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Article de méthode

Etablissement d’un modèle d’inflammation cornéenne sévère chez le rat basé sur le curetage de l’épithélium cornéen combiné à des sutures cornéennes

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DOI :

10.3791/67305

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22 novembre 2024

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1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, 3The Second People's Hospital of Guiyang City, 4Department of Biomedical Sciences, School of Infection, Inflammation and Immunology, College of Medicine and Health, University of Birmingham

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous avons développé un modèle chez le rat d’inflammation cornéenne sévère par curetage de l’épithélium cornéen combiné à des sutures cornéennes. L’étude a évalué les modèles d’inflammation cornéenne, la prolifération épithéliale et les changements dans les cellules souches limbiques dans des conditions inflammatoires.

Résumé

L’inflammation cornéenne, en particulier l’inflammation cornéenne sévère, joue un rôle important dans le développement du dysfonctionnement des cellules souches limbiques cornéennes. La construction de modèles animaux appropriés peut nous aider à nous concentrer sur les effets d’une inflammation sévère sur les cellules souches cornéennes et limbiques. Un décapant de 2 mm a été utilisé pour enlever l’épithélium cornéen central des rats Sprague Dawley (SD) afin de créer une blessure. Ensuite, le stroma central de la cornée a été suturé avec des sutures en nylon pour induire une inflammation persistante. De cette façon, un modèle d’inflammation cornéenne avec abrasion de l’épithélium cornéen central et suture du stroma central a été construit, ce qui a induit une inflammation cornéenne sévère. Les changements dans l’inflammation cornéenne et l’état des cellules souches limbiques à 1, 3 et 7 jours après la modélisation ont été observés. Le 3èmejour après la modélisation, le limbe cornéen du rat était sévèrement œdémateux, avec une néovascularisation évidente et une hyperplasie locale, qui sont des signes typiques d’une déficience en cellules souches limbiques. Au 7e jour, l’œdème cornéen s’est progressivement aggravé et la néovascularisation a continué à augmenter. Grâce à la réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse (RT-qPCR) et à la coloration par immunofluorescence, nous avons constaté que les facteurs inflammatoires de l’épithélium cornéen étaient significativement régulés à la hausse, que la différenciation de l’épithélium cornéen était anormale, que les cellules souches de l’épithélium cornéen étaient significativement réduites et que la prolifération cellulaire et la souche avaient également diminué. Par conséquent, ce modèle démontre qu’une inflammation sévère peut induire des dommages aux cellules souches limbiques sans endommager directement les cellules souches limbiques. Le modèle est bénéfique pour observer les effets de l’inflammation sévère sur les mécanismes biologiques des cellules souches et fournit une plate-forme idéale pour étudier les mécanismes du dysfonctionnement des cellules souches épithéliales cornéennes induit par l’inflammation.

Introduction

Le dysfonctionnement des cellules souches limbiques (LSCD) est caractérisé par des défauts épithéliaux persistants, une vascularisation cornéenne, une inflammation chronique, une cicatrisation et une conjonctivalisation de la cornée 1,2. Il peut résulter de l’épuisement ou du dysfonctionnement des cellules souches limbiques après de graves maladies de la surface oculaire, telles que des brûlures chimiques, des brûlures thermiques, le syndrome de Stevens-Johnson et des lésions iatrogènes causées par des chirurgies oculaires 2,3,4. Les mécanismes pathogènes du LSCD impliquent principalement des altérations des cellules souches et des perturbations du microenvironnement des cellules souches 5,6, ce qui affecte l’homéostasie de l’épithélium cornéen 2,7. Il existe deux principaux types de changements de destin dans les cellules souches limbiques dans le LSCD : 1) Le potentiel de différenciation directionnelle des cellules souches épithéliales cornéennes devient anormal, conduisant à leur différenciation en cellules épithéliales cutanées. Ceci est mis en évidence par une diminution de l’expression du facteur de transcription spécifique des cellules épithéliales cornéennes Pax6 et des kératines spécifiques de la cornée Krt12 et Krt3, ainsi qu’une augmentation significative de l’expression des marqueurs de métaplasie épithéliale épithéliale épithéliale squameuse Krt10, Krt1 et Sprr1b8 ; 2) Les lésions de la surface oculaire détruisent directement les cellules souches limbiques cornéennes, entraînant une nécrose ou une apoptose, et provoquant par la suite une prolifération du tissu conjonctival qui recouvre la cornée9. Il a été rapporté que pendant le développement du LSCD, les cellules inflammatoires telles que les macrophages, les neutrophiles et les cellules dendritiques augmentent considérablement dans le microenvironnement des cellules souches épithéliales cornéennes. En conséquence, les cytokines telles que l’interféron-gamma (IFN)-γ, le facteur de nécrose tumorale (TNF)-α, l’interleukine (IL)-1β et les protéines inflammatoires des macrophages (MIP)-1α/β présentent également des élévations significatives10.

Divers modèles de LSCD ont été établis, y compris ceux induits par des sutures, des lésions chimiques et un spotting au chlorure de benzalkonium11. Chacun de ces modèles a ses avantages et ses inconvénients. Les blessures chimiques peuvent endommager toute la surface oculaire et détruire directement les cellules souches limbiques12. Le chlorure de benzalkonium fonctionne de la même manière que les lésions chimiques, mais a un effet relativement lent13. Le modèle de suture cornéenne peut induire une réponse inflammatoire stable et à long terme, mais la réaction inflammatoire est relativement bénigne et ne peut pas provoquer de LSCD.

Pour étudier le rôle et les mécanismes de l’inflammation dans le développement de la LSCD cornéenne, un modèle animal a été établi qui combine le curetage de l’épithélium cornéen central avec des sutures cornéennes. Ce modèle induit une inflammation persistante de l’épithélium cornéen sans endommager directement les cellules souches limbiques.

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Protocole

Toutes les procédures étaient conformes aux directives de l’ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale du Guizhou (approbation n° 2305192). Les rats ont été hébergés au Centre animalier de l’Université de médecine du Guizhou, dans le respect des réglementations pertinentes en matière de gestion des animaux.

1. Sélection des animaux

  1. Utiliser des rats Sprague-Dawley (SD) femelles âgés de 7 à 8 semaines. Assurez-vous qu’il n’y a pas de lésions de la surface oculaire lors de l’examen à la lampe à fente.
  2. Stérilisez les instruments à l’aide d’un stérilisateur rapide. Les instruments requis comprennent un dissolvant d’anneau de rouille cornéenne, un marqueur d’échantillonnage cutané de 2 mm, des porte-aiguilles, des couteaux à plaques, des ciseaux chirurgicaux ophtalmiques et des pinces.
  3. Anesthésier les rats avec 1,25 % de tribromoéthanol par injection intrapéritonéale à une dose de 0,3 mL par 100 g de poids corporel. Évaluez la profondeur de l’anesthésie par pincement des orteils. Instillez une goutte de gouttes ophtalmiques tropicamide pour la dilatation de la pupille. Appliquez des gouttes ophtalmiques de chlorhydrate de bupivacaïne sur l’œil. Utilisez une pommade lubrifiante oculaire sur l’œil controlatéral pour maintenir l’hydratation.
  4. Désinfectez la peau et les cheveux autour des yeux avec de l’iodophore.
  5. Établissez le modèle d’inflammation.
    1. Placez le rat en position de décubitus latéral. Exposez le globe oculaire sous un microscope opératoire.
    2. La cornée centrale a été marquée à l’aide d’un marqueur d’échantillonnage cutané de 2 mm, et l’épithélium cornéen central marqué a été gratté à l’aide d’un dissolvant d’anneau de rouille cornéen.
    3. Placez trois sutures cornéennes à 120° à l’aide de fil de nylon 10-0, d’un porte-aiguille et de ciseaux chirurgicaux ophtalmiques et d’une pince à environ 3 mm du limbe, ne pénétrez pas dans la cornée14,15.
  6. Appliquez la pommade oculaire Ofloxacine à la fin de la procédure pour prévenir l’infection.
  7. Observez et photographiez la cornée le1er, le 3e et le 7ejour après l’opération à l’aide d’une lampe à fente agrandie 10x. Enregistrez les symptômes tels que la cicatrisation de l’épithélium cornéen, l’hyperémie conjonctivale, l’œdème cornéen, l’hyperémie limbique et la néovascularisation cornéenne.

2. Calcul de l’indice inflammatoire

  1. Calculez l’indice inflammatoire de la surface oculaire après avoir établi le modèle animal.
    1. Évaluez la congestion corporelle ciliaire comme suit : pas de congestion (0 point) ; la présence d’une congestion inférieure à 1 mm (1 point) ; hyperémie entre 1 mm et 2 mm (2 points) ; hyperémie entre 1 mm et 2 mm (3 points).
    2. Évaluez l’œdème cornéen central comme suit : pas d’œdème (0 point) ; œdème avec visibilité nette de l’iris (1 point) ; œdème avec visibilité de l’iris peu claire (2 points) ; œdème avec l’iris non visible (3 points).
    3. Évaluez l’œdème cornéen paracentral comme suit : pas d’œdème (0 point) ; œdème avec visibilité nette de l’iris (1 point) ; œdème avec visibilité de l’iris peu claire (2 points) ; œdème avec l’iris non visible (3 points).
    4. Calculez l’indice d’inflammation en additionnant tous les scores et en le divisant par 9.

3. Évaluation de la néovascularisation cornéenne

  1. Observez la néovascularisation cornéenne à l’aide d’une lampe à fente.
    1. Analyser et traiter des images à l’aide d’un logiciel de traitement d’images à lampe à fente16.
    2. Enregistrer la croissance de la néovascularisation cornéenne à chaque point d’observation, en mesurant la plus longue néovascularisation cornéenne vers la cornée centrale avec une courbure minimale.
    3. Classez-les comme suit : Grade 0 : Avasculaire ; Grade 1 : Micro (<1 mm) ; Grade 2 : Léger (1 mm à 1,5 mm) ; Grade 3 : Modéré (>1,5 mm à 2 mm) ; Grade 4 : Sévère (>2 mm).

4. Analyse de la biologie du modèle

  1. Préparez des échantillons d’yeux congelés.
    1. Anesthésier le rat avec 4 à 5 % d’isoflurane et l’euthanasier par luxation cervicale.
    2. En position de décubitus latéral, soulevez le globe oculaire du rat vers l’extérieur avec une micro-pince à épiler et ouvrez la conjonctive le long du dôme supérieur et inférieur de l’œil avec des ciseaux à œil.
    3. Coupez le nerf optique, en faisant attention au maintien de l’intégrité de l’épithélium cornéen.
    4. Séchez les taches de sang et d’eau sur la surface du globe oculaire avec du papier filtre et placez-les dans la boîte d’enrobage avec un support d’enrobage à température de coupe optimale (OCT).
    5. Retirez les bulles dans la boîte d’enrobage à l’aide d’une pipette de 200 μL, congelez-la avec de l’azote liquide, puis conservez les échantillons encastrés dans le réfrigérateur à ultra-basse température.
  2. Préparez des sections congelées des globes oculaires.
    1. Avant de préparer la section congelée, prérefroidissez le cryostat à environ -28 °C et le porte-échantillon à -26 °C.
    2. Sortez les échantillons congelés du congélateur froid et placez-les dans le cryotome pendant environ 1 h.
    3. Prérefroidir l’échantillon congelé dans un cryotome pendant 10 min. Marquez l’échantillon avec un crayon, fixez-le sur le tampon d’échantillon avec de l’OCT et fixez-les ensemble sur la grille de sectionnement après refroidissement.
    4. Ajustez la position et la direction de l’échantillon congelé et fixez-le. Tout d’abord, coupez des sections de 20 μm jusqu’à ce que la cornée centrale soit visible. Ensuite, obtenez des sections de 6 μm par tranchage continu et collectez les sections sur les lames d’adhérence pré-préparées.
    5. Marquez le nom, le matériau, l’heure de la section, le nom et le numéro du tissu sur la lame. Placez-le à température ambiante (RT) pendant environ 30 min.
    6. Après avoir séché les sections, mettez-les dans une boîte et conservez-les dans le réfrigérateur à ultra-basse température pour la réserve.
  3. Effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine.
    1. Retirez les sections congelées pré-préparées du réfrigérateur à ultra-basse température et placez-les dans la hotte à RT pour qu’elles sèchent.
    2. Fixer les sections à l’aide de paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min à RT. Rincer les échantillons avec 1x PBS pendant 5 min.
    3. Placez les sections d’échantillon contenant les lames sur un porte-lames et immergez-les dans le cylindre de colorant avec une solution de colorant à l’hématoxyline à RT pendant 5 min.
    4. Rincez lentement l’échantillon contenant les lames avec de l’eau du robinet pour éliminer le colorant flottant, mettez-les dans le réservoir de colorant avec de l’alcool d’acide chlorhydrique à 0,1 % et retirez-les rapidement après 1 à 2 s.
    5. Rincez lentement l’échantillon à l’eau du robinet pendant 15 min.
    6. Retirez l’échantillon de l’eau et plongez les lames dans le réservoir de colorant éosine ; laisser à RT pendant 3 min.
    7. Rincez lentement l’échantillon à l’eau du robinet, lavez l’excès de colorant et effectuez une déshydratation à gradient d’alcool en utilisant de l’alcool à 75 %, à 80 %, à 95 %, à 100 % d’alcool (un) et à 100 % d’alcool (deux). Mesurez les sections dans chaque concentration pendant 2 min.
    8. Rendez les échantillons transparents pendant 2 min dans le xylène (1) et le xylène (2) respectivement.
    9. Séchez l’échantillon dans la hotte, scellez les sections à l’aide d’un agent d’étanchéité et veillez à ne pas produire de bulles.
    10. Placez les lames dans une boîte à lames à RT. Imagez les coupes à l’aide d’un microscope.
  4. Effectuer une coloration par immunofluorescence.
    1. Retirez les sections gelées et placez-les dans une boîte à RT dans la hotte pour qu’elles sèchent.
    2. Marquez le nom de l’anticorps à colorer sur l’ébauche de la lame de verre de l’échantillon congelé.
    3. Fixer les échantillons avec 4 % de paraformaldéhyde à RT pendant 15 min. Une petite quantité d’eau du robinet a été ajoutée à la boîte pour éviter que l’échantillon ne se dessèche.
    4. Retirez le fixateur de paraformaldéhyde et lavez l’échantillon trois fois avec 1 tampon PBS. Veillez à ne pas rincer l’échantillon.
    5. Séchez le liquide autour de la section du tissu, recouvrez l’échantillon d’une solution de membrane cellulaire (0,2 % de TritonX-100) et incubez à RT pendant 20 min.
    6. Retirez la solution de membrane cellulaire et lavez les sections trois fois pendant 5 minutes chacune avec 1x tampon PBS.
    7. Séchez les coupes de tissus, recouvrez l’échantillon d’une solution bloquant l’immunofluorescence (2 % de BSA) et incubez à RT pendant 1 h.
    8. Préparez l’anticorps primaire et le diluant (1 % BSA) pendant l’incubation selon les instructions du fabricant.
    9. Retirez le liquide de blocage et séchez l’échantillon à l’aide d’une pompe d’aspiration. Ajoutez l’anticorps primaire préparé, couvrez la boîte et incubez-le dans un réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit (incuber pendant environ 12 à 16 h) à l’abri de la lumière.
    10. Jetez l’anticorps primaire et lavez l’échantillon quatre fois pendant 10 minutes chacune dans du PBS.
    11. Pendant l’étape de nettoyage, préparez la dilution secondaire de l’anticorps selon les instructions du fabricant.
    12. Retirez le PBS, séchez l’échantillon et ajoutez l’anticorps secondaire préparé à l’échantillon. Couvrir l’échantillon et incuber à RT pendant 1 h à l’abri de la lumière.
    13. Retirez l’anticorps secondaire, lavez l’échantillon 4 fois avec 1 tampon PBS pendant 10 minutes chacune et couvrez l’ensemble de la lame avec 1 tampon PBS.
    14. Retirez le PBS, séchez l’échantillon et scellez les sections avec un support de montage contenant du DAPI, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air. Enveloppez les lames dans du papier d’aluminium et conservez-les à 4 °C à l’abri de la lumière.
    15. Prenez des photos avec un système de microscope confocal laser ou avec un système de caméra de microscope à fluorescence droite (vitesse de balayage : 4 μs/pixel, résolution de balayage : 1024 x 1024).
  5. Préparation en suspension unicellulaire de l’épithélium cornéen du rat
    1. Après l’euthanasie, retirez les globes oculaires à l’aide d’une pince à épiler imbibée d’alcool à 75 % et mettez-les dans la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 10 % de pénicilline-streptomycine préparée à l’avance.
    2. Nettoyez les globes oculaires et utilisez 1x HBBS contenant 10 % de FBS et 10 % de pénicilline-streptomycine deux fois pendant 5 min chacune.
    3. Retirer la conjonctive le long du bord scléral ; Laissez le bord scléral à environ 1 mm. Encore une fois, lavez le tissu cornéen deux fois avec 1x HBBS contenant 10 % de FBS et 10 % de pénicilline-streptomycine.
    4. Transférez le tissu cornéen propre dans un milieu épidermique hormonal supplémenté (SHEM) contenant 2U/mL de Dispase II. Fermez le joint et placez-le à 4°C pendant 14-16 h.
    5. Ayez une pince à épiler, une pince à épiler édentée, un dispositif de récupération de l’iris et un stérilisateur chirurgical à portée de main.
    6. Au microscope chirurgical, séparez doucement l’épithélium cornéen le long du bord de la cornée.
    7. Laver l’épithélium cornéen avec 1x HBSS contenant 10 % de pénicilline-streptomycine pendant 5 min.
    8. Transvasez le tissu épithélial cornéen dans un tube à centrifuger de 1,5 mL contenant 200 mL de trypsine et incubez dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C. Toutes les 5 minutes, secouez trois fois le tube à centrifuger pour digérer la feuille épithéliale cornéenne en une suspension unicellulaire.
    9. Ajoutez une quantité égale de milieu SHEM pour arrêter l’action de la solution de digestion de la trypsine et placez-la à RT.
  6. Culture de clones de cellules épithéliales cornéennes
    1. Préparez les cellules trophoblastiques.
      1. Lorsque la densité de croissance des cellules de souris NIH 3T3 atteint 80-90 %, jetez le milieu de culture cellulaire. Ajouter un milieu de culture de mitomycine NIH 3T3 de 10 mg/mL préparé et incuber à 37 °C pendant 2,5 h.
      2. Retirer le milieu, rincer les cellules avec 1x HBSS, les remplacer par un nouveau milieu cellulaire NIH 3T3 et poursuivre l’incubation dans un incubateur de CO2 (5 % de CO2, 37 °C).
    2. Préparez la suspension de cellules épithéliales cornéennes et comptez les cellules selon le rapport requis.
    3. Lors de la préparation de la suspension de cellules épithéliales cornéennes, traitez les cellules NIH 3T3 traitées à la mitomycine.
      1. Jeter le surnageant, rincer les cellules avec 1x HBSS, ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA et incuber à RT pendant 2-3 min.
      2. Ajoutez une quantité égale de milieu épithélial hormonal supplémentaire (milieu SHEM : DMEM/F12, facteur de croissance épidermique de souris [EGF] de 10 ng/mL, 10 μg/mL d’insuline-transferrine-sélénium [ITS], 5 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine, 0,5 % de diméthylsulfoxyde [DMSO], 0,5 mg/mL d’hydrocortisone), pipetez doucement pour former une suspension cellulaire et comptez les cellules.
    4. À l’aide d’une plaque à 12 puits, ajoutez 0,5 mL de milieu SHEM dans chaque puits.
    5. Mélangez des cellules épithéliales cornéennes avec des cellules NIH 3T3 à une densité de 500 cellules épithéliales cornéennes/cm2 et 5 x 105 cellules NIH 3T3/cm2. Ajouter 1 mL de milieu SHEM dans chaque puits.
    6. Ajouter 1 mL du mélange de cellules dans chaque puits et pipeter doucement pour répartir uniformément les cellules.
    7. Incuber dans un incubateur (5 % de CO2, 37 °C), en changeant de milieu tous les 2-3 jours. Culture pendant 12-14 jours.
  7. Coloration violette cristal
    1. Après environ 12 jours, lorsque les clones épithéliales cornéens sont sur le point de fusionner, retirez le milieu de culture et ajoutez 1 mL de solution de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits, en recouvrant complètement les cellules. Fixez les cellules pendant 15 min à RT.
    2. Retirez 4 % de paraformaldéhyde et lavez les puits trois fois avec 1x PBS pendant 5 min chacun.
    3. Retirez 1x tampon PBS et ajoutez une solution de colorant violet cristallin à 0,4 % dans chaque puits. Colorer pendant 30 min à RT.
    4. Retirez ou recyclez la solution de colorant violet cristallin et lavez-la trois fois avec 1x PBS pendant 10 minutes chacune.
    5. Faites sécher les puits à l’air libre à RT jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs.
    6. Utilisez un système de photographie au microscope droit ordinaire (vitesse de balayage : 4 μs/pixel, résolution de balayage : 1024 x 1024).
  8. Extraction de l’ARNm cornéen
    1. Rassemblez des ciseaux ophtalmiques, des ciseaux cornéens, des pinces dentées, un grattoir épithélial cornéen électrique, du Trizol, des tubes à centrifuger sans RNase de 1,5 ml et une glacière.
    2. Acquisition épithéliale
      1. Anesthésier le rat avec 4 à 5 % d’isoflurane et l’euthanasier après une luxation cervicale. Placez l’animal en position latérale. Coupez les moustaches de la souris avec des ciseaux à œil pour éviter de bloquer la vue.
      2. Placez le rat sous un microscope chirurgical et ajustez-le à une hauteur appropriée pour faire la mise au point sur le globe oculaire. À l’aide d’une pince dentée, vous pousserez doucement et exposerez le globe oculaire. Soulevez la conjonctive du rat et utilisez un grattoir épithélial cornéen électrique propre pour gratter la zone centrale de 2 mm de l’épithélium cornéen.
      3. Prélevez l’épithélium cornéen gratté à l’aide d’une pince dentée propre et pulvérisée d’alcool. Placez le tissu prélevé dans un tube à centrifuger contenant 1 mL de Trizol.
      4. Rincez le plus rapidement possible le tissu recueilli dans un tube à centrifuger de 50 mL contenant de l’eau doublement désionisée. Absorbez l’excès d’eau avec du papier filtre. Vaporisez avec de l’alcool à 75 % et passez à l’étape suivante.
      5. Soulevez à nouveau la conjonctive du rat à l’aide d’une pince dentée. À l’aide de ciseaux cornéens avec le côté concave vers le haut, coupez la conjonctive le long du limbe, en laissant environ 0,5 mm de conjonctive blanche.
      6. Grattez l’épithélium cornéen dans un rayon de 2 mm au niveau du limbe cornéen à l’aide du grattoir électrique. Prélevez le tissu comme décrit précédemment. Prélevez l’épithélium cornéen central à partir de trois globes oculaires et l’épithélium limbique à partir de trois globes oculaires.
      7. Placez les tissus collectés dans des tubes de réactifs d’extraction d’ARN Trizol séparés de 1 ml. Effectuez toute l’opération sur de la glace pour préserver l’intégrité de l’ARN. Passez immédiatement aux étapes suivantes ou conservez les échantillons dans un congélateur à ultra-basse température à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
    3. Décongelez l’échantillon sur de la glace, utilisez un homogénéisateur de tissus à ultrasons pour lyser les cellules. Réglez la puissance de l’homogénéisateur à ultrasons sur 25 %, le temps sur 2 s par rafale, le temps d’intervalle sur 5 s et le temps total sur 2 min. Laisser reposer sur la glace pendant 10 min.
    4. Ajouter du chloroforme (1/5 du volume total, soit environ 200 μL) à chaque échantillon, bien mélanger en inversant pendant 30 s et centrifuger à 400 x g pendant 10 min à 4 °C.
    5. Précipitation de l’ARN
      1. Après la centrifugation, le liquide à l’intérieur du tube de centrifugation est stratifié en trois parties. La couche supérieure claire est constituée d’ARN, la couche trouble blanche du milieu est constituée d’ADN et de protéines, et la couche inférieure est constituée de trizol. Pipetez soigneusement environ 500 μL de la couche supérieure transparente dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL, en prenant soin de ne pas aspirer le précipité blanc dans la couche intermédiaire. En cas d’aspiration par inadvertance, répétez la centrifugation pour recueillir à nouveau la couche transparente.
      2. Ajoutez une quantité égale d’isopropanol pré-refroidi dans le tube de centrifugation contenant la couche transparente, environ 500 μL, retournez le tube plusieurs fois pour bien mélanger, puis placez-le immédiatement dans un congélateur à ultra-basse température de -80 °C pendant 20 à 30 min. Cette étape vise à accélérer la précipitation de l’ARN.
    6. Retirer l’échantillon et le centrifuger immédiatement à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Une petite quantité de précipité blanc et floconneux est visible au fond du tube de centrifugation ; Jetez le surnageant.
    7. Ajoutez de l’éthanol à 70 % pré-préparé et refroidi à la glace dans chaque tube. Centrifuger immédiatement à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée à 400 x g pendant environ 10 min ; Répétez les étapes ci-dessus une fois pour bien laver le précipité. À cette étape, pré-stérilisez la hotte avec une lumière UV pendant 15 min.
    8. Après avoir retiré les tubes de centrifugation et jeté le surnageant, centrifuger à nouveau à 4 °C à environ 250 x g pendant 2 min. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, aspirez soigneusement l’excès d’alcool du côté opposé au précipité, en le séchant aussi complètement que possible. Placer dans une hotte pré-stérilisée aux UV pour sécher, sécher le précipité à l’air libre pendant environ 15 min.
    9. Préparez la solution en ajoutant 1 mL d’inhibiteur de RNase à 40 mL d’eau de pyrocarbonate de diéthyle (DEPC). Ajouter une quantité appropriée de mélange d’eau et d’inhibiteur de la RNase, environ 20 à 30 μL, pour dissoudre l’échantillon. S’il y a beaucoup de précipité, ajoutez 30 à 50 μL. Procédez immédiatement à la PCR par transcription inverse.
  9. PCR par transcription inverse
    1. Assurez-vous que les éléments suivants sont présents : machine PCR, tubes à centrifuger sans RNase de 1,5 ml, tubes de PCR de 0,2 ml, bain de glace ou glacière, pipette et embouts sans RNase.
    2. Mesurez la concentration d’ARN à l’aide du spectrophotomètre de microvolume. Pour chaque échantillon, assurez-vous que 1 μg d’ARN est ajouté au système réactionnel.
    3. Le système de transcription inverse a un volume total de 20 μL. Calculez la quantité totale de réactifs nécessaires en fonction du nombre d’échantillons. Mélangez selon le rapport spécifié dans les instructions.
    4. Préparez le système de réaction sur de la glace, vortexez-le et centrifugez-le brièvement. Incuber à 42 °C pendant 15 min et à 90 °C pendant 30 s.
    5. Utilisez l’ADNc obtenu à partir du processus de transcription inverse soit directement pour une analyse PCR quantitative en temps réel, soit stockez-le dans un réfrigérateur à -80 °C.
  10. Réaction PCR quantitative en temps réel
    1. Utilisez un kit de réactifs PCR quantitatifs en temps réel17 avec un système de réaction de 10 μL. Utilisez les séquences d’amorces indiquées dans le tableau 1.
    2. Ajoutez le système de réaction décrit ci-dessus dans une plaque de 96 puits ou un tube à huit bandelettes spécifiquement pour la RT-PCR. Assurez-vous que les échantillons sont bien mélangés. Vérifiez qu’il n’y a pas de bulles dans les tubes avant de les placer sur l’appareil de PCR.
    3. Amplifiez le gène à l’aide du cycle de PCR (95 °C pendant 5 min), 40 cycles (95 °C pendant 10 s, 60 °C pendant 30 s) et complétez les données pour calculer la valeur Ct de 2-ΔΔ. Traitez, analysez et tracez les données à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié.

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Résultats

Comme le montre la figure 1A, grâce à l’observation avec une lampe à fente, nous avons constaté que la cicatrisation de l’épithélium cornéen était altérée. Dans des circonstances normales, l’épithélium cornéen central guérirait complètement dans les 24 à 48 heures suivant l’ablation, mais dans l’excision de l’épithélium central cornéen combinée à un modèle de suture, de nouveaux vaisseaux sanguins ont continué à exister. Le troisième jour après l’établissement du modèle, un œdème et une néov...

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Discussion

L’inflammation joue un rôle clé dans le développement de la déficience en cellules souches limbiques18, mais ses mécanismes et effets spécifiques nécessitent une exploration plus approfondie. Pour résoudre ce problème, nous avons induit le LSCD en grattant l’épithélium cornéen central et en suturant le stroma cornéen central pour provoquer une inflammation cornéenne sévère. Nous avons observé l’évolution de l’inflammation cornéenne et l’état des cellules souches l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée en partie par les Projets scientifiques et technologiques de la province du Guizhou (QKHJC-ZK[2024]ZD043), le Fonds scientifique provincial du Fujian pour les jeunes chercheurs distingués (2023J06053 [à S.O]) ; la Fondation des sciences naturelles de Chine (n° 82101084 [à S.O.] et le China Scholarship Council (CSC, 202306310049 [à Y.W.]).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ligne de suture 10-0Alcon, Inc., États-Unis8065698001
trépan cornéen de 2 mmSuzhou XVI Vision Company, Chinehttp://www.66vision.com/
20 &mu ; L, 100 &mu ; L, 1 mL têtes de pistolet de pipette, plaques de culture cellulaire, tubes à centrifugerGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Chinehttps://www.jetbiofil.com/index.html-20
/-80 ° ; C frigoQingdao Haier Company, Chinehttps://www.haier.com/cn/
Une seringue de 10 mL Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Chinehttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
Adhérer à la diapositiveShiTai Company188105
Alcool d’amylèneShanghai. Macklin Biochemical, Chinehttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokétineAbcam, Royaume-Uniab76318
Anticorps anti-kératine 12 EPR17882Abcam, Royaume-Uniab185627
Anticorps anti-PAX6Abcam, Royaume-Uniab195045
Lames anti-décapage, lamelles de recouvrementJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. , Chinehttps://cn.citotest.com/
AutoclaveHirayama, Japonhttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Chinehttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinehttps://www.siobp.com/web
Incubateur de four à CO2, broyeur à ultrasons, centrifugeuseThermo Fisher Technologies Inc., États-Unishttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Microscope confocalShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Chinehttps://www.clinx.cn/about
Pince épithéliale cornéenneSuzhou XVI Vision Company, Chine53418D
DAPIVector. Inc., États-UnisH-1000
DEPC eau  ; Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinehttps://www.siobp.com/web
Crème pour les yeux Dicuro (crème pour les yeux à l’ofloxacine)Santian Pharmaceutical Corporation, Japonhttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, milieu de culture, double anticorps, et PBSThermo Fisher Scientific, Inc., États-Unishttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, Royaume-Uni  ;
Balance électroniqueShanghai Ohaus Biotechnology Company, Chinehttp://shbio.com/company
Boîtier de la membraneParafilm, Inc., États-Unishttps://www.sigmaaldrich.cn
bandelette de test de fluorescéine sodique a été utilisée en ophtalmologieTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chinehttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Système micrographique fluorescent à contraste de phase inverséTE-2000U, Nikon, Japonhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Centrifugeuse de table FrozenEppendorf, Allemagnehttps ://www.eppendorf.sh.cn  ;
Cadre en feuillede verre Xiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Chinehttp://www.tagene.net/
H-1200 avec agent d’étanchéité DAPIXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Chinehttps://www.bosonbio.com.cn/
HE kit de colorationAuragene, Chinehttp://jushengwu.com/a048/
Hématoxyline-eosine kit de solution de solution de colorantAURAGEN, États-UnisP032IH
Balance électronique de haute et basse précisionSdolis, Allemagnehttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chinehttps://en.reagent.com.cn/
Ki-67 anticorpsAbcam, Royaume-Uniab16667
azote liquideXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Chinehttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Porte-micromainSuzhou XVI Vision Company, Chinehttp://www.66vision.com/
Poudre de multiformaldéhydeSigm, Amériquehttps://www.sigmaaldrich.cn
Centrifugeuse à température normale 46Eppendorf, Allemagnehttps://www.thermofisher.cn
OCTShanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., Chine4583
Système de micrographie biologique ordinaireEclipse 50i, Nikon, Japonhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ChineSH30256.01
PCR, et l’appareil de réacteurBiometra Thermocycler, Allemagnehttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipettes de différentes spécificationsEppendorf Company, Allemagnehttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Amorces pour Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Chlorhydrate de proméaine 0,5 % gouttes ophtalmiquesAlcon, Inc., États-Unishttps://www.alcon.com/about-us
Anticorps PMN contre le ratFitzgerald,États-Unis 20R-PR020
PCR quantitative de fluorescence en temps réelApplied Biosystems,  ; États-Unishttps://www.thermofisher.cn
Kit de transcription inverseTAKARA, Japonhttps://www.takarabiomed.com.cn/
Lampe à fenteTOPCON, Japonhttps://topconchina.cn/
Pince lisseSuzhou XVI Vision Company, Chinehttp://www.66vision.com/
Boîte à échantillonsLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chinehttp://chuangdianbio.com/
Banc SupercleanNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singapourhttps://www.hi-p.com/
Pince dentéeSuzhou XVI Vision Company, Chinehttp://www.66vision.com/
Gouttes ophtalmiques toppicamide (Medol)Alcon, Inc., États-Unishttps://www.alcon.com/about-us
Protéine d’acide nucléique à l’état de traces testeur de concentrationThermo Fisher Technologies Inc., États-Unishttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen États-Unishttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, avec un microscope chirurgicalCarl ZEIS, Allemagnehttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html
MCA341GA

Références

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