer les résultats et de réduire la dépendance à l’égard de l’expérimentation animale45. Le protocole offre un test sensible alternatif pour le dépistage in vitro des effets et des mécanismes d’action des polluants et des médicaments afin de dépister rapidement les effets toxicologiques des contaminants chimiques présents, individuellement ou en mélanges, dans les matrices environnementales. Il se concentre sur un nouveau point d’évaluation, la motilité des cellules du système immunitaire, qui peuvent fournir une réponse intégrée aux effets toxicologiques exercés par les médicaments et les polluants sur diverses cibles cellulaires. En ce sens, il élargit la gamme des tests in vitro disponibles dans la littérature, également dans la perspective d’une approche multi-essais intégrée pour une application dans la biosurveillance environnementale. Certaines caractéristiques du protocole l’alignent sur les critères des 3R (Remplacement, Réduction et Raffinement), contribuant ainsi à la réduction des essais in vivo sur les animaux vertébrés et à la mise au point d’essais toxicologiques et écotoxicologiques plus éthiques et écotoxicologiques. Ces caractéristiques comprennent la collecte facile de l’hémolymphe sur les moules d’une manière peu invasive, la petite quantité d’hémolymphe requise pour les essais et l’utilisation d’une plaque multipuits, qui permet l’exposition simultanée de plusieurs concentrations et répétitions de toxiques, ce qui permet des économies importantes de temps et de réactifs.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le projet « Dipartimento di Eccellenza » attribué à DiSTeBA par le Ministère italien de l’Université et de la Recherche, CUP : F85D18000130001, et par NBFC (National Biodiversity Future Center) financé par l’Union européenne NextGenerationEU, PNRR, projet n. CN00000033. Nous remercions également l’infrastructure BIOforIU du Département des sciences et technologies biologiques et environnementales de l’Université du Salento.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,2 et micro ; Filtre m (diamètre 25 mm)ABLUO  ;matériel de laboratoire
2,5 ml aiguille de seringue hypodermique 22GRays2522CM32matériel de laboratoire
en polystyrène à fond plat à fond plat à 96 puits microplaque traitée TCCorning3916matériel de laboratoire
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich)  ;C3881-1KGLogiciel
d’outil de chimiotaxie et de migration chimique  ;(Ibidi GmbH)logiciel
Cytation 5  ;Agilent BioTeckCytation 5Équipement : Lecteur multimode d’imagerie cellulaire
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)  ;Merk (Sigma - Aldrich)  ;472301Solvent
Falcon 15 mL Tube ConicalBottom Corning352196matériel de laboratoire
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich)  ;B0394
Hémocytomètre chimique Lecture rapide 102BiosigmaBVS100matériel de laboratoire
HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine-éthanesulfonique)Merk (Sigma - Aldrich)  ;H3375-500G
Chemical ImageJ softwareNIHsoftware
KBrMerk (Sigma - Aldrich)  ;P9881Chimique
KClMerk  ;104936produit chimique
L-glutamineMerk (Sigma - Aldrich)  ;G7513Acide aminé essentiel pour milieu de culture cellulaire
MgCl2· ; 6H2OMerk (Sigma - Aldrich)  ;M2670
Chimique MgSO4Merk (Sigma - Aldrich)  ;Microscope chimiqueM7506
Nikon Eclipse E600Nikon Équipement : Imagerie cellulaire  ;
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemical
NaClMerk (Sigma - Aldrich)  ;31434-1KG-RChemical
NaFFluka71519 500gChemical
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich)  ;S5761-1KGChimiquement
Neutre RougeMerk (Sigma - Aldrich)  ;N4638-1GColorant cellulaire vital
Pénicilline/StreptomycineMerk (Sigma - Aldrich)  ;P0781-100MLAntibiotiques pour la culture cellulaire
SrCl2· ; 6H2OMerk (Sigma - Aldrich)  ;255521Trypan
bleu chimiqueMerk (Sigma - Aldrich)  ;T8154Colorant cellulaire

Références

  1. Di Paolo, C., et al. Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring. Water Res. 104, 473-484 (2016).
  2. Brack, W., et al. Effect-based methods are key. The European Collaborative Project SOLUTIONS recommends integrating effect-based methods for diagnosis and monitoring of water quality. Environ Sci Eur. 31 (1), 10(2019).
  3. Lionetto, M. G., Caricato, R., Erroi, E., Giordano, M. E., Schettino, T. Potential application of carbonic anhydrase activity in bioassay and biomarker studies. Chem Ecol. 22 (sup1), S119-S125 (2006).
  4. Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E. Pollution biomarkers in the framework of marine biodiversity conservation: State of art and perspectives. Water. 13 (13), 1847(2021).
  5. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).
  6. Fabbri, E., Valbonesi, P., Moon, T. W. Pharmaceuticals in the marine environment: Occurrence, fate, and biological effects. Contaminants of Emerging Concern in the Marine Environment. León, V. M., Bellas, J. Chapter 2, Elsevier. Amsterdam. 11-71 (2023).
  7. Lionetto, F., et al. Autofluorescence of model polyethylene terephthalate nanoplastics for cell interaction studies. Nanomaterials. 12 (9), 1560(2022).
  8. Damiens, G., Gnassia-Barelli, M., Loquès, F., Roméo, M., Salbert, V. Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels. Chemosphere. 66 (3), 574-583 (2007).
  9. Ogidi, O. I., Onwuagba, C. G., Richard-Nwachukwu, N. Biomonitoring tools, techniques and approaches for environmental assessments. Biomonitoring of Pollutants in the Global South. Izah, S. C., Ogwu, M. C., Hamidifar, H. , Springer. Singapore. (2024).
  10. Rosner, A., et al. A broad-taxa approach as an important concept in ecotoxicological studies and pollution monitoring. Biol Rev. 99 (1), 131-176 (2024).
  11. Gagné, F., Burgeot, T. Bivalves in ecotoxicology. Encyclopedia of Aquatic Ecotoxicology. , 247-258 (2013).
  12. Caricato, R., et al. Carbonic anhydrase integrated into a multimarker approach for the detection of the stress status induced by pollution exposure in Mytilus galloprovincialis: A field case study. Sci Total Environ. 690, 140-150 (2019).
  13. Calisi, A., et al. Morphological and functional alterations in hemocytes of Mytilus galloprovincialis exposed in high-impact anthropogenic sites. Mar Environ Res. 188, 105988(2023).
  14. Viarengo, A., Burlando, B., Evangelisti, V., Mozzone, S., Dondero, F. Sensitivity and specificity of metallothionein as a biomarker for aquatic environment biomonitoring. Biomarkers in Marine Organisms. Garrigues, F., Barth, H., Walker, C. H., Narbonne, J. F. , Elsevier Science. Amsterdam. 29-43 (2001).
  15. Bocchetti, R., et al. Contaminant accumulation and biomarker responses in caged mussels, Mytilus galloprovincialis, to evaluate bioavailability and toxicological effects of remobilized chemicals during dredging and disposal operations in harbor areas. Aquat Toxicol. 89 (3), 257-266 (2008).
  16. Calisi, A., Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E., Schettino, T. Morphometric alterations in Mytilus galloprovincialis granulocytes: A new biomarker. Environ Toxicol Chem. 26 (6), 1435-1441 (2007).
  17. Burgos-Aceves, M. A., Faggio, C. An approach to the study of the immunity functions of bivalve haemocytes: Physiology and molecular aspects. Fish Shellfish Immunol. 67 (6), 513-517 (2017).
  18. Canesi, L., et al. Tyrosine kinase-mediated cell signaling in the activation of Mytilus hemocytes: Possible role of STAT-like proteins. Biol Cell. 95 (9), 603-613 (2003).
  19. Novas, A., Barcia, R., Ramos-Martínez, J. I. Nitric oxide production by hemocytes from Mytilus galloprovincialis shows seasonal variations. Fish Shellfish Immunol. 23 (4), 886-891 (2007).
  20. Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components. Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).
  21. Le Foll, F., et al. Characterization of Mytilus edulis hemocyte subpopulations by single-cell time-lapse motility imaging. Fish Shellfish Immunol. 28 (2), 372-386 (2010).
  22. Rioult, D., Lebel, J. -M., Le Foll, F. Cell tracking and velocimetric parameters analysis as an approach to assess activity of mussel (Mytilus edulis) hemocytes in vitro. Cytotechnology. 65 (5), 749-758 (2013).
  23. Udayan, G., Giordano, M. E., Pagliara, P., Lionetto, M. G. Motility of Mytilus galloprovincialis hemocytes: Sensitivity to paracetamol in vitro exposure. Aquat Toxicol. 265, 106779(2023).
  24. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  25. Ivanina, A., Falfushynska, H., Beniash, E., Piontkivska, H., Sokolova, I. Biomineralization-related specialization of hemocytes and mantle tissues of the Pacific oyster Crassostrea gigas. J Exp Biol. 220 (18), 3209-3221 (2017).
  26. Furukawa, F., et al. Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai. Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).
  27. Lau, Y., Gambino, L., Santos, B., Espinosa, E., Allam, B. Regulation of oyster (Crassostrea virginica) hemocyte motility by the intracellular parasite Perkinsus marinus: A possible mechanism for host infection. Fish Shellfish Immunol. 78, 18-25 (2018).
  28. Gendre, H., et al. Modulation of hemocyte motility by chemical and biological stresses in Mytilus edulis and Dreissena polymorpha. Fish Shellfish Immunol. 139, 108919(2023).
  29. Kaloyianni, M., et al. Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels. Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol. 149 (4), 631-639 (2009).
  30. Sendra, M., et al. Nanoplastics: From tissue accumulation to cell translocation into Mytilus galloprovincialis hemocytes. Resilience of immune cells exposed to nanoplastics and nanoplastics plus Vibrio splendidus combination. J Hazard Mater. 388, 121788(2020).
  31. Pizzagalli, D. U., Pulfer, A., Thelen, M., Krause, R., Gonzalez, S. F. In vivo motility patterns displayed by immune cells under inflammatory conditions. Front Immunol. 12, 804159(2021).
  32. ASTM D1141-98. Standard Practice for Preparation of Substitute Ocean Water. , (2021).
  33. Martínez-Gómez, C., Bignell, J., Lowe, D. Lysosomal membrane stability in mussels. ICES Techniques in Marine Environmental Sciences. 56, 1-41 (2015).
  34. UNEP/RAMOGE. Manual on the biomarkers recommended for the MED POL Biomonitoring Programme. UNEP. , Athens. (1999).
  35. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  36. Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0 Version 1.1. , (2013).
  37. Wilkinson, J. L., et al. Pharmaceutical pollution of the world's rivers. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (8), e2113947119(2022).
  38. Parisi, M. G., Pirrera, J., La Corte, C. Effects of organic mercury on Mytilus galloprovincialis hemocyte function and morphology. J Comp Physiol B. 191 (1), 143-158 (2021).
  39. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  40. Bailly, M., Condeelis, J. Cell motility: Insights from the backstage. Nat Cell Biol. 4 (5), E292-E294 (2002).
  41. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).
  42. Mosca, F., et al. Effects of high temperature and exposure to air on mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk 1819) hemocyte phagocytosis: Modulation of spreading and oxidative response. Tissue Cell. 45 (3), 198-203 (2013).
  43. Beaudry, A., et al. Effect of temperature on immunocompetence of the blue mussel (Mytilus edulis). J Xenobiot. 6 (1), 5889(2016).
  44. Wu, F., et al. Combined effects of seawater acidification and high temperature on hemocyte parameters in the thick shell mussel Mytilus coruscus. Fish Shellfish Immunol. 56, 554-562 (2016).
  45. Schmeisser, S., et al. New approach methodologies in human regulatory toxicology - Not if, but how and when. Environ Int. 178, 108082(2023).

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