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Article de méthode

Enrichissement des protéines subcellulaires chez Leptospira à l’aide d’une approche de fractionnement basée sur le Triton X-114

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DOI :

10.3791/67298

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8 août 2025

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1Department of Biochemistry, ICMR - Regional Medical Research Centre, 2Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg

Dans cet article

Résumé

Bien que les procaryotes n’aient pas de système organellar, il existe des régions subcellulaires avec des protéines localisées. L’analyse quantitative et qualitative des enzymes et des protéines dans les régions subcellulaires est importante pour le développement de cibles médicamenteuses et vaccinales. Ici, nous illustrons le fractionnement subcellulaire des protéines Leptospirales à l’aide de Triton X-114 et son analyse.

Résumé

Les procaryotes n’ont pas d’organites subcellulaires précis mais présentent des régions distinctes telles que le cytoplasme, la membrane interne, le périplasme et la membrane externe, où la plupart des fonctions biochimiques et physiologiques sont organisées. Ainsi, la compréhension des caractéristiques fonctionnelles des protéines nécessite d’élucider leur localisation subcellulaire. Cependant, l’extraction de protéines subcellulaires à partir de bactéries à Gram négatif pose des défis en raison de leur bicouche phospholipidique complexe. Bien que Triton X-114 se soit montré prometteur dans l’extraction des protéines de la membrane externe (OMP), un protocole concis reste insaisissable. Ce protocole démontre un flux de travail étape par étape pour l’extraction de protéines subcellulaires à l’aide du spirochète Leptospira comme modèle. Cette technique, caractérisée par le fractionnement subcellulaire et la séparation de phase, produit des fractions distinctes pour les protéines cytoplasmiques, externes et membranaires internes. Le détergent Triton X-114 est bien adapté à la séparation de phases en raison de sa température optimale du point de trouble (~22 °C) et de sa faible concentration micellaire critique (CMC), permettant une extraction et une purification efficaces des protéines natives avec une dénaturation minimale. L’analyse révèle notamment l’efficacité de la discrimination des protéines des membranes interne et externe distinctes du cytoplasme.

Introduction

Les analyses protéomiques subcellulaires (SCP) jouent un rôle central dans l’élucidation de la pathogenèse bactérienne en analysant le protéome dans des compartiments subcellulaires spécifiques des cellules bactériennes. Cette approche protéomique subcellulaire caractérise les protéines bactériennes au sein de compartiments distincts, réduisant la complexité en excluant les protéines très abondantes et en fournissant des informations sur leur organisation et leur abondance proportionnelle 1,2. Par exemple, en utilisant des techniques de fractionnement subcellulaire et de LC-MS/MS, une étude sur Shewanella oneidensis a dévoilé une partie substantielle de son protéome, fournissant des détails cruciaux concernant l’architecture des compartiments de l’abondance des cellules et des protéines. Cette étude sert de cadre fondamental pour les recherches ultérieures sur l’organisation subcellulaire chez les bactéries à Gram négatif3. Dans le domaine de la pathogenèse bactérienne, il est impératif de délimiter le protéome bactérien au cours d’une infection in vivo pour comprendre les mécanismes à l’origine de la pathogénicité4. L’étude du protéome de Salmonella intracellulaire dans les cellules épithéliales à divers stades de l’infection a permis de dévoiler les stratégies adaptatives employées par les agents pathogènes bactériens dans leur milieu intracellulaire 4,5. Les stratégies SCP fournissent des informations complètes sur la dynamique cellulaire en évaluant l’abondance et la translocation des protéines au sein de divers compartiments cellulaires. Cette méthode facilite l’identification extensive des protéines de divers compartiments bactériens, améliorant ainsi l’analyse approfondie des protéomes bactériens 6,7.

La distribution subcellulaire des protéines dicte non seulement leur activité fonctionnelle, mais améliore également leur diversité fonctionnelle8. Par exemple, les enzymes présentent des mécanismes de régulation et des niveaux d’activité variés en fonction de leur localisation subcellulaire. Les transglutaminases (TGases), par exemple, présentent des rôles ou des mécanismes de régulation distincts dans différents compartiments subcellulaires des tubes polliniques : les TGases cytoplasmiques incorporent des amines primaires dans des protéines cytosoliques (par exemple, l’actine et la tubuline) de manière dépendante du Ca(2+), en interaction avec le cytosquelette ; les TGases membranaires sont associées aux membranes de Golgi et aux membranes plasmiques, ce qui suggère un rôle dans l’administration d’exocytotes ; et les TGases associées à la paroi cellulaire régulent la croissance apicale en colocalisant avec des marqueurs de la paroi cellulaire. Ces distinctions fonctionnelles sont médiées par des rôles spécifiques aux compartiments9. De plus, la réparation des protéines oxydées dans l’enveloppe bactérienne souligne le rôle critique des systèmes enzymatiques au sein de compartiments cellulaires spécifiques exposés aux espèces réactives de l’oxygène10. Considérons l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS), dont la localisation subcellulaire est modulée par les modifications lipidiques, influençant son interaction avec diverses membranes cellulaires11. La compartimentation enzymatique maintient des environnements distincts propices aux interactions entre les enzymes et les substrats, facilitant ainsi les processus métaboliques spécifiques au compartiment12.

Les bactéries et autres procaryotes n’ont pas d’organites subcellulaires clairs ; Il existe des régions distinctes, notamment le cytoplasme, la membrane interne, le périplasme et la membrane externe. La plupart des fonctions biochimiques et physiologiques de l’organisme sont organisées dans divers compartiments sous-caveux13. Ainsi, la localisation subcellulaire des protéines est importante pour prédire leurs caractéristiques fonctionnelles. Cependant, l’extraction de protéines subcellulaires à partir de bactéries à Gram négatif pose des défis en raison de leur bicouche complexe de phospholipides à double membrane. Les méthodes d’extraction conventionnelles, utilisant des détergents comme le dodécylsulfate de sodium (SDS) et des additifs tels que l’urée, compromettent souvent l’intégrité des protéines membranaires, ce qui a un impact sur les analyses en aval14,15. De plus, la composition lipidique joue un rôle important dans la formation des altérations conformationnelles des protéines membranaires. Le succès de la solubilisation dépend de facteurs tels que le rapport détergent-lipide-protéine, car le processus implique l’insertion d’un détergent dans la bicouche lipidique suivie d’une solubilisation des protéines16. Le choix du détergent est essentiel pour solubiliser efficacement les protéines membranaires, compte tenu de facteurs tels que la température du point de trouble et le temps d’incubation17. L’environnement lipidique peut influencer les changements conformationnels des protéines membranaires18,19.

Les détergents sont essentiels pour extraire les protéines membranaires des membranes biologiques et assurer leur solubilité dans les solutions aqueuses, condition préalable à la purification ultérieure des protéines. Cependant, la purification des protéines membranaires est souvent difficile car elles sont retirées de leur environnement membranaire lipidique natif et placées dans un tampon détergent, qui ne reproduit que partiellement les propriétés physiques et chimiques de la membrane20. Après l’extraction, les protéines membranaires sont généralement purifiées au cours de processus ultérieurs à l’aide de la dialyse, de la précipitation des protéines et de certaines méthodes de chromatographie sous forme de protéines solubles20,21. La séparation de phase offre une alternative ou un complément puissant aux protocoles de purification basés sur la chromatographie et peut être appliquée directement aux protéines solubilisées. Fondamentalement, la séparation de phase permet aux protéines membranaires intégrales de se répartir en phase d’enrichissement au détergent et en protéines cytosoliques dans la phase aqueuse appauvrie au détergent20,22. Plusieurs détergents ont été décrits comme étant utilisés dans la solubilisation des protéines membranaires dans des études antérieures20. Il s’agit notamment de la famille Triton (Triton X-100 et Triton X-114), de la famille Tween (Tween-20 et -80), des détergents anioniques, des détergents cationiques, des détergents monoéther de polyoxyéthylène glycol, etc., mais ils ont des avantages et des inconvénients en termes de structure et de fonction des protéines20. Les propriétés physico-chimiques de ces détergents influencent grandement la répartition de phase et la solubilisation des protéines membranaires20. Les détergents sont des molécules amphipathiques avec un groupe de tête polaire et une chaîne hydrocarbonée hydrophobe. À de faibles concentrations, ils existent sous forme de monomères dans l’eau. Au-dessus de la concentration micellaire critique (CMC), elles forment des micelles dont la taille dépend du type de détergent, le nombre d’agrégation indiquant le nombre de molécules par micelle (également appelé poids moléculaire micelle). Un autre facteur important est le « point de trouble » qui peut être atteint en modifiant la température d’une solution aqueuse de détergent micellaire qui devient trouble et finit par former deux phases distinctes. Ce processus est connu sous le nom de séparation de phase ou d’extraction de points de nuage. Une CMC élevée peut produire plus de protéines membranaires correspondant à des concentrations élevées de détergent avec une liaison plus faible, qui peuvent être dialysées contre un tampon avec une concentration de détergent définie20. Cependant, l’atteinte d’une CMC élevée dans la plupart des détergents nécessite une température de point de trouble élevée, ce qui peut affecter la structure et la fonction des protéines extraites et affecter les processus en aval. Même la forte concentration de détergent dans cette phase peut être nocive pour les protéines et créer des problèmes de manipulation des liquides pour le pipetage d’un volume précis en raison de la viscosité élevée. Par exemple, le triton X-100 a un rendement élevé de protéines membranaires dans la micelle du détergent au-dessus de la température du point de trouble de 64-65 °C. Pour maintenir la température de travail, 9 % -23 % (NH4)2AINSI4 ou 16 % à 25 % d’ajout de NaCl peut être réduit à température ambiante (RT), ce qui entraîne une forte concentration de détergent, ce qui affecte probablement la stabilité des protéines. De même, l’extraction par interpolation utilise une température élevée du point de trouble (76 °C pour l’entretoise 20 et 93 °C pour l’entretoise 80). Le détergent anionique SDS est fréquemment utilisé dans les applications de protéines, mais dénature généralement les protéines20. Les chercheurs, dans le but d’extraire efficacement les protéines membranaires, ont identifié le Triton X-114 comme un détergent classique en raison de sa température optimale du point de trouble d’environ 22 °C, idéale pour les études sur les protéines membranaires. Introduit pour la première fois par Bordier en 1981, le Triton X-114 a depuis été largement utilisé pour l’extraction et la purification de protéines membranaires à travers diverses sources, y compris les tissus animaux et végétaux ainsi que les micro-organismes20,22. La faible CMC du Triton X-114 empêche son élimination par dialyse ; Cependant, sa nature douce minimise la dénaturation des protéines membranaires dans la phase enrichie au détergent. De plus, Triton X-114 forme des micelles plus petites (n = 7-8) par rapport au Triton X-10020. Le protocole d’étude de James G. Pryde a utilisé le Triton X-114 pour l’extraction de protéines membranaires à partir de cellules de mammifères en culture. En utilisant une température de point de trouble supérieure à 20 °C (incubation à 30 °C pendant 3 min), les protéines membranaires intégrales se sont réparties dans la phase enrichie en détergent, tandis que les protéines périphériques et cytosoliques ont été récupérées de la phase aqueuse appauvrie en détergent22. De plus, David A. Haake et al. ont utilisé le Triton X-114 pour extraire les protéines de la membrane externe (OMP) Leptospira interrogans, avec et sans CaCl2 en tant qu’additif23,24. Des études ultérieures ont confirmé que le Triton X-114 extrait efficacement les OMP des compartiments subcellulaires sans additifs comme le glycérol ou le CaCl225,26. Cependant, l’inclusion de sels peut augmenter la concentration de détergent, ce qui peut affecter les études de protéome à grande échelle utilisant la spectrométrie de masse à haut débit20. Dans notre travail d’analyse du protéome subcellulaire, nous avons utilisé Triton X-114 couplé à la spectrométrie de masse en tandem, ce qui a permis d’obtenir un enrichissement significatif dans tous les compartiments subcellulaires, y compris les protéines cytoplasmiques, de la membrane interne et de la membrane externe25,26. L’objectif principal du protocole actuel est d’enrichir efficacement les compartiments subcellulaires d’une cellule bactérienne à Gram négatif typique tout en minimisant les problèmes dans les processus en aval. De plus, le protocole est conçu pour être rentable et rapide. Ici, nous élaborons sur le protocole optimisé développé en laboratoire pour l’isolement des protéines subcellulaires et discutons de chaque goulot d’étranglement rencontré pendant le processus d’extraction.

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Protocole

REMARQUE : Ce protocole utilise Leptospira interrogans pour l’expérience d’extraction de protéines subcellulaires. Bien que ce protocole puisse être adapté pour être utilisé avec d’autres bactéries à Gram négatif, une optimisation peut être nécessaire en fonction des objectifs de recherche spécifiques. Le Tableau des matériaux et le Tableau 1 fournissent la liste des produits chimiques et de l’équipement, ainsi que la composition des tampons et des solutions réactives, respectivement, tandis que le Tableau 2 décrit les installations de laboratoire.

1. Souche de Leptospira et conditions de culture

  1. Procurez-vous le sérogroupe de L. interrogans Icterohaemorrhagiae sérovar Copenhageni souche Fiocruz L1-130.
    REMARQUE : Cette souche a été obtenue du Centre régional de recherche médicale du Conseil indien de la recherche médicale à Port Blair, en Inde, un centre collaborateur de l’OMS spécialisé dans le diagnostic, la référence, la recherche et la formation sur la leptospirose.
  2. Cultivez Leptospira (inoculum contenant ~1 × 106 cellules/mL) dans 50 mL de milieu Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) complété par 1 % d’albumine sérique bovine (BSA).
  3. Incuber à 30 °C jusqu’à ce que la culture atteigne la phase de croissance mi-log (3,5 × 108 cellules/mL). Tester les aliquotes du milieu de culture sur des plaques de gélose nutritive pour s’assurer que le milieu n’est pas contaminé.
    REMARQUE : Utilisez la microscopie à fond noir et une chambre de comptage Petroff-Hausser pour compter les cellules. Pour plus de détails, reportez-vous à un article27 précédemment publié.

2. Prélèvement cellulaire

  1. Après une période d’incubation de 7 jours, transférez trois répétitions biologiques de la culture de L. interrogans dans des tubes à centrifuger de volumes égaux (25 mL chacun).
    REMARQUE : La culture de Leptospira a été manipulée à l’intérieur d’une hotte à air laminaire dans un laboratoire BSL-2 pendant le transfert.
  2. Centrifuger tous les tubes à 2500 × g pendant 45 min à 4 °C. Transvasez soigneusement le surnageant dans un bécher contenant un désinfectant et jetez-le. Utilisez la pastille de cellule pour l’étape suivante.
  3. Laver les granulés cellulaires trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (1 mL à chaque fois) complétée par 5 mM de MgCl2, en centrifugeant à 10 000 × g pendant 10 min à 4 °C après chaque lavage.
    REMARQUE : Cette étape éliminera le BSA indésirable présent dans le milieu EMJH de la surface de la pastille de cellule.

3. Extraction de protéines subcellulaires

  1. Extraction du Triton X-114
    1. Traiter la pastille de cellules Leptospira , obtenue après la récolte, avec un tampon d’extraction contenant 10 mM de Tris-Cl (pH 8), 1 % de Triton X-114 et 150 mM de NaCl à raison de 1 mL par pastille récoltée (Tableau 1) (Facultatif - un cocktail d’inhibiteurs de protéase peut être ajouté selon le but expérimental).
      REMARQUE : La procédure consiste simplement à exposer des bactéries à une solution détergente en ajoutant le tampon d’extraction pour extraire les protéines membranaires.
    2. Mélangez délicatement le tampon d’extraction avec la pastille à l’aide d’une micropipette à une température inférieure à 25 °C jusqu’à ce que la solution devienne visuellement trouble.
    3. Incuber le mélange pendant la nuit à 4 °C.
    4. Mélangez à nouveau l’extrait obtenu à l’aide d’une micropipette et centrifugez-le à 15 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
    5. Décantez le surnageant dans un autre flacon et conservez la pastille cellulaire pour les processus d’extraction ultérieurs.
      REMARQUE : Ce surnageant contient un mélange de protéines hydrophiles et hydrophobes en abondance à partir du cytoplasme et de la membrane externe, et il est utilisé pour la séparation de phase.
    6. Ajoutez 50 μL de tampon contenant 10 mM de Tris-Cl (pH 8), 8 M d’urée, un cocktail inhibiteur de protéase et 1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS) à la pastille cellulaire.
    7. Agitez le mélange en continu pendant 5 minutes après avoir ajouté le tampon d’extraction, puis incubez à 4 °C pendant 5 minutes supplémentaires.
    8. Centrifuger à nouveau le mélange à 15 000 × g pendant 30 min à 4 °C et désigner le surnageant résultant comme la fraction granulée (P).
      REMARQUE : La fraction granulée contenait une grande abondance de protéines membranaires internes chez Leptospira25,26.
  2. Partition de phase
    1. Ajuster la concentration en Triton X-114 du surnageant obtenu lors de l’extraction à 2 %. Par exemple, si le volume surnageant est de 900 μL, ajoutez 9 μL de détergent Triton X-114 pour atteindre la concentration souhaitée.
    2. Incuber le mélange à 37 °C pendant 1 h, puis centrifuger à 2000 × g pendant 5 min à 30 °C. Cette centrifugation à basse vitesse permet d’accélérer la séparation des phases.
    3. Laissez le mélange se séparer en deux phases distinctes : aqueuse et détergente. Assurez-vous d’une centrifugation correcte à basse vitesse pour obtenir une séparation visible. Si nécessaire, laissez-le reposer pendant 1 minute avant de l’isoler. Si la séparation ne se produit pas, répétez l’étape 3.2.2 si nécessaire.
      REMARQUE : La séparation de phase peut être observée visuellement, par des mesures de turbidité à l’aide d’un spectrophotomètre, ou par diffusion statique de la lumière. Pour augmenter la précision du dosage du point de trouble, ajoutez à la solution un colorant hydrophobe (5-Hexadécanoyl-aminoéosine) d’une concentration de 500 nM et analysez-le par spectroscopie ultraviolet-visible (UV-VIS).
    4. Isolez la phase aqueuse supérieure en perçant l’interface avec une seringue stérile et en la transférant dans un flacon séparé. Isolez la phase détergente inférieure à l’aide d’une micropipette et stockez-la dans un flacon séparé.
      REMARQUE : Manipulez le flacon contenant les deux phases avec précaution pendant le processus de séparation. Avant de percer le flacon avec une seringue, ouvrez son couvercle pour éviter la casse de l’aiguille ou la difficulté à extraire la phase aqueuse supérieure. L’utilisation d’une seringue permet d’assurer une mesure plus précise du volume de chaque phase après la séparation et de minimiser la contamination croisée des protéines entre les phases.
    5. Étiquetez les phases comme aqueuses (A) et détergentes (D) et stockez-les à -20 °C pour une utilisation future.

4. Estimation des protéines

  1. Évaluer les concentrations en protéines de chaque fraction de Triton X-114 (aqueuse, détergente et pastille) à l’aide du test bicinchoninique28 ou de toute autre méthode appropriée.

5. Électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) électrophorèse sur gel

REMARQUE : Les protéines de chaque fraction (aqueuse, détergente, granulée) doivent être traitées avec du bêta-mercaptoéthanol pour les réduire, puis séparées à l’aide de 10 % de SDS-PAGE (trois réplicats biologiques). La recette de la SDS-PAGE à 10 % se trouve dans le tableau 1. Pour le ciblage d’échantillons de protéines, toute analyse de l’activité enzymatique doit être effectuée sous une forme native qui peut être résolue dans PAGE natif.

  1. Remettez l’échantillon de protéines en suspension dans de l’acétone glacée en utilisant quatre fois le volume de l’échantillon. Incuber le mélange à -20 °C pendant au moins 2 h, puis centrifuger à 14 000 × g pendant 10 min. De plus, remettre en suspension la fraction de pastilles dans de l’acétone glacée à 80 %, puis incuber pendant 5 min à 4 °C. Centrifuger à 14 000 × g pendant 10 min pour éliminer les cristaux de sel d’urée en excès.
  2. Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant et placez la pastille de protéine dans un bain sec jusqu’à ce que toute l’acétone résiduelle s’évapore des flacons.
  3. Incuber les échantillons de protéines dans un tampon d’échantillon de 20 μL contenant du bêta-mercaptoéthanol, puis les chauffer à 95 °C pendant 10 min dans un bain-marie ou un bain sec.
    REMARQUE : Ici, les échantillons de protéines représentent la fraction aqueuse (A) contenant des protéines cytoplasmiques, la fraction détergente (D) contenant des protéines de membrane externe et la fraction granulaire (P) contenant des protéines de membrane interne.
  4. Chargez les échantillons contenant A, D et P dans chaque puits du gel SDS-PAGE à 10 % avec un marqueur protéique précoloré (M) et une protéine totale (T).
    REMARQUE : La protéine totale peut être préparée en rassemblant les trois fractions dans un seul flacon à l’aide de 20 μL de tampon d’échantillon.
  5. Utilisez 1x tampon d’électrode dans l’appareil d’électrophorèse (Tableau 1). Réglez les paramètres de fonctionnement du gel à 6 mA pour le gel d’empilage et à 12 mA pour le gel de résolution. Exécutez l’électrophorèse à RT.
  6. Teignez le gel avec Coomassie Brilliant Blue G ou d’autres colorants protéiques disponibles en laboratoire.

6. Immunobuvardage

  1. Après la séparation du gel, incuber le gel non coloré dans un tampon de transfert (25 mM de base Tris, 190 mM de glycine, 20 % de méthanol) pendant 5 min.
  2. Incuber des papiers buvard de taille appropriée dans un tampon de transfert d’immunoblot pendant 5 min, puis assemblez-les comme couche inférieure du sandwich.
  3. Utilisez des membranes en fluorure de polyvinylidène (PVDF) ou des membranes en nitrocellulose pour transférer les protéines des gels non colorés. Commencez par immerger la membrane PVDF dans du méthanol absolu pendant 30 s, puis trempez-le pendant 5 minutes dans le tampon de transfert d’immunotransfert. Par la suite, intégrez-le dans le sandwich buvard.
  4. Maintenant, placez le gel non taché qui a été retiré du tampon de transfert et utilisez-le dans le sandwich de transfert buvard.
  5. Enfin, couvrez le sandwich en le plaçant sur un autre papier buvard dessus, libérez les bulles d’air emprisonnées à l’aide d’un rouleau éponge et exécutez le transfert à l’aide d’une méthode de transfert semi-sec.
    REMARQUE : D’autres approches, y compris le transfert sec et humide, peuvent être utilisées en fonction des installations du laboratoire.
  6. Immerger la membrane dans un tampon bloquant (8 % de lait écrémé dans TBS-0,1 % Tween 20 [TBS-T]) pendant 2 h, suivi d’une incubation d’une nuit à 4 °C avec des antisérums monospécifiques* ciblant la lipoprotéine Leptospira LipL41 (1:5000), ou le filament flagellaire 35 kDa core protein (FlaB) (1:4000) (*anticorps personnalisé). Rincez la membrane trois fois avec du TBS-T, en laissant chaque rinçage se poursuivre pendant 5 min.
    REMARQUE : Utilisez n’importe quel anticorps d’intérêt. Le facteur de dilution des anticorps peut varier.
  7. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire anti-lapin de souris conjugué à des IgG de peroxydase de raifort (HRP) (dilution 1:20000) pendant 2 h à RT.
  8. Exposez la membrane au réactif d’électrochimiluminescence (ECL) pour visualiser les bandes de protéines.
  9. Placez la membrane sous un film radiographique sensible au bleu dans une pièce sombre.
    REMARQUE : Toute autre méthode de développement peut également être utilisée.

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Résultats

Dans cette expérience, nous avons utilisé le spirochète Leptospira comme organisme modèle pour extraire des compartiments subcellulaires. Nous avons utilisé une méthodologie stratégique ancrée dans le point de trouble et la concentration mycélienne critique (CMC), en exploitant l’efficacité du Triton X-114, un détergent non ionique (Figure 1). Avant d’aller plus loin, une estimation de la protéine a été effectuée pour évaluer la concentration dans chaque fraction pour une seule répé...

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Discussion

Les techniques de fractionnement subcellulaire jouent un rôle central dans l’isolement des constituants cellulaires discrets pour une analyse ultérieure. Le Triton X-114, un détergent non ionique, est couramment utilisé dans ces techniques en raison de sa capacité à répartir les échantillons en phases distinctes, permettant la séparation de divers composants cellulaires32. Triton X-114 s’est avéré particulièrement utile dans l’extraction des protéines membranaires...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont déclaré qu’ils n’avaient pas d’intérêts financiers conflictuels.

Remerciements

Les auteurs expriment leur sincère gratitude au Conseil indien de la recherche médicale, New Delhi, Inde, pour le soutien financier fourni par le biais de la subvention n°. Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 et le Département des sciences et de la technologie, Conseil de recherche en sciences et en ingénierie, New Delhi, Inde, pour leur soutien financier par l’intermédiaire de la subvention n°. SR/SO/HS/0108/2012 à M.G.M. De plus, les auteurs expriment leur gratitude au Conseil indien de la recherche médicale, New Delhi, Inde, pour l’octroi d’une bourse de recherche senior par le biais de la subvention n°. ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS- BMS, Fellowship/131/2022-ECD-II-2021-8230 à H.P et AS respectivement et Département des sciences et de la technologie, Conseil de recherche en sciences et en ingénierie, New Delhi, Inde, Grant No. PDF/2017/000343 à S.A.D.C.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétique  ; Sigma  ; 695092
Acétone  ;   ; Sigma  ; 32201
Acrylamide  ;   ; Sigma  ; A-3553
Persulfate d’ammonium  ;   ; Sigma  ; A-3678
Balance  ; SHIMADUZ  ; Z741079
Bis Acrylamide  ;   ; Sigma  ; Référence M7279
Albumine sérique bovine fraction V (BSA)  ; Sigma  ; A-8022
Bleu bromophénol  ;   ; Sigma  ; Réf. B-8026
Tube à centrifuger (50 ml)Tarsons500020
Fiole conique avec capuchon (150 mL)Tarsons431030
Centrifugeuse de refroidissement  ; Eppendorf  ; 5355316200
Coomassie bleu brillant  ;   ; Sigma1.12553
Microscope à fond noir  ; ZEISS  ; Réf. J.C37081
Lingettes de travail délicatesKimtech Science34155
Bain sec  ; Eppendorf  ; 535531620
Ellinghausen&ndash ; McCullough&ndash ; Johnson&ndash ; Harris (EMJH) moyen, Difco  ; Difco  ; 279410
Plateaux de gel : Les plateaux de gel doivent avoir des dimensions d’au moins 2 cm de plus et avoir une surface lisse et plane avec un couvercle.  ; Hoefer  ; Sans objet
Câble en verre (150 mL)Tarsons421030
Glycine G8790  ;   ; Sigma  ; G-8898
Papier filtre à buvard immobiliséMilliporeIBFP0813C
Configuration semi-sèche Immunoblot  ; ATTA  ; AE-6675
Incubateur - Pour l’incubation des plateaux de gel pendant 18 heures à 37°C.  ; EYELA  ; SLI-700
Flux d’air laminaire  ; Sans objet  ; Sans objet
Luminol  ; Sigma  ; 09253
Chlorure de magnésium M8266  ; Sigma  ; Référence M8266
Agitateur magnétique  ; TARSONS  ; 6040
Méthanol  ;   ; Sigma  ; 17995-7
Pointes de micropipette (10 & micro ; L&ndash ; 10 ml)AxygenT-10, T-200-C, T-1000-C, T-10ML-C
Micropipettes  ; Eppendorf  ; EP2231300010
Microtubes (1,5 mL Safe-Lock)EppendorfEP022363212
Mini tour  ; Genaxy  ; GEN-MINI-6K
Lecteur multimodeBMG LABTECH  ; N/S : 413-3877
Lait écrémé en poudre, bovinSigma-AldrichRéférence M7409
Acide p-coumarique  ;   ; Sigma  ; Réf. C9008
Solution saline tamponnée au phosphate  ;   ; SigmaP4417  ;
Réfrigérateur  ; LG  ; GC-B217BLJ2
Rocker - Secoueur à bascule ou rotatif à basse vitesse pour tacher le gel.  ; TARSONS  ; 4080
SDS-PAGE SETUP- Appareil d’électrophorèse  ; Hoefer, Inc.  ; SE300-10A-1.0  ; Modèle Hoefer ' miniVE' qui peut couler un gel de 10 cm x 8 cm d’une épaisseur de 1 mm.
Chlorure de sodium  ;   ;   ; Sigma  ; 5886
Dodécylsulfate de sodium (FDS)  ;   ; Sigma  ; L-4396
TEMED  ;   ; Sigma  ; Réf. T-9281
Triton X-114  ;   ; Sigma648468
Trizma Base (TRIS) T6066  ;   ; Sigma  ; Réf. T6066
Tourbillon  ; TARSONS  ; 3020

Références

  1. Curreem, S. O. T., Watt, R. M., Lau, S. K. P., Woo, P. C. Y. Two-dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics. Protein Cell. 3 (5), 346-363 (2012).
  2. King, B. R., Latham, L., Guda, C. Estimation of subcellular proteomes in bacterial species. Open Appl Informatics J. 3 (1), 1-11 (2009).
  3. Brown, R. N., Romine, M. F., Schepmoes, A. A., Smith, R. D., Lipton, M. S. Mapping the subcellular proteome of Shewanella oneidensis MR-1 using Sarkosyl-based fractionation and LC−MS/MS protein identification. J Proteome Res. 9 (9), 4454-4463 (2010).
  4. Cash, P. Investigating pathogen biology at the level of the proteome. Proteomics. 11 (15), 3190-3202 (2011).
  5. Liu, Y., et al. Temporal regulation of a Salmonella Typhimurium virulence factor by the transcriptional regulator YdcR. Mol Cell Proteomics. 16 (9), 1683-1693 (2017).
  6. Rey, S., Gardy, J. L., Brinkman, F. S. Assessing the precision of high-throughput computational and laboratory approaches for the genome-wide identification of protein subcellular localization in bacteria. BMC Genomics. 6 (1), 162(2005).
  7. Lietzén, N., et al. Quantitative subcellular proteome and secretome profiling of influenza A virus-infected human primary macrophages. PLoS Pathog. 7 (5), e1001340(2011).
  8. Arioka, Y., Watanabe, A., Saito, K., Yamada, Y. Activation-induced cytidine deaminase alters the subcellular localization of Tet family proteins. PLoS One. 7 (9), e45031(2012).
  9. Del Duca, S., Faleri, C., Iorio, R. A., Cresti, M., Serafini-Fracassini, D., Cai, G. Distribution of transglutaminase in pear pollen tubes in relation to cytoskeleton and membrane dynamics. Plant Physiol. 161 (4), 1706-1721 (2013).
  10. Gennaris, A., et al. Repairing oxidized proteins in the bacterial envelope using respiratory chain electrons. Nature. 528 (7582), 409-412 (2015).
  11. Schilling, K., et al. Translocation of endothelial nitric-oxide synthase involves a ternary complex with caveolin-1 and NOSTRIN. Mol Biol Cell. 17 (9), 3870-3880 (2006).
  12. Mintz-Oron, S., Aharoni, A., Ruppin, E., Shlomi, T. Network-based prediction of metabolic enzymes' subcellular localization. Bioinformatics. 25 (12), i247-i252 (2009).
  13. Phukan, H., Sarma, A., Rex, D. A. B., Rai, A. B., Prasad, T. S. K., Madanan, M. G. Unique posttranslational modification sites of acetylation, citrullination, glutarylation, and phosphorylation are found to be specific to the proteins partitioned in the Triton X-114 fractions of Leptospira. ACS Omega. 7 (22), 18569-18576 (2022).
  14. Tinrat, S. Preliminary phytochemical analysis, antibacterial and anti-biofilm activities of Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe extracts. Malaysian J Microbiol. 18 (4), 344-353 (2022).
  15. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), a000414-a000414 (2010).
  16. Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Curr Protoc Protein Sci. 53 (1), ps0408s53(2008).
  17. Santos, H. deL., Ciancaglini, P. A practical approach to the choice of a suitable detergent and optimal conditions for solubilizing a membrane protein. Biochem Educ. 28 (3), 178-182 (2000).
  18. Picard, M., Duval-Terrié, C., Dé, E., Champeil, P. Stabilization of membranes upon interaction of amphipathic polymers with membrane proteins. Protein Sci. 13 (11), 3056-3058 (2004).
  19. Rice, A. J., Alvarez, F. J., Davidson, A. L., Pinkett, H. W. Effects of lipid environment on the conformational changes of an ABC importer. Channels. 8 (4), 327-333 (2014).
  20. Arnold, T., Linke, D. Phase separation in the isolation and purification of membrane proteins. BioTechniques. 43 (4), 427-440 (2007).
  21. Fricke, B. Phase separation of nonionic detergents by salt addition and its application to membrane proteins. Anal Biochem. 212 (1), 154-159 (1993).
  22. Pryde, J. G. Partitioning of proteins in Triton X-114. In: Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa. (2000).
  23. Haake, D. A., Walker, E. M., Blanco, D. R., Bolin, C. A., Miller, J. N., Lovett, M. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59 (3), 1131-1140 (1991).
  24. Haake, D. A., et al. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun. 68 (4), 2276-2285 (2000).
  25. Thoduvayil, S., et al. Triton X-114 fractionated subcellular proteome of Leptospira interrogans shows selective enrichment of pathogenic and outer membrane proteins in the detergent fraction. Proteomics. 20 (19-20), (2020).
  26. Phukan, H., et al. Physiological temperature and osmotic changes drive dynamic proteome alterations in the leptospiral outer membrane and enhance protein export systems. J Proteome Res. 22 (11), 3447-3463 (2023).
  27. Murray, G. L., King, A. M., Srikram, A., Sermswan, R. W., Adler, B. Use of luminescent Leptospira interrogans for enumeration in biological assays. J Clin Microbiol. 48 (6), 2037-2042 (2010).
  28. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  29. Shang, E. S., Summers, T. A., Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 64 (6), 2322-2330 (1996).
  30. Evangelista, K. V., Hahn, B., Wunder, E. A. Jr, Ko, A. I., Haake, D. A., Coburn, J. Identification of cell-binding adhesins of Leptospira interrogans. PLoS Negl Trop Dis. 8 (10), e0003215(2014).
  31. Picardeau, M. Virulence of the zoonotic agent of leptospirosis: still terra incognita. Nat Rev Microbiol. 15 (5), 297-307 (2017).
  32. Hu, S., et al. Purification and identification of membrane proteins from urinary extracellular vesicles using Triton X-114 phase partitioning. J Proteome Res. 17 (1), 86-96 (2018).
  33. Radolf, J. D., Chamberlain, N. R., Clausell, A., Norgard, M. V. Identification and localization of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum subsp. pallidum by phase partitioning with the nonionic detergent Triton X-114. Infect Immun. 56 (2), 490-498 (1988).
  34. Nally, J. E., Whitelegge, J. P., Bassilian, S., Blanco, D. R., Lovett, M. A. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection. Infect Immun. 75 (2), 766-773 (2007).
  35. Crother, T. R., Nally, J. E. Analysis of bacterial membrane proteins produced during mammalian infection using hydrophobic antigen tissue Triton extraction (HATTREX). Curr Protoc Microbiol. 9 (1), mc1201s9(2008).
  36. Casey, T. M., Meade, J. L., Hewitt, E. W. Organelle proteomics. Mol Cell Proteomics. 6 (5), 767-780 (2007).
  37. Bell, A. W., et al. Proteomics characterization of abundant Golgi membrane proteins. J Biol Chem. 276 (7), 5152-5165 (2001).
  38. Boonciew, P., et al. Improved antibody detection for canine leptospirosis: ELISAs modified using local leptospiral serovar isolates from asymptomatic dogs. Animals. 14 (6), (2024).
  39. Nogueira, S. V., et al. Leptospira interrogans enolase is secreted extracellularly and interacts with plasminogen. PLoS One. 8 (10), e0078150(2013).
  40. Riazi, M., Zainul, F. Z., Bahaman, A. R., Amran, F., Khalilpour, A. Role of 72 kDa protein of Leptospira interrogans. as a diagnostic marker in acute leptospirosis. Indian J Med Res. 139 (2), 308-313 (2014).
  41. Domingos, R. F., et al. Features of two proteins of Leptospira interrogans with potential role in host-pathogen interactions. BMC Microbiol. 12, 50(2012).
  42. Dhandapani, G., et al. Proteomic approach and expression analysis revealed the differential expression of predicted leptospiral proteases capable of ECM degradation. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1866 (5-6), 712-721 (2018).
  43. Matsunaga, J., Werneid, K., Zuerner, R. L., Frank, A., Haake, D. A. LipL46 is a novel surface-exposed lipoprotein expressed during leptospiral dissemination in the mammalian host. Microbiology. 152 (12), 3777-3786 (2006).
  44. Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4 (6), e6071(2009).
  45. Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).

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Fractionnement subcellulaireextraction au Triton X 114prot ines de Leptospiraprot ines de la membrane externeprot ines de la membrane internes paration de phaselocalisation prot iqueSDS PAGEimmunotransfertspectrom trie de masse
Enrichissement des protéines subcellulaires chez Leptospira à l’aide d’une approche de fractionnement basée sur le Triton X-114
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