Extraction en une étape et analyse zymographique des gélatinases bactériennes

Résumé

Les protéinases sont essentielles à la pathogenèse bactérienne, permettant l’invasion et l’évasion immunitaire. L’extraction en une seule étape des protéines cytoplasmiques et membranaires des bactéries sous leur forme active est éprouvante. Cet article vidéo démontre l’extraction de protéines cellulaires entières de Leptospira pour l’analyse zymographique afin de détecter et de caractériser les gélatinases.

Résumé

Les protéinases des bactéries pathogènes contribuent à l’invasion et à la pathogenèse en dégradant activement les composants de la matrice extracellulaire (MEC) et les barrières cellulaires de l’hôte, en modifiant la réponse immunitaire de l’hôte et en dégradant le système de défense de l’hôte. Cela fait des protéinases l’une des molécules les plus virulentes et leur identification et leur caractérisation sont essentielles pour prévenir et contrôler les maladies. De nombreuses bactéries possèdent également des protéinases liées à la membrane externe. L’isolement et la caractérisation des protéines de la membrane externe dans leurs formes actives présentent des défis importants en raison de leur localisation dans la membrane externe. Dans cette étude, nous démontrons une méthode en une seule étape pour extraire à la fois les gélatinases cytoplasmiques et associées à la membrane externe de Leptospira et démontrons leur activité enzymatique à l’aide de la zymographie. Dans cette méthode, nous utilisons du désoxycholate de sodium pour perturber la membrane cellulaire et libérer les protéines liées et de l’acide 6-aminocaproïque pour solubiliser la protéine membranaire libérée dans sa forme native. De plus, nous montrons une analyse zymographique des gélatinases leptospiralées. Cette approche fournit un cadre polyvalent pour isoler, purifier et caractériser les métalloprotéases, les collagénases et les gélatinases de divers agents pathogènes bactériens.

Introduction

La plupart des pathogènes bactériens doivent entrer en contact avec la matrice extracellulaire (MEC) de l’hôte lors de l’invasion et de la dissémination vers les organes cibles pendant la pathogenèse. Le collagène constitue le composant majeur de l’ECM des tissus animaux¹. Les gélatinases sont un groupe de protéases qui agissent sur le collagène et sa forme hydrolysée, la gélatine. La dégradation de l’ECM est principalement exécutée par un groupe de protéases, qui comprend les collagénases et les gélatinases ^2,3. Les pathogènes bactériens utilisent des collagénases et des gélatinases pour remodeler ou décomposer la MEC de l’hôte pour leur commodité en cas d’invasion et de pathogenèse ^4,5. Les enzymes bactériennes dégradant la MEC sont des candidats potentiels pour le ciblage des vaccins et des médicaments⁵.

Les protéases bactériennes se trouvent sous les formes sécrétoires et membranaires 6,7,8,9. De nombreuses méthodes d’extraction d’enzymes cellulaires sont inefficaces pour isoler les gélatinases et les collagénases bactériennes liées à la membrane, car ces procédures peuvent ne pas préserver efficacement la forme native des protéines liées à la membrane. De même, il existe des méthodes spécifiques à la membrane qui extraient uniquement les protéases et les gélatinases liées à la membrane. Les méthodes conventionnelles d’extraction des protéines totales, y compris les protéines membranaires, impliquent souvent des détergents et des ions chaotropiques, ce qui peut avoir un impact sur l’activité enzymatique. Une procédure d’extraction qui maintient l’activité enzymatique et la solubilité est essentielle pour la séparation électrophorétique et permet le développement de la zymographie pour détecter l’activité de la protéase.

Le désoxycholate de sodium, un détergent ionique qui peut lyser les cellules en perturbant la membrane cellulaire, permet la libération du contenu cellulaire et des protéines membranaires. L’acide 6-aminocaproïque peut solubiliser la protéine membranaire libérée sous sa forme native. La solubilisation par l’acide 6-aminocaproïque présente l’avantage de ne pas affecter l’électrophorèse. Ici, nous démontrons l’extraction de protéinases bactériennes cellulaires et membranaires à l’aide de désoxycholate de sodium et d’acide 6-aminocaproïque, en les stabilisant dans leur forme soluble native 10,11,12. Cette méthode solubilise efficacement les protéines de la cellule et de la membrane qui peuvent être utilisées directement sans électrophorèse interférant^13,14. Diverses caractérisations enzymatiques peuvent être effectuées en changeant les inhibiteurs de protéase et les ions métalliques utilisés dans le tampon d’activation, en fonction de l’application.

Protocole

1. Extraction des gélatinases bactériennes

REMARQUE : Voir le tableau 1 pour la préparation des réactifs et des matériaux.

1. Cultiver l’organisme dans un milieu Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) contenant 10 mg/mL d’albumine sérique bovine à 30 °C. Prendre 10 mL de culture de Leptospira dans la phase mi-log de croissance contenant 3,5 × 10⁸ cellules/mL pour les protéinases^{d’extraction 13,14}. Utilisez le comptage microscopique direct avec une chambre de comptage Petroff-Hausser sous un microscope à fond noir pour observer la phase mi-log de la croissance.
2. Récolter les cellules par centrifugation à 6 000 × g pendant 10 min, et jeter le surnageant dans un récipient pour la décontamination par autoclave à 121 °C pendant 60 min.
3. Transférez la pastille en la suspendant dans 1 mL de tampon de lavage dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifugez-la à 6 000 × g pendant 5 min. Répétez ce lavage.
4. Extraire la protéine de la pastille en ajoutant 100 μL de tampon d’extraction pour une pastille de Leptospira à partir de 10 mL de culture et de vortex pendant 5 min. Poursuivre l’extraction en incubant à 4 °C pendant 1 h. Recueillir la protéine extraite par centrifugation à 15 000 × g à 4 °C pendant 10 min, et jeter la pastille dans un récipient pour la décontamination par autoclave à 121 °C pendant 60 min.
5. Utilisez l’extrait de protéine directement pour la zymographie en ajoutant un volume égal de tampon d’échantillon 2x.
6. Utilisez le test d’estimation de Bradford pour déterminer la concentration en protéines.
7. Si la concentration en protéines est faible, précipitez-la avec de l’acétone en mélangeant la protéine avec un volume 4x d’acétone pour la précipitation et incubez-la pendant la nuit à -20 °C. Le lendemain, centrifugez l’échantillon à 10 000 × g pendant 10 min, séchez la pastille obtenue à l’air libre et mettez-la en suspension dans du PBS ou dissolvez-la dans le tampon souhaité et conservez-la à -20 °C jusqu’à 1 mois. Utiliser la lyophilisation pour le stockage ou le transport à long terme.
   REMARQUE : En raison des protéases actives dans l’extrait et de l’absence d’inhibiteurs de protéase, les protéines peuvent se dégrader dans l’échantillon.

2. Zymographie des gélatinases

1. Préparation de la gélatine co-polymérisée SDS PAGE gel
   1. Gel résolvant
      1. Préparez le mélange de gel résolvant en ajoutant les composants dans les quantités requises pour couler le gel. À 3,86 mL d’eau dans un bécher de 50 mL, ajouter 2,5 mL de Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 mL de la solution mère de gélatine à 10 %, 3,34 mL de solution d’acrylamide-bis acrylamide (ABA), 0,1 mL de SDS à 10 %, 0,006 mL de TEMED et 0,1 mL de persulfate d’ammonium à 10 % et bien mélanger sans mousse ni bulles. Le système mentionné (plaques de verre régulières ; 18 x 8 cm) nécessite 10 ml de mélange de gel de résolution.
         REMARQUE : Si la gélatine provient d’une aliquote congelée, décongelez-la jusqu’à ce qu’elle fonde pour éliminer la solution sans grumeaux. Ajoutez du persulfate d’ammonium juste avant la coulée, car la polymérisation commencera immédiatement après l’ajout de persulfate d’ammonium.
      2. Versez le mélange de gel de résolution dans la chambre de coulée jusqu’à ~3-5 mm sous le marquage du fond des puits. Évitez les bulles d’air.
      3. Versez lentement un peu d’eau pour obtenir une couche uniforme de 1 mm sur le dessus du gel et éliminez les bulles. Laissez le gel prendre pendant 1 h.
         REMARQUE : La formation de gel peut être confirmée en recherchant une séparation de phase entre la couche d’eau et le gel ; Le gel ne peut pas être versé même si la cassette de gel est inclinée.
   2. Gel d’empilage
      1. Préparez le gel d’empilage en mélangeant les composants suivants. À 1,84 mL d’eau dans un bécher de 10 mL, ajouter 2,5 mL de Tris-Cl (pH 6,6), 0,35 mL d’ABA, 0,03 mL de SDS à 10 % et 0,006 mL de TEMED. Le système de 8 x 10 cm de 1 mm d’épaisseur nécessite 3 mL de mélange de gel de résolution.
      2. À partir de la cassette de gel, décantez l’eau formée au sommet du gel en inclinant la configuration du gel d’un côté et en épongeant l’eau recueillie dans le coin à l’aide d’une étroite bande de papier filtre.
      3. Ajouter 0,03 mL de APS à 10 % au mélange mentionné à l’étape 2.1.2.1 et mélanger sans former de bulles.
      4. Versez le gel d’empilage sur le gel de résolution et placez immédiatement le peigne en position sans former de bulles d’air sous les dents du peigne, en laissant une épaisseur de 3 à 5 mm de gel d’empilage entre le gel de résolution et le bas des dents du peigne. Attendre au moins 3 h pour la polymérisation complète et la réticulation de la gélatine.
      5. Retirez l’entretoise inférieure et fixez le gel sur l’appareil d’électrophorèse.
      6. Placez lentement le gel dans le réservoir contenant 1x tampon d’électrode, en vous assurant qu’il n’y a pas d’air emprisonné au fond du gel.
2. Préparation de l’échantillon
   1. Ajoutez un volume égal de tampon d’échantillon à l’extrait et incubez à 37 °C pendant 30 minutes pour permettre au SDS de se lier à la protéine. Utilisez un échantillon contenant 2 μL de sérum humain avec un volume égal de tampon d’échantillon comme témoin positif.
3. Chargement de l’échantillon
   1. Chargez soigneusement l’échantillon dans les puits à l’aide d’une pipette à bout étroit ou d’une seringue Hamilton (0,5 à 1 ml). Ajouter progressivement un tampon d’électrode pour remplir les parties restantes des puits, le haut du gel et le réservoir supérieur de l’unité d’électrophorèse sans perturber les échantillons chargés.
      REMARQUE : La seringue Hamilton doit être soigneusement lavée entre les échantillons pour éviter la contamination croisée.
4. Électrophorèse en course à pied
   1. Commencer l’électrophorèse à 6 mA par gel et exécuter jusqu’à ce que le front du colorant pénètre dans le gel de résolution. Ensuite, augmentez le courant à 12 mA par gel et continuez jusqu’à ce que la face du colorant atteigne 1 cm au-dessus du bas du gel.
      REMARQUE : Le temps de fonctionnement peut changer en fonction de la concentration d’ABA utilisée et de la taille de la protéine cible.
5. Marquage de l’orientation des bandes de la norme
   1. Une fois l’électrophorèse terminée, démontez soigneusement les plaques de verre à l’aide d’un outil de séparation des plaques ou d’une spatule en plastique et marquez l’orientation du chargement de l’échantillon en coupant le coin inférieur droit du gel et marquez les bandes de marqueurs précolorées en perçant des trous à proximité ou en scannant le gel.
6. Renaturation d’enzymes résolues
   1. Immergez le gel dans une solution renaturante contenant du Triton X-100 dans un plateau de gel et incubez pendant 30 minutes à température ambiante sans agiter.
      REMARQUE : Triton X-100 renature les protéines, car le gel zymogramme contenant les protéines résolues peut être dénaturé et perdre de l’activité en présence de SDS.
7. Incubation pour l’activité de la protéase
   1. Remplacer la solution renaturante par un tampon d’activation qui immerge complètement le gel et incuber à 37 °C pendant 18 h dans un incubateur.
      REMARQUE : Modifier le tampon d’activation en ajoutant des inhibiteurs ou des activateurs de protéinases d’intérêt pour caractériser l’activité de la protéinase au besoin.
8. Coloration du zymogramme
   1. Après l’incubation, retirez le tampon d’activation et rincez brièvement le gel à l’eau pendant 1 min pour éliminer tout Triton X-100 restant et pour éviter la formation de mousse pendant l’agitation.
   2. Ajoutez la solution de coloration dans le plateau, en vous assurant que le gel est complètement immergé. Agitez doucement le gel à basse vitesse pour éviter de l’endommager. Continuez à colorer jusqu’à ce que le gel devienne complètement bleu.
   3. Enlevez l’excès de tache de la surface du gel en le rinçant à l’eau pendant 1 min. Ajoutez la solution de décoloration dans le plateau et secouez doucement. Remplacez la solution de décoloration par une solution fraîche plusieurs fois jusqu’à ce que le contraste de bande souhaité soit obtenu sur le fond bleu.
      REMARQUE : Lors de la décoloration, surveillez en permanence le gel pour vous assurer qu’il ne se décolore pas complètement, ce qui permet l’observation et l’enregistrement des bandes protéolytiques.
   4. Numérisez le gel dans un système de documentation de gel ou un scanner de documents, et déterminez la masse moléculaire des bandes de protéines en les comparant aux étalons de protéines.

Résultats

Le résultat montre le zymogramme de la protéine leptospirale et des gélatinases du sérum humain. Les résultats, illustrés à la figure 1, représentent les protéases sous forme de bandes blanches claires sur un fond bleu. Les bandes représentent les zones où la gélatine copolymérisée est dégradée et donc non colorée, tandis que d’autres zones de l’ensemble du gel sont colorées en bleu en raison de la présence de gélatine. De plus, il montre que même si la gélatine est également une protéine, e...

Discussion

Lors de la préparation du gel d’acrylamide, la gélatine copolymérise avec la matrice polymère d’acrylamide. Par conséquent, la gélatine co-polymérisée reste immobilisée au sein du gel et ne migre pas lors de l’électrophorèse, alors même qu’il s’agit d’une protéine. Après électrophorèse, les protéines natives extraites à l’aide de désoxycholate et d’acide 6-aminocaproïque tampon se séparent en fonction de leur masse et de leur charge. Après avoir retiré le SDS, ces protéines se renaturent...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide 6-aminocaproïque	Merck	A2504
Acide acétique	; Sigma	; 695092
Acétone	;   ; Sigma	; 32201
Acrylamide	;   ; Sigma	; A-3553
Persulfate d’ammonium	;   ; Sigma	; A-3678
Bis Acrylamide	;   ; Sigma	; Référence M7279
Albumine sérique bovine fraction V (BSA)	; Sigma	; A-8022
Bleu bromophénol	;   ; Sigma	; Réf. B-8026
CaCl2	Merck	Réf. C4901
Coomassie bleu brillant	;   ; Sigma	1.12553
Désoxycholate	;   ; Sigma-Aldrich	D6750
Ellinghausen&ndash ; McCullough&ndash ; Johnson&ndash ; Harris (EMJH) moyen, Difco	; Difco	; 279410
Gélatine	Merck	G9382
Glycérol	Merck	Référence G5516
Glycine G8790	;   ; Sigma	; G-8898
Leptospira interrogans sérovar de Copenhague souche Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198)  ;, conservée dans la biobanque de l’ICMR-RMRC Portblair	Conservé dans la biobanque de l’ICMR-RMRC Port Blair		Température de croissance optimale 30 ° ; C
Chlorure de magnésium M8266	; Sigma	; Référence M8266
Méthanol	;   ; Sigma	; 17995-7
Solution saline tamponnée au phosphate	;   ; Sigma	P4417  ;
Outil de séparation des plaques	Wonder Wedgle
Rotor	Thermoscientifique	FIBERLite F15 8x50 cy
Dodécylsulfate de sodium (FDS)	;   ; Sigma	; L-4396
TEMED	;   ; Sigma	; Réf. T-9281
Triton X-100	;   ; Sigma-Aldrich	Réf. T8787
Base Trizma (TRIS)  ;	;   ; Sigma	; Réf. T6066