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Article de méthode

Planaire comme modèle animal pour les crises aiguës expérimentales

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DOI :

10.3791/67307

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14 février 2025

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1Department of Biomedical and Translational Sciences, Macon and Joan Brock Virginia Health Sciences Eastern Virginia Medical School, Old Dominion University

Dans cet article

Résumé

Les crises ont un impact négatif sur diverses fonctions et la qualité de vie. Les vers Planaria ont été exposés à des concentrations variables de chimioconvulsivants afin d’évaluer leurs phénotypes de convulsions et leur motilité perturbatrice. Cette étude propose d’utiliser les vers planaires comme modèle pour les crises aiguës chez l’homme et revêt une importance dans le développement de médicaments contre l’épilepsie.

Résumé

L’épilepsie est l’un des troubles neurologiques les plus répandus caractérisés par des crises spontanées récurrentes. Les crises représentent une manifestation clinique d’une activité cellulaire neurale incontrôlée et excessivement synchronisée. L’étendue des lésions cérébrales causées par les crises dépend de leur durée et de leur intensité. Malheureusement, il n’existe pas de remède efficace contre l’épilepsie. Le but de cette étude est d’évaluer si le ver planaire Dugesia dorotocephala pourrait servir de modèle pour aider à identifier et à développer des traitements de l’épilepsie pouvant cibler les crises aiguës. Actuellement, divers modèles, tels que les modèles marins, sont utilisés pour évaluer les médicaments anticonvulsivants (ASM). Cependant, ils sont très coûteux et il y a des problèmes éthiques. Par ailleurs, les modèles d’invertébrés offrent une opportunité de recherche rentable dans le processus de découverte de médicaments pour l’ASM. Les planaires appartiennent à la famille des vers plats et habitent les environnements marins d’eau douce et terrestres. Dugesia dorotocephala est l’espèce dominante de planaires aquatiques en Amérique du Nord. D. dorotocephala se présente comme un modèle d’invertébré viable pour les études sur l’épilepsie en raison de son rapport coût-efficacité, de ses neurones semblables à ceux des vertébrés et de ses comportements quantifiables, contrairement à d’autres invertébrés ou animaux plus grands. Ils ont été utilisés dans diverses études de pharmacologie et de toxicologie environnementale liées à l’âge, à la mémoire et à la régénération. Dans cette étude, les planaires ont été exposés à différentes concentrations de pilocarpine, un chimioconvulsivant commun pour étudier leur comportement lors de l’exposition. Suite à l’observation, les planaires ont été euthanasiés et conservés dans du formaldéhyde ou une solution de Golgi pour une évaluation neurohistologique. Six phénotypes comportementaux distincts ont été observés dans les planaires : oscillations dorsales, oscillations de la tête, expansion dorsale de la queue, forme en C, battement de la tête et battement de la queue. Les fréquences d’oscillation dorsale étaient significativement plus élevées chez les groupes expérimentaux par rapport au groupe témoin et présentaient une dépendance à la dose. De plus, la pilocarpine a perturbé la motilité des planaires. Les crises induites par la pilocarpine dans les planaires peuvent servir de modèle pour évaluer les crises aiguës et les médicaments anticonvulsivants, ce qui est essentiel dans le développement d’interventions thérapeutiques pour les patients humains souffrant d’épilepsie.

Introduction

L’épilepsie, caractérisée par deux crises ou plus dans les 24 heures sans cause apparente, touche ~50 millions de personnes dans le monde1. Parmi eux, 10 à 15 millions de personnes seraient atteintes d’épilepsie résistante aux médicaments2. Par conséquent, la recherche de médicaments contre l’épilepsie est cruciale. La condition implique de brefs épisodes de mouvement involontaire partiel ou généralisé, allant du regard vide à la rigidité et aux tremblements du corps, et est liée à une augmentation de l’activité électrique dans le cerveau3.

Historiquement, la recherche sur l’épilepsie s’est appuyée sur des rongeurs et d’autres mammifères en raison de leurs similitudes évolutives avec les humains. Cependant, ces méthodes peuvent prendre du temps et être coûteuses, ce qui nécessite une approche alternative 4,5. Des créatures non mammifères comme les mouches des fruits, les sangsues, les têtards, les poissons-zèbres et les vers ronds ont été utilisées dans des études et ont montré des résultats prometteurs6. De plus, il a été démontré que les planaires pouvaient fournir un modèle d’étude génomique comparative entre les génomes des invertébrés et des humains, ainsi que la capacité de tester des médicaments pro-convulsivants, des médicaments anticonvulsivants (ASM) et des modèles comportementaux6. Les planaires (Phylum Platyhelminthes), connus sous le nom de vers plats et membres de la classe des Turbellaria, sont principalement réputés pour leurs capacités de régénération ; Cependant, la présente étude se concentre sur leur réponse aux substances provoquant des convulsions.

Les planaires partagent des mécanismes neurologiques fondamentaux avec les humains, tels que la réactivité à la sérotonine et à la dopamine, montrant une similitude de 95 % avec les gènes liés au système nerveux dans le cerveau des mammifères et possédant une structure cérébrale reconnaissable7. De plus, ils présentent des mouvements observables dans des conditions de laboratoire et sont rentables, rapides et éthiques par rapport aux rongeurs ou à d’autres mammifères. Ces comportements observables, tels que les mouvements en forme de vis, de C et de noix, ont été largement documentés depuis des décennies et sont associés à des substances comme la cocaïne, la nicotine, la dopamine et la pilocarpine 7,8,9,10,11,12,13,14. Par conséquent, les planaires apparaissent comme un modèle viable pour la recherche sur les médicaments contre l’épilepsie chez l’homme.

Cette méthode vise à caractériser les neurones des planaires qui ont été exposés à la pilocarpine à l’aide d’une coloration de Golgi. La coloration de Golgi est utilisée pour visualiser les neurones en microscopie optique et a été utilisée pour déterminer si un changement de morphologie est lié aux crises 15,16,17. La littérature actuelle n’a aucune preuve d’une coloration de Golgi réalisée sur des cerveaux planaires. Bien que des études antérieures aient documenté les effets pharmacologiques en observant les phénotypes comportementaux, ce manuscrit est le premier à caractériser les neurones des planaires exposés à la pilocarpine à l’aide de la coloration de Golgi11,18. Cette technique s’avère précieuse pour visualiser et comprendre les changements morphologiques associés aux crises. Cette étude a noté une augmentation significative de la fréquence du comportement d’oscillation dorsale chez les vers planaires à mesure que la concentration de pilocarpine était augmentée.

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Protocole

REMARQUE : La conception globale de l’expérience est décrite à la figure 1.

1. Dosage du phénotype comportemental

  1. Préparez des concentrations de 1 mM et 2 mM de pilocarpine dissoute dans l’eau de source et contrôlez avec de l’eau de source uniquement.
  2. Pipeter 3 mL de chaque solution dans une plaque de 4 x 3 puits, chaque rangée représentant une concentration différente de pilocarpine.
  3. Placez une Dugesia dorotocephala élevée en laboratoire et âgée d’environ 2 semaines dans chacun des 12 puits à l’aide d’une pipette de transfert dont la pointe est coupée.
    REMARQUE : Coupez la pointe de manière à ce que l’extrémité soit suffisamment grande pour s’adapter à la planaire sans l’endommager.
  4. Enregistrez le comportement de la planaire pendant 1 h à l’aide de n’importe quelle caméra qui enregistre bien les comportements et qui est observable à l’œil humain, positionnée sur la plaque 4 x 3 puits dans des conditions normales d’éclairage intérieur.
  5. Répétez les étapes 1.1 à 1.4 avec des concentrations de 3 mM, 4 mM et 6 mM de pilocarpine dissoute dans de l’eau de source.

2. Analyse de la motilité

REMARQUE : Les comportements des planaires ont été enregistrés dans des puits de 2,5 cm de diamètre. Les enregistrements vidéo d’une durée de 1 h ont été divisés en parties de 30 minutes et recadrés à l’aide d’un logiciel commercial pour analyser les planaires individuellement.

  1. Commencez une nouvelle expérience à l’aide d’un logiciel d’analyse comportementale automatisée. Ouvrez le système amélioré de suivi automatisé du comportement. Cliquez sur Nouveau sous Nouvelle expérience. Nommez l’expérience.
  2. Configurez les paramètres expérimentaux comme décrit ci-dessous.
    1. Cliquez sur Paramètres du test dans l’invite du menu. Assurez-vous que les paramètres sont définis par défaut : source vidéo (à partir du fichier vidéo), Nombre d’arènes (1), Entités suivies (détection du point central), Technique de détection des points du corps (basée sur les contours), Options d’analyse (aucune), Unités (cm, s, deg).
  3. Configurez les paramètres de l’arène comme décrit ci-dessous.
    1. Cliquez sur Paramètres de l’arène sous l’onglet Paramètres de l’arène dans le panneau de configuration en haut à gauche. Lorsque vous êtes invité à télécharger une vidéo, sélectionnez les séquences enregistrées de planaria à partir de l’emplacement du fichier stocké. Une fois la vidéo sélectionnée, cliquez sur Saisir.
    2. Suivez les instructions dans le panneau supérieur droit de l’écran. Cliquez sur 1. Dessinez l’échelle pour calibrer. Sur l’image vidéo du puits, faites glisser une ligne d’échelle d’un bord à l’autre du puits de l’échantillon. Entrez la distance réelle du puits (2,5 cm).
    3. Cliquez sur 2. Sélectionnez Forme et dessiner l’arène. Assurez-vous que Arena 1 est sélectionné dans le panneau de droite. Déplacez le curseur de la souris en haut au milieu de l’écran et cliquez sur l’icône du cercle.
    4. Créez un cercle dans l’image vidéo téléchargée en le faisant glisser d’un périmètre de l’arène à un autre. Assurez-vous que l’aréna est dans la zone orange. Ajustez la forme pour qu’elle s’adapte à l’arène. Assurez-vous que l’étiquette Arena 1 se trouve à l’intérieur des limites de l’arena.
    5. En bas du panneau de droite, modifiez la forme, la taille et la position (Largeur : 2,75, Hauteur : 2,75, X : 0, Y : 0) aux mesures souhaitées.
    6. Cliquez sur 3. Sélectionnez Forme et dessiner des zones (facultatif). Le groupe de zone 1 dans le panneau de droite sera maintenant sélectionné. Déplacez le curseur de la souris en haut au milieu de l’écran et sélectionnez l’icône du cercle. Créez un cercle plus petit dans l’image de l’arène en le faisant glisser à l’intérieur.
    7. Dans le panneau inférieur droit, modifiez Forme, Taille et Position aux mesures souhaitées (Largeur : 1,75, Hauteur : 1,75, X : 0, Y : 0).
    8. Cliquez sur le bouton Ajouter une étiquette de zone dans la même barre de menu que le cercle. Cliquez au centre du cercle plus petit. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la balise Zone 1 dans le panneau de droite pour renommer le centre de zone.
    9. Cliquez à nouveau sur le bouton Ajouter une étiquette de zone . Cliquez sur le périmètre de l’arène, à l’extérieur de la zone centrale. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la zone 2 dans le panneau de droite pour renommer la zone Périmètre.
    10. Cliquez sur 4. Validez la configuration pour vous assurer que les paramètres de l’arène sont valides.
  4. Configurez les paramètres de contrôle de la version d’évaluation comme décrit ci-dessous.
    1. Cliquez sur Paramètres de contrôle d’essai sous l’onglet Paramètres de contrôle d’essai dans le panneau de configuration en haut à gauche. Six cases de composants apparaîtront. Cliquez sur Paramètres dans la quatrième case intitulée Condition, qui comprend Temps (1) et Temps infini (condition jamais remplie).
    2. Cliquez sur la bulle à côté de Après, puis saisissez la durée (30 min) dans la zone de texte de droite. Il y aura également un menu déroulant à droite de la zone de texte de l’heure pour sélectionner entre h, min et s.
      REMARQUE : Les paramètres de détection pour les séquences enregistrées dépendent de la qualité de la séquence. Les méthodes suivantes peuvent être manipulées pour observer les meilleurs résultats, spécifiques à chaque séquence.
  5. Configurez les paramètres de détection comme décrit ci-dessous.
    1. Cliquez sur Paramètres de détection sous l’onglet Paramètres de détection dans le panneau de configuration en haut à gauche. Cliquez sur le bouton Sélectionner une vidéo dans le panneau supérieur droit. Téléchargez la vidéo souhaitée pour baser les paramètres de détection.
    2. Cliquez sur l’onglet Avancé dans le même panneau de droite. Maintenant, sous l’onglet Méthode, assurez-vous qu’il est défini sur Mise à l’échelle des gris. Modifiez la plage (0 - 100).
    3. Sous l’onglet Lissage du panneau de droite, assurez-vous que le lissage des pixels vidéo est Aucun, que la correction des images perdues est désactivée et que la réduction du bruit de la piste est désactivée.
    4. Sous l’onglet Contour du sujet du panneau de droite, ajustez le réglage de la séquence et définissez Érosion, Dilatation et Érosion sur 1, 1 et 0, respectivement.
    5. Sous l’onglet Taille de l’objet, remplacez Minimum (0) et Maximum (125000). Cliquez sur Enregistrer en bas à droite.
  6. Mettez en place une séquence d’essais vidéo pour l’observation comme décrit ci-dessous.
    1. Cliquez sur Liste d’essai dans le panneau de configuration en haut à gauche. Téléchargez des séquences vidéo d’échantillons dans l’ordre souhaité en cliquant sur les points de suspension sous la colonne Fichier vidéo du système. Pour ajouter d’autres essais, cliquez sur Ajouter des essais en haut à gauche du panneau Liste des essais.
  7. Configurez les paramètres d’acquisition.
    1. Cliquez sur Acquisition sous l’onglet Acquisition en haut à gauche. Sous Paramètres d’acquisition dans le panneau de droite, cliquez sur Suivre tous les essais planifiés.
    2. Pour commencer l’acquisition, cliquez sur le bouton rouge en bas au milieu de l’écran à côté de Prêt pour le démarrage. L’acquisition vidéo va maintenant commencer et prendre un certain temps, en fonction de la quantité et de la durée des essais vidéo téléchargés.
  8. Configurez les paramètres d’analyse comme décrit ci-dessous.
    1. Cliquez sur Profil d’analyse sous l’onglet Analyse du panneau de gauche. Cliquez sur les variables dépendantes sélectionnées par défaut, Vélocité et Distance déplacée, et supprimez-les.
    2. Dans le panneau des variables dépendantes, sous l’onglet Emplacement, cliquez sur Dans la zone. Cliquez sur les cases Centre et Zone de périmètre pour qu’elles soient cochées.
    3. Cliquez sur l’onglet Statistiques d’essai dans la zone Inzone. Décochez la case Latency to First. Cliquez sur Ajouter.
    4. Sous l’onglet Corps, cliquez sur le bouton Rotation. Cliquez dans le sens des aiguilles d’une montre et laissez le seuil (50,00 degrés) et la distance minimale déplacée (2,00 cm) par défaut. Cliquez sur Ajouter.
    5. Cliquez à nouveau sur le bouton Rotation , puis sur Dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Cliquez sur Ajouter.
  9. Analysez les pistes comme décrit ci-dessous.
    1. Sous l’onglet Résultats, cliquez sur Suivre la visualisation. Dans le panneau de droite, sous Filtre, décochez Dernier. La barre de contrôle de lecture dans le panneau central inférieur de l’écran illustrera la visualisation des traces des échantillons à des moments précis de l’observation.
  10. Analysez et exportez les résultats. Les résultats se trouvent dans le reste des onglets du panneau inférieur gauche. Pour exporter des données, cliquez sur Données brutes ou Statistiques sous Exporter dans le panneau de gauche.

3. Euthanasie

  1. Préparez une solution de 22 mM d’eugénol dans de l’eau de source. Placez les planaires dans des boîtes de Pétri avec 9 ml de solution d’eugénol à 22 mM à l’aide de la pipette de transfert coupée, en gardant chaque concentration séparée. Euthanasier pendant 3 minutes ou jusqu’à ce que tout mouvement ait cessé.
  2. Placez les planaria dans une boîte de Pétri fraîche remplie de 9 ml d’eau de source pour rincer 1x-2x, et placez-les dans la solution de Golgi décrite ci-dessous (coloration de Golgi) ou dans le paraformaldéhyde à 4 % (coloration par immunofluorescence).

4. Analyse histologique

  1. Coloration de Golgi
    1. Une fois les planaires euthanasiés, placez-les dans un bécher ou une boîte de Pétri remplie d’un mélange 1:1 des solutions A et B du kit de coloration de Golgi. Remplacez les solutions A et B le lendemain en plaçant les planaires dans un nouveau bécher rempli d’un mélange de solutions A et B.
    2. Laisser les planaires reposer pendant 1 semaine dans les solutions A et B.
    3. Retirez les planaires des solutions A et B et placez-les dans la solution C dans un autre bécher. Remplacez la solution C le lendemain. Laisser reposer les planaires pendant au moins 72 h et jusqu’à 1 semaine dans la solution C.
    4. Retirez les planaires de la solution C à l’aide d’une pipette de transfert et intégrez-les en plaçant une petite quantité de composé OCT sur un mandrin, en ajoutant les planaires, puis en entourant les planaires avec du composé OCT. Découpez transversalement des planaires en sections de 5 μM avec la machine cryostat à -24° C.
    5. Montez le planaire sur des lames recouvertes de gélatine à l’aide d’une pipette de transfert et de la solution C et laissez-le sécher dans l’obscurité à RT jusqu’à 3 jours.
    6. Stachez les lames à l’aide de la solution de coloration (1 partie de solution D, 1 partie de solution E, 2 parties d’eau de source) en immergeant les lames dans des béchers avec les solutions suivantes : Solution de coloration pendant 10 min, puis dans l’eau de source 2x pendant 4 min chacune, puis 50 % d’éthanol pendant 4 min, puis 75 % d’éthanol pendant 4 min, puis 95 % d’éthanol pendant 4 min, puis en 100 % éthanol 4x pendant 4 min, et enfin en xylène 3x pendant 4 min.
    7. Lames de lamelle avec des supports de montage histologiques et observez les tissus sous microscopie à fond clair.
  2. Coloration par immunofluorescence
    1. Après l’euthanasie des planaires, les placer dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 24 h. Il peut également être conservé dans un réfrigérateur après cette étape.
    2. Transférez le planaria à 20 % de saccharose à partir de 4 % de PFA et laissez-le pendant 1 jour. Retirez les planaires du saccharose et placez-les dans le tampon PBS pendant 5 min.
    3. Rincez avec 3-4 lavages de tampon PBS et transférez à 20 % de saccharose pour le stockage jusqu’au moment de teindre.
    4. Placer dans des solutions d’alcool à 70 %, 95 % et 100 % pendant 1 minute chacune. Placer dans le xylène pendant 1 min.
    5. Placer dans de l’alcool à 95 % et à 70 % pendant 1 min chacun. Placer dans le tampon PBS 3x pendant 5 min chacun. Placer dans une solution de méthanol 60:40 et de peroxyde d’hydrogène pendant 10 à 15 min.
    6. Rincer au PBS 3x pendant 5 min chacun. Ajouter le volume de paraformaldéhyde à 4 % utilisé précédemment en 4.2.1 dans ce tampon PBS.
    7. Rincer au PBS 3x pendant 5 min chacun. Bloquer pendant 1 h avec du lait en poudre, en recouvrant les planaires avec.
    8. Diluer l’anticorps primaire (1H6) à 5 μg/mL avec du PBS et incuber les lames pendant la nuit à 4 °C dans la solution d’anticorps. Le lendemain, rincer les planaires dans du PBS pendant 10 min.
    9. Diluer l’anticorps secondaire (IgG anti-souris de chèvre) à 1 μg/mL dans du PBS et incuber les lames pendant la nuit à RT dans la solution d’anticorps. Le lendemain, rincer les planaires dans du PBS pendant 15 min.
      REMARQUE : Différents anticorps ont des concentrations optimales différentes ; Déterminez cela avant de commencer l’expérience.
    10. Montez l’ensemble des planaires sur la lame, recouvrez d’une lamelle, scellez avec un milieu de montage aqueux et observez le tissu au microscope fluorescent.

5. Analyse d’images

  1. Ouvrez l’application logicielle d’analyse d’images open source. Installez le plug-in colour_deconvolution2.jar sur l’application logicielle d’analyse d’images open source en faisant glisser le plug-in sur l’application.
  2. Sélectionnez l’image à analyser et faites-la glisser vers l’application logicielle d’analyse d’images open source. Allez dans l’onglet Image. Cliquez sur couleur. Cliquez sur Color Deconvolution2 v2.1.
  3. Dans l’option vecteurs, cliquez sur H DAB. Dans l’option de sortie, cliquez sur 8bit_Transmittance. Assurez-vous que les options LUT simulées, Produit vectoriel pour la couleur 3, Afficher les matrices et Masquer la légende sont toutes sélectionnées. Cliquez sur OK.
  4. Sélectionnez l’image en noir et blanc pour vous assurer que l’application logicielle d’analyse d’images open source peut analyser efficacement l’image.
  5. Allez dans l’onglet Image. Cliquez sur Ajuster. Cliquez sur Seuil. Ajustez le seuil de sorte que la coloration DAB ou le premier plan soit de couleur rouge avec un fond blanc. Assurez-vous que le seuil est le même pour chaque image si plusieurs images sont quantifiées.
  6. Cliquez sur Analyser. Cliquez sur Définir les mesures. Sélectionnez Zone, Valeur de gris min et max, Limite au seuil, Étiquette d’affichage, Médiane et Valeur de gris moyenne. Cliquez sur OK. Cliquez sur Analyser. Cliquez sur Mesurer. Obtenez le résultat.
  7. Répétez les étapes 1.2 à 1. Jusqu’à ce que toutes les images soient quantifiées. Cliquez sur l’image des résultats. Cliquez sur Fichier. Cliquez sur Enregistrer sous. Enregistrez le fichier sous forme de tableur et affichez les données sur le tableur.

6. Analyse statistique

  1. Calculez la moyenne et les erreurs-types de la moyenne (SEM) pour le comportement de la planaire à l’aide de l’analyse de variance (ANOVA) et du test t de Student pour la signification statistique (p < 0,05).

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Résultats

Le comportement suivant a été observé chez les planaires exposés à des concentrations variables de pilocarpine :
Oscillations dorsales : une formation en forme de bulle qui se déplace de l’extrémité crânienne du corps du planaire à l’extrémité caudale.
Oscillations de la tête : formation en forme de bulle par la tête du planaire qui forme une apparence de têtard.
Forme en C : la tête se déplace dans le sens des aiguilles d’une montre et la queue se déplace dans le sens inverse d...

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Discussion

Cette étude a démontré le comportement induit par la pilocarppine chez les planaires à différentes concentrations. Le comportement le plus pertinent était l’expansion dorsale oscillante, car ce comportement n’a pas été documenté dans d’autres études concernant le comportement convulsif dans les planaires 9,10,11,12. Le mécanisme par lequel la pilocarpine indui...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Fonds d’encouragement à la recherche EVMS (PI : A.E. Musto) et le Dr Jorge Jacot pour ses suggestions utiles concernant l’optimisation du protocole d’immunofluorescence.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
centrifuger de 1,5 mL
Solution de paraformaldéhyde à 4 %HimediaTCL119
Média de montage aqueuxClini SciencesNB-47-02240-30ML
Béchers (un pour chaque concentration testée)
Carolina Springwatercarolina132450
Cryostat
primaires et secondaires dilués
Éthanol (100 %)sigma Aldrich
EthosVision XT 16noldus
Fiji Version 2.9.0
Lames enrobées de gélatinesigma Aldrich643203
Golgi Anticorps 1H6DSHBAB_2619608
Golgi stain kit_Neuroscience AssociatePK 401/401A
Peroxyde d’hydrogène
Méthanol
Média de montagethermo fischer scientific
OCT compound
PBS buffersigma AldrichP4417
Lait en poudre
Feuille d’étain
Pipettes
Xylene
Tubes à Anticorps de transfert

Références

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Planaire comme modèle animal pour les crises aiguës expérimentales
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