Assemblage et quantification de co-cultures combinant des levures hétérotrophes avec des cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre

Dennis Hasenklever; Joana C. Pohlentz; Tom Berwanger; Emmanuel J. Kokarakis; Tanvir Hassan; Kerstin Schipper; Anna Matuszyńska; Ilka M. Axmann; Daniel C. Ducat

doi:10.3791/67311

Article de méthode

Assemblage et quantification de co-cultures combinant des levures hétérotrophes avec des cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre

DOI :

10.3791/67311

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27 décembre 2024

Dennis Hasenklever^*¹ , Joana C. Pohlentz^*² , Tom Berwanger^*² , Emmanuel J. Kokarakis³ , Tanvir Hassan⁴ , Kerstin Schipper² , Anna Matuszyńska⁴ , Ilka M. Axmann¹ , Daniel C. Ducat¹^,⁵

¹Institute for Synthetic Microbiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, ²Institute of Microbiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, ³Department of Microbiology, Genetics, & Immunology, Michigan State University, ⁴Computational Life Science, Department of Biology, RWTH Aachen University, ⁵Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole fournit une ligne directrice complète pour la mise en place et le suivi quantitatif des co-cultures, y compris les cyanobactéries photoautotrophes sécrétant du sucre et les levures hétérotrophes.

Résumé

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Avec la demande croissante de biotechnologies durables, des consortiums mixtes contenant un microbe phototrophe et des espèces partenaires hétérotrophes sont explorés comme méthode de bioproduction solaire. L’une d’entre elles consiste à utiliser des cyanobactéries fixatrices de CO₂ qui sécrètent du carbone organique pour soutenir le métabolisme d’un hétérotrophe co-cultivé, qui à son tour transforme le carbone en biens ou services de plus grande valeur. Dans ce protocole, une description technique est fournie pour aider l’expérimentateur à établir une co-culture combinant une souche cyanobactérienne sécrétant du saccharose avec un ou plusieurs partenaires fongiques, représentés par des espèces de levures modèles. Le protocole décrit les principales conditions préalables à l’établissement d’une co-culture : la définition de la composition du milieu, le suivi des caractéristiques de croissance des partenaires individuels et l’analyse de cultures mixtes avec plusieurs espèces combinées dans le même récipient de croissance. Les techniques de laboratoire de base pour la surveillance de la co-culture, y compris la microscopie, le compteur de cellules et la cytométrie en flux sur cellule unique, sont résumées, et des exemples de logiciels non propriétaires à utiliser pour l’analyse des données des fichiers standard de cytométrie en flux brute (FCS) conformément aux principes FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) sont fournis. Enfin, des commentaires sur les goulets d’étranglement et les pièges fréquemment rencontrés lors de la tentative d’établir une co-culture avec des cyanobactéries sécrétant du sucre et un nouveau partenaire hétérotrophe sont inclus. Ce protocole fournit une ressource aux chercheurs qui tentent d’établir une nouvelle paire de microbes co-cultivés qui comprend une cyanobactérie et un microbe hétérotrophe.

Introduction

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Avec l’expansion rapide des outils génomiques et des technologies de l’ADN ces dernières années, les efforts de bio-ingénierie sont de plus en plus en mesure de considérer les communautés mixtes de microbes comme viables pour les stratégies de bioproduction plutôt que de se concentrer uniquement sur les cultures axéniques. Les consortiums microbiens présentent de multiples avantages potentiels par rapport aux cultures monospécifiques, notamment la spécialisation et la division du travail, l’adaptabilité et la robustesse, et l’efficacité de l’utilisation du substrat¹. Cependant, l’ingénierie prévisible des consortiums multi-espèces est compliquée par les incertitudes causées par les comportements d’ordre supérieur qui émergent des interactions inter-espèces². La signalisation inter-espèces et l’échange de métabolites sont au cœur du principe de division du travail, mais conduisent également à des synergies et des antagonismes inattendus entre les participants des consortiums³. Des progrès considérables dans le domaine sont nécessaires si l’on peut réaliser le plein potentiel des consortiums microbiens mixtes, y compris l’utilisation de plateformes de coculture flexibles à 2 et 3 partenaires, qui peuvent être utilisées pour mieux caractériser et comprendre l’interactivité microbienne de bas en haut.

Quelques types dominants de plateformes de coculture sont actuellement utilisés dans le domaine, y compris les partenaires auxotrophes complémentaires et les microbes qui sécrètent des métabolites généralement bénéfiques pour un large éventail d’espèces microbiennes. Dans cette dernière catégorie, les cyanobactéries ont été modifiées pour devenir des producteurs primaires améliorés grâce à l’introduction de voies menant à la sécrétion de glucides facilement métabolisés et ont maintenant été explorées dans une variété de consortiums conçus rationnellement. En bref, dans de telles communautés microbiennes modifiées, le partenaire cyanobactérien est capable d’utiliser la lumière et le_CO2 comme intrants primaires, et grâce au processus de photosynthèse oxygénée, ces souches peuvent sécréter des sucres de carbone centraux en tant que bien public. Une classe de ces souches cyanobactériennes modifiées sont celles qui ont été modifiées pour sécréter le disaccharide saccharose⁴. De telles souches ont probablement connu leur succès parce que le saccharose est un métabolite proche du métabolisme central du carbone pour de nombreuses espèces et qui est également fréquemment hyper-accumulé en tant que soi-disant « soluté compatible » pour s’adapter à une variété de stress abiotiques environnementaux⁵. Un nombre minimal d’interventions génétiques peut conduire à une sécrétion efficace de saccharose dans une gamme d’organismes modèles cyanobactériens⁴.

Les cyanobactéries sécrétant du saccharose constituent une plate-forme utile pour l’étude de consortiums microbiens conçus rationnellement, car un large éventail d’espèces hétérotrophes peuvent métaboliser le saccharose comme leur principale source de carbone et d’énergie. En effet, en utilisant quelques cyanobactéries modèles ayant des capacités de sécrétion de saccharose, de nombreux laboratoires ont conçu rationnellement des co-cultures et des consortiums d’espèces mixtes qui contiennent un ou plusieurs microbes hétérotrophes et qui sont finalement soutenus par les apports primaires de lumière et de_CO2 sans supplémentation en matières premières de carbone organique⁴. Les souches hétérotrophes peuvent simplement subsister grâce aux glucides dérivés des cyanobactéries, ou elles peuvent être utilisées pour convertir la matière première du saccharose en bioproduits de plus grande valeur (p. ex., carburants, polymères, pigments, etc.). En plus d’être une stratégie potentielle pour une bioproduction durable, de telles co-cultures simplistes peuvent également être utiles comme plate-forme pour l’étude des interactions émergentes entre des espèces microbiennes non apparentées.

Cet article vidéo se concentre sur les méthodologies et les conditions préalables à l’utilisation des cyanobactéries productrices de sucre comme plate-forme flexible pour la conception de consortiums microbiens simples qui peuvent être stables en ne complétant que des apports de carbone léger et inorganique. Bien que la mise en place et la surveillance de cultures contenant des micro-organismes uniques établis soient généralement simples et puissent facilement être réalisées à l’aide de la densité optique (DO) ou de la méthodologie de rétrodiffusion, cela n’est pas réalisable une fois que deux organismes ou plus sont combinés dans un seul récipient. La raison principale est que ces méthodes ne font pas de distinction entre les différents micro-organismes, par conséquent, elles ne fournissent qu’une image globale de la culture et ne résolvent pas la croissance des organismes individuels. De plus, les cyanobactéries ont un large spectre d’absorption dans la gamme de 400 à 750 nm, de sorte que mesurer la DO₆₀₀d’un hétérotrophe conduirait à des résultats erronés en raison de la phycocyanine (qui absorbe en 620 nm). Par conséquent, des protocoles spécifiques pour la mise en place de communautés mixtes cyanobactéries-hétérotrophes au sein du laboratoire ainsi que des protocoles génériques utiles pour l’analyse des performances de ces consortiums au cours du temps, sont fournis. Bien que les protocoles se concentrent sur un appariement spécifique d’une espèce cyanobactérienne modèle sécrétant du saccharose avec un ou plusieurs microbes hétérotrophes modèles, l’objectif de ce travail est de fournir une ressource aux chercheurs qui souhaiteraient concevoir de nouveaux appariements d’espèces et d’accélérer la phase d’optimisation pour l’établissement de telles cultures. Par conséquent, en plus des protocoles spécifiques à l’espèce, des informations et des stratégies qui peuvent être utilisées pour adapter et généraliser ces protocoles pour les communautés coutumières, telles que définies par les besoins du lecteur, sont incluses.

En raison de la flexibilité de la plateforme de co-culture décrite dans le présent document, des protocoles pour un certain nombre d’espèces hétérotrophes différentes qui ont déjà été signalées en co-culture avec des cyanobactéries sécrétant du sucre sont décrits. Par exemple, le protocole étape par étape pour une co-culture de Synechococcus elongatus PCC 7942 avec la levure de laboratoire commune Saccharomyces cerevisiae est fourni. Cependant, l’article comprend également des protocoles appropriés pour évaluer les performances de co-cultures contenant d’autres espèces modèles, y compris la forme levure d’Ustilago maydis.

L’article se concentre sur un ensemble de protocoles de base nécessaires pour établir une co-culture cyanobactéries/hétérotrophes et effectuer une caractérisation de base de la performance de ces consortiums mixtes au fil du temps. Plus précisément, l’accent est mis sur les méthodes de cytométrie en flux unicellulaire et de comptage de particules permettant de recenser avec précision différentes espèces, ainsi que sur les approches microscopiques permettant d’évaluer la morphologie cellulaire. Ces protocoles sont destinés à servir de base à l’adaptation aux besoins et aux équipements disponibles. Il est important de noter que des notes techniques et d’autres considérations importantes pour l’établissement et le suivi des cocultures au sein du laboratoire sont fournies. Enfin, des exemples d’alternatives non propriétaires pour l’analyse de données de fichiers FCS⁶ bruts à l’aide de packages Python sont inclus. En résumé, l’objectif est de rendre les techniques de co-culture basées sur les cyanobactéries plus accessibles à un public scientifique plus large.

Protocole

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REMARQUE : Ce protocole contient des instructions détaillées sur la façon de mettre en place et de quantifier les co-cultures de S. elongatus sécrétant du sucre et d’espèces de levures modèles hétérotrophes. En général, le protocole s’applique à toutes les espèces de levures susceptibles d’être manipulées génétiquement.

1. Mise en place de co-cultures combinant cyanobactéries phototrophes et levures hétérotrophes

Préparations à la co-culture : Milieux et pré-culture
REMARQUE : Préparez tous les milieux et solutions mères en utilisant de l’eau filtrée ultra-pure. Toute la verrerie (béchers doseurs, cylindres gradués, bouteilles de stockage et flacons de culture) doit être nettoyée et autoclavée. Les milieux stériles peuvent être conservés à température ambiante (RT). Il faut disposer d’un appareil compatible avec les exigences de la culture photoautotrophe.
1. Préparez le milieu de coculture au moins 3 à 4 jours avant le début prévu de la coculture. La plupart des recettes de milieux de coculture sont des variations^{du milieu} BG-11 7 utilisé pour la culture régulière de nombreuses espèces modèles de cyanobactéries. Ce protocole utilise le milieu CoYBG-11 précédemment signalé comme exemple (⁸ ; Voir tableau 1). Stériliser à l’autoclave (121 °C, 20 min) ou par filtre (pores de 0,22 μm), selon le cas.
  REMARQUE : Voir la section Discussion pour des suggestions sur l’adaptation d’un milieu approprié pour d’autres appariements d’espèces.
2. Préparez des réactifs moléculaires : Pour l’induction de l’expression de cscB et l’exportation du saccharose ^9,10,11, préparez un stock de 1 M d’isopropyl-β-thiogalactoside (IPTG).
  REMARQUE : L’utilisation d’antibiotiques pendant la co-culture n’est pas optimale, mais si toutes les souches portent des cassettes de résistance, elles peuvent être utilisées. Dans ce cas, préparez des stocks d’antibiotiques en fonction des besoins des souches employées.
3. Préparez une préculture de cyanobactéries : Au moins 3 jours avant le début de la coculture, transférez les cellules d’une préculture de la souche sécrétrice de sucre de cyanobactéries cultivant dans le milieu BG-11 dans une fiole fraîche à chicanes contenant le milieu^{CoY BG-11} (tableau 1).
  REMARQUE : Plusieurs espèces et souches de cyanobactéries ont maintenant été modifiées pour sécréter des sucres. Pour un examen complet des souches disponibles au moment de la rédaction de cet article, voir⁴. Cette référence énumère également les espèces hétérotrophes (voir 1.1.4) pour lesquelles une co-culture de cyanobactéries a déjà été signalée.
  1. Mesurez la DO₇₅₀ de la préculture. Calculer le volume requis de la préculture pour atteindre une DO cible_{de 750} de 0,3 (C₁) à l’aide de l’équation V₁ = C₂ x V₂/C₁ où C₂ = DO cible, V₂ = volume cible et V₁ = volume requis de préculture. Par exemple, lors de l’inoculation d’une culture de 30 mL (V₂), la quantité x de culture liquide à utiliser est V₁ (mL) = (0,3 x 30)/(OD₇₅₀ mesurée).
    REMARQUE : La densité optique est une approximation de la densité cellulaire et dépend des conditions de croissance et de la morphologie cellulaire ; Par conséquent, il est nécessaire que les chercheurs utilisent des méthodes pour corréler la densité optique au nombre absolu de cellules (voir les sections 2.1, 2.2 et 2.3) afin d’évaluer correctement le rendement de la coculture. Pour les cyanobactéries, les longueurs d’onde lumineuses dans le spectre photosynthétiquement actif (c.-à-d. 400-700 nm) ne doivent pas être utilisées pour déterminer la densité optique, car elles sont absorbées par la chlorophylle et d’autres pigments ; Par conséquent, les longueurs d’onde du rouge lointain sont couramment utilisées (par exemple, 750 nm).
  2. Incuber la culture diluée dans un photoincubateur approprié. Incubation typique
    Les conditions pour les cyanobactéries modèles sont les suivantes : 30 °C, 150 tr/min (course de 25 mm), 2 % de CO₂ d’espace de tête, ~200 μmol de photons ^m-2·^s-1 d’éclairage LED, 75 % d’humidité.
    REMARQUE : Une supplémentation en CO₂ est fortement recommandée pour optimiser la quantité de saccharose libérée.
  3. Répétez ce processus de dilution chaque jour pendant au moins 3 jours avant de mettre en place la co-culture afin de vous assurer que les cyanobactéries sont en croissance exponentielle. Cela permettra d’améliorer l’uniformité des performances de co-culture entre les expériences de différents jours.
4. Au moins 2 jours avant le début de la co-culture, préparez une préculture hétérotrophe. Comme nous l’avons mentionné, un certain nombre d’espèces et de sous-souches de levures ont déjà été cultivées en coculture avec des cyanobactéries ^8,12,13.
  1. Transférez des cellules dans une dilution de 1:100 (250 μL) d’une culture liquide de l’espèce hétérotrophe cultivant dans un riche bouillon de culture (voir le tableau 1) dans 50 mL de milieu CoY^BG-11 complété par 20 g/L de saccharose dans une fiole à chicanes de 250 mL.
  2. Incuber toute la nuit à la même température que les conditions de culture utilisées pour le partenaire cyanobactérien.
5. Vérifier OD₆₀₀ au moins 24 h avant le moment prévu de l’inoculation de la co-culture pour s’assurer que la souche hétérotrophe s’est suffisamment développée pour les besoins expérimentaux (voir 1.2) : diluer dans un milieu frais pour maintenir une croissance exponentielle si nécessaire.
Co-culture, inoculation et entretien
REMARQUE : Voir la section Discussion pour des considérations sur le rapport d’inoculation entre les microorganismes phototrophes et hétérotrophes.
1. Pour l’inoculation de la co-culture, enrichir les deux précultures par centrifugation.
  1. Calculer le volume de suspension cellulaire concentrée pour obtenir la densité de départ souhaitée pour les deux espèces à l’aide de l’équation standard C₁ x V₁ = C₂ x V₂, où C₁ = DO de culture enrichie. Par exemple, pour faire une culture de 25 mL de S. elongatus avec une DO_{initiale de 750} de 0,5 (à partir d’une culture axénique de 1,5 DO) et de S. cerevisiae avec une DO_{de départ de 600} de 0,05 (à partir d’une culture axénique de 0,7), sur la base de l’équation ci-dessus, 8,33 mL de culture de départ de S. elongatus , 1,79 mL de culture hétérotrophe enrichie sont nécessaires, et 14,88 ml de milieu CoY^BG-11 .
  2. Centrifuger les cultures à l’aide de 13 000 x g pendant 10 min à RT. Dans des conditions stériles, décantez et jetez le surnageant.
    REMARQUE : Une force centrifuge relative inférieure (RCF ; xg) peut être utilisée pour granuler S. cerevisiae car ce sont des cellules plus grandes (2x-3x fois) par rapport à S. elongatus, mais veillez à ce que le surnageant devienne transparent. Pour la collecte de la biomasse cyanobactérienne, moins de 13 000 x g peuvent également être utilisés, mais la centrifugation nécessiterait un temps de centrifugation plus long (p. ex., 4 000 x g peuvent être utilisés pendant 20 min).
  3. Remettre la pastille de cyanobactéries en suspension dans 25 mL de milieu stérile CoY^BG-11 . Utilisez les mêmes conditions de centrifugation que précédemment, puis jetez et décantez le surnageant.
  4. Répétez ce processus deux fois pour S. elongatus et 4 fois de plus pour S. cerevisiae.
    REMARQUE : Il est important de laver les granulés de cyanobactéries et de l’hétérotrophe (S. cerevisiae) pour éliminer les composants résiduels du milieu. Comme S. cerevisiae avait déjà poussé en présence de saccharose, le nombre accru d’étapes de lavage garantira que le sucre résiduel éventuel sera éliminé.
  5. Une fois la DO vérifiée, combiner les volumes de S. elongatus et de S. cerevisiae dans une fiole chicanée de 250 mL dans des conditions stériles et ajouter CoY^BG-11 à un volume final de 50 mL. Diluer à partir de la stock de 1 M d’IPTG préalablement préparée jusqu’à une concentration finale de 1 mM (ceci pour inciter les cyanobactéries à exporter le saccharose vers le milieu). Pour une culture de 50 ml, utilisez 50 μL de la pâte IPTG de 1 M.
    REMARQUE : Les flacons à chicanes sont généralement meilleurs car ils offrent une meilleure aération et un meilleur mélange pour les cyanobactéries.
  6. Placez le ballon de l’étape précédente sur un éclairage LED de 200 μmol photons·^m-2·^s-1 complété par 2 % de CO₂ à 30 °C avec agitation orbitale à 150 tr/min (portée de 25 mm) et 75 % d’humidité.
    REMARQUE : Les conditions mentionnées ci-dessus peuvent varier et doivent être optimisées en fonction du résultat expérimental.
  7. Surveiller la croissance de la culture par prélèvement stérile (1 mL) toutes les 12 h ou 24 h (voir rubrique 2). En option, utilisez les échantillons pour effectuer une microscopie standard de cellules vivantes et pour déterminer les unités formant colonies (UFC¹⁴) de cellules de levure sur un milieu approprié pour suivre la morphologie et la valeur adaptative des cellules et pour surveiller la quantité de cellules hétérotrophes vivantes ainsi que la contamination.
    REMARQUE : Les UFC ne sont pas recommandées comme méthode pour surveiller la densité cellulaire précise des espèces cyanobactériennes, qui peuvent subir un stress important lors de la transition de la culture dans le milieu liquide à solide. Par conséquent, il faut choisir des plaques de gélose avec un milieu riche approprié pour la croissance de l’espèce ou des partenaires de levure, tels que l’extrait de levure peptone dextrose (YEPD)¹⁵.

Composé chimique	BG-11 (concentration mg/L)	CoY BG-11 (concentration mg/L)
NaNO₃	1500	1500
K₂HPO₄	40	40
MgSO₄·7H₂O	75	75
CaCl₂ · 2H₂O	36	36
Acide citrique	6	6
Citrate d’ammonium ferrique	6	6
EDTA (sel disodique)	1	1
Na₂CO₃	20	20
Composition des métaux traces
H₃BO₃	2.86	2.86
ZnSO₄·7H₂O	0.222	0.222
Co(NO₃)₂ · 6H₂O	0.0494	0.0494
MnCl₂·4H₂O	1.81	1.81
CuSO₄ · 5H₂O	0.079	0.079
NaMoO₄·2H₂O	0.39	0.39
Additionnel
HEPPSO	7160	7160
Base d’azote de levure (YNB), sans acides aminés, sans sulfate d’ammonium	–	360⁸, 1200¹³
Agent de titrage pH 8,3	KOH	KOH
KPO₃	–	118
Saccharose (pour les hétérotrophes seulement)	–	13690

Tableau 1 : Composition des milieux du BG-11 et du^{CdY BG-11}. Étant donné les concentrations de levure-azote base, les concentrations dans CoY^BG-11 sont dérivées des ressources publiées ^8,12,13.

2. Outils et méthodologie pour suivre la croissance des co-cultures

REMARQUE : Ce protocole est une ligne directrice pour l’analyse et la surveillance de la co-culture, des techniques simples mais exigeantes comme la microscopie et les chambres de comptage aux applications à haut débit comme les compteurs de particules et la cytométrie en flux unicellulaire. Outre la co-culture proprement dite, il est conseillé d’inclure des cultures axéniques des micro-organismes individuels pour permettre une analyse complète. Comme point de départ général pour l’analyse, déterminez le DO des cultures. Dans cette section, différentes méthodologies sont détaillées qui peuvent être utilisées pour convertir les mesures relatives de la densité cellulaire (c’est-à-dire la DO) en valeurs absolues du nombre de cellules par volume. La mesure de l’OD₇₅₀ est souvent utilisée pour déterminer la densité cellulaire des cultures de cyanobactéries (en raison de l’absorption de longueurs d’onde de 400 à 700 nm), tandis que l’OD₆₀₀ est utilisée pour les organismes hétérotrophes. Les deux mesures fournissent des valeurs indicatives approximatives avec des unités arbitraires. Notez que les valeurs peuvent différer considérablement d’un instrument à l’autre.

Quantification microscopique avec chambres de comptage
REMARQUE : Les chambres de comptage (c.-à-d. Neubauer (amélioré)/hémocytomètres) sont un moyen simple et peu coûteux de déterminer la composition de co-cultures composées de cellules qui peuvent être facilement distinguées morphologiquement, i.e., par la forme de leurs cellules (Graphique 1A). Il se compose d’une lame de microscope en verre épais et d’un verre de protection. Si le verre de protection est correctement positionné sur le dessus de la lame, il crée deux chambres de volume de précision avec des grilles gravées (Graphique 1B-D). En comptant une zone définie d’une grille, la concentration cellulaire d’une suspension peut être calculée. Les chambres de comptage sont disponibles en différentes profondeurs. En fonction de l’épaisseur de la cellule, une profondeur de chambre appropriée doit être choisie. Pour les cellules fongiques telles que U. maydis ou S. cerevisiae, Une profondeur de 0,1 mm fonctionne bien. Cette profondeur de chambre est trop grande pour les cellules plus petites telles que les cyanobactéries, et les cellules flottent dans la chambre. Une chambre d’une profondeur de 0,02 mm convient à la fois aux cyanobactéries et aux co-cultures de cyanobactéries et de champignons.
1. Assurez-vous que la chambre de comptage et le verre de protection sont exempts de poussière et de cellules.
  REMARQUE : Le nettoyage avec de l’éthanol à 70 % (v/v) et des mouchoirs non pelucheux est recommandé directement avant l’utilisation.
2. Pour positionner correctement la vitre de protection, faites-la glisser sur les deux barres de support avec une légère pression, mais faites attention à ne pas la casser.
  REMARQUE : Un verre de protection épais spécifique est requis pour cette application (reportez-vous au manuel de la chambre). Étant donné que la vitre de protection se brise parfois pendant le montage, il est bon d’avoir des pièces de rechange à portée de main.
3. Lorsque le verre de protection est correctement positionné, observez les anneaux de Newton (Figure 1B) entre les deux surfaces vitrées, et que le verre de protection ne glisse plus.
  REMARQUE : Une légère respiration sur le verre de protection avant l’assemblage améliore souvent le résultat.
4. Mélangez soigneusement la suspension cellulaire et appliquez quelques microlitres (~2-10 μL selon la profondeur de la chambre) de la suspension cellulaire sur le bord de la chambre et laissez-la se remplir complètement par capillarité. Utilisez une dilution appropriée de la suspension cellulaire pour permettre un comptage fiable, par exemple, ce qui donne 20 à 200 cellules par grand carré (figure 1D, rectangle rouge).
5. Utilisez l’objectif approprié (p. ex., 10x) d’un microscope optique (champ clair ou mode de contraste de phase) et concentrez-vous sur les lignes de la grille de la chambre de comptage. L’orientation est assurée par la grille. Commencez à compter les cellules dans les carrés adaptés à la taille de cellule donnée.
  REMARQUE : Utilisez une aide technique telle qu’un compteur portable ou une application pour smartphone appropriée pour compter (par exemple, un « compteur d’objets » général ou des applications d’hémocytomètre spécialisées offrant des fonctionnalités extrêmement utiles). Définissez une règle de comptage des cellules situées sur les bords de la grille afin d’éviter les doubles comptages. Par exemple, les cellules situées sur les bordures supérieure et gauche de chaque carré peuvent être comptées tout en excluant celles situées sur les bordures droite et inférieure. D’autres règles existent¹⁶. Si un microscope à fluorescence est utilisé, les cellules peuvent également être distinguées en fonction de leur autofluorescence ou de leurs marqueurs fluorescents.
6. Après avoir compté, par exemple, les quatre grands carrés dans les coins, déterminez la valeur moyenne de chaque type de cellule. À l’aide de ces valeurs moyennes, de l’aire du carré utilisé et de la profondeur de la chambre donnée (consulter les informations du fabricant), calculez les concentrations des cellules (voir Résultats représentatifs).
  REMARQUE : Selon la taille de la cellule, différents carrés peuvent être utilisés pour le comptage. Pour les cellules de levure et de cyanobactérie, les quatre grands carrés dans les coins fonctionnent bien (figure 1D, rectangle rouge).
7. Après utilisation, nettoyez la chambre en tenant compte des exigences des échantillons (par exemple, inactiver les organismes génétiquement modifiés de manière appropriée).
Quantification à l’aide de compteurs de particules
REMARQUE : Selon les caractéristiques des cellules d’une co-culture, un compteur de particules peut être appliqué pour déterminer le nombre de cellules des partenaires. Pour l’applicabilité de cette méthode, les cellules doivent différer fortement dans leur taille ; Par exemple, la discrimination des cellules bactériennes et de levure peut être réalisée. Des cultures axéniques des micro-organismes individuels du consortium doivent être incluses pour permettre l’interprétation des résultats. Les cocultures hébergeant des cellules de tailles similaires ou de plus de 2 partenaires doivent être analysées à l’aide de la méthodologie décrite aux sections 2.1 ou 2.3.
1. Préparatifs
  1. Ajuster la DO de la culture à 0,1 et diluer l’échantillon 1 000 fois avec un tampon de mesure isotonique (consulter le manuel de l’appareil) dans un volume total de 10 ml. Préparer les triplés techniques de tous les échantillons.
  2. Sélectionnez une taille de pore appropriée du capillaire pour l’expérience.
    REMARQUE : La taille des pores doit se situer dans la plage des plus petites cellules de la co-culture, mais elle doit également inclure les cellules les plus grandes. N’allez pas trop petit car le pore pourrait se boucher en raison de l’agrégation cellulaire, ce qui peut se produire en raison de la division cellulaire. Les tailles de pores disponibles diffèrent. Un capillaire de 45 μm, par exemple, commence à détecter des cellules d’un diamètre de 0,7 μm (U. maydis et S. cerevisiae 3,5 μm-5,5 μm, S. elongatus/Synechocystis sp. ~1-2,5 μm).
2. Quantification de cellules dans un compteur de particules
  1. Démarrez l’appareil. Finalement, effectuez un auto-test pour le contrôle de la qualité (consultez le manuel de l’appareil spécifique).
  2. Chargez les échantillons dans les gobelets d’échantillons, fixez le couvercle et mélangez l’échantillon en inclinant légèrement le gobelet.
    REMARQUE : Essayez d’éviter la mousse et les bulles. Utilisez toujours une tasse pour chaque mesure. Les gobelets peuvent être nettoyés et réutilisés plusieurs fois. Jetez les gobelets s’il y a des résidus qui ne peuvent pas être enlevés. Si l’échantillon reste dans la tasse pendant de longues périodes, mélangez-le à nouveau avant de mesurer.
  3. Enregistrez dans une plage de 0 à 30 μm en raison des agrégats cellulaires potentiellement plus grands que les cellules individuelles.
    REMARQUE : Tout d’abord, utilisez chacune des cultures axéniques des partenaires de co-culture pour avoir une idée de la taille des cellules et pour déterminer si elles peuvent être distinguées par leur taille.
  4. Après l’évaluation, déterminez la composition de la co-culture de la même manière.
Quantification en consortium à l’aide de la cytométrie en flux sur cellule unique
REMARQUE : La cytométrie en flux sur cellule unique est une méthode à haut débit qui peut être utilisée pour déterminer le nombre de cellules des partenaires individuels dans la co-culture, étant donné que les partenaires peuvent être discriminés par la taille/leurs propriétés de diffusion de la lumière et/ou la fluorescence. Il est important de noter que, pour l’établissement de la méthode, les cultures axéniques des partenaires de co-culture sont nécessaires pour analyser leurs propriétés dans le cytomètre et ajuster les portes de population en conséquence. Pour les souches portant un rapporteur fluorescent, les souches sans rapporteur fluorescent sont nécessaires comme témoins négatifs. Une connaissance de base des applications de cytomètre facilitera la mise en œuvre réussie du protocole ci-dessous¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. Dans cet exemple, un mélange artificiel de 3 micro-organismes est analysé (voir Résultats représentatifs): Synechocystis (exprimant un fluorophore rapporteur cytosolique, mVenus) et les deux levures S. cerevisiae et U. maydis. Pour une discrimination précise de S. cerevisiae et U. maydis, des marqueurs de fluorescence ont été introduits sous la forme de protéine fluorescente verte cytoplasmique (GFP) (U. maydis eGFP) et la protéine fluorescente rouge (RFP) mKate2 (S. cerevisiae mKate2) à l’aide de techniques de clonage moléculaire de base. Si possible, les souches avec intégration génomique des rapporteurs doivent être préférées pour éviter la nécessité de pressions de sélection continues.
1. Préparation des échantillons
  1. Mesurer la DO des cultures à un stade de croissance donné à analyser.
  2. Ajustez le diamètre extérieur des échantillons à une plage adaptée à la mesure. Utiliser une DO₇₅₀ d’environ 0,05-0,5 pour les cyanobactéries et une DO₆₀₀ de 0,2-1,5 pour la levure en utilisant un milieu de culture frais (volume final : au moins 500 μL). Pour les co-cultures, visez une DO₇₅₀ entre ~0,1 et 0,5 et notez le facteur de dilution. Pour le calcul, appliquez la formule fournie à l’étape 1.1.3.1. Cela garantira que le nombre de cellules reste dans une plage de 1 000 à 10 000 cellules/s à un débit de 10 μL/min (équivalent à 6 000 à 60 000 cellules/μL).
    REMARQUE : Pour la dilution, un milieu ou un tampon sans autofluorescence et particules peut être utilisé (par exemple, BG-11). Soyez prudent avec les milieux contenant des ingrédients complexes tels que l’extrait de levure qui peuvent apparaître sous forme de particules dans la mesure.
  3. Transvaser 300 μL de chaque suspension de cellule d’échantillon dans un puits individuel dans une plaque à 96 puits (puits rond standard, clair, fond plat).
    REMARQUE : Vous pouvez également transférer 0,5 à 2 mL dans un tube de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) si le mode d’échantillonnage semi-automatique est utilisé au lieu du mode de lecture de plaques.
2. Mesure cytométrique
  1. Démarrez le cytomètre et effectuez le programme de démarrage et le contrôle de la qualité (CQ) selon les instructions du fabricant.
  2. Charger (chargeur de plaques ou échantillonnage semi-automatique) et analyser les échantillons. Commencez par les échantillons de contrôle en utilisant les cultures axéniques de chaque partenaire de co-culture pour identifier chaque espèce en fonction de ses propriétés avant de viser à les séparer dans un échantillon de co-culture.
  3. Des diagrammes à points ouverts et/ou des histogrammes pour les canaux de fluorescence et de diffusion (p. ex., diffusion directe [FSC] ou diffusion latérale [SSC], hauteur [-H] ou aire [-A]) pertinents pour les échantillons.
  4. Recherchez la ou les populations cellulaires requises et ajustez le seuil pour exclure le bruit technique et les petites particules du milieu.
    REMARQUE : Il est recommandé de rechercher la population cellulaire dans un graphique à points FSC-H sur FSC-largeur ou FSC-H sur SSC-H et d’ajuster l’échelle de linéaire à logarithmique pour les petites cellules comme les bactéries (généralement 1-3 μm). Réglez le seuil dans le canal FSC-H ou SSC-H. Pour les cellules de moins de 1 μm de diamètre, utilisez le SSC violet (VSSC) dans le laser violet à 405 nm pour une meilleure résolution.
  5. Ajustez manuellement le gain de chaque canal d’intérêt sur une plage de 25 à 2 500. Ajustez les gains de telle sorte que la commande négative (par exemple, sans le marqueur fluorescent) soit dans une plage de 1 x 10^2-1 x 10³ et que la commande positive (par exemple, avec le marqueur fluorescent) soit dans une plage de 1 x 10^5-1 x 10⁶ pour obtenir la meilleure séparation et rester dans la plage de 1 x 10^1-1 x 10⁷.
    REMARQUE : Les gains standard du QC peuvent également être conservés comme une bonne référence.
  6. Pour déterminer la concentration cellulaire dans l’échantillon, consignez un volume d’échantillon défini à l’aide de la fonction d’enregistrement (p. ex., 10 μL à un débit de 10 μL/min). Plus tard, divisez le nombre de cellules individuelles mesuré pour ce volume par le volume enregistré pour obtenir un nombre de cellules par μL pour chaque population.
    REMARQUE : Gardez à l’esprit le facteur de dilution initial lorsque vous calculez la concentration cellulaire dans la culture ou l’échantillon.
3. Gating/sélection de populations cellulaires
  REMARQUE : Indépendamment de l’appareil utilisé pour effectuer les mesures, l’analyse et le contrôle peuvent être effectués dans le logiciel d’exploitation du cytomètre ou un logiciel d’analyse commercial, comme illustré ci-dessous²². De plus, l’analyse des données de cytométrie en flux à l’aide d’un logiciel non propriétaire peut être effectuée efficacement avec divers outils open source tels que FlowCytometryTools²³ ou FlowKit, en utilisant FlowUtils²⁴ packages en Python. Dans l’esprit de la science ouverte, ce protocole partage un JupyterNotebook exemplaire mettant en valeur l’utilisation de ces packages pour l’exploration de données de base. Bien sûr, les logiciels alternatifs peuvent tout aussi bien convenir pour effectuer la bioinformatique de cytométrie en flux²⁵.
  1. Sélectionnez certaines populations de cellules en dessinant des portes autour d’elles dans un graphique à points ou en définissant des segments de diviseur ou de ligne autour des pics d’un histogramme (Figure 4).
    REMARQUE : La fonction de porte automatique du programme peut être utilisée comme référence.
  2. Séparer les signaux pour les organismes phototrophes et hétérotrophes en fonction de l’autofluorescence de l’organisme phototrophe (principalement causée par la chlorophylle) dans la région rouge du spectre. Exemple : Utilisez l’histogramme du canal APC-H (excitation (ex.) à 638 nm, émission (em.) à 660/10 nm) et définissez un diviseur vertical entre le pic droit (phototrophe = population positive à l’autofluorescence chlorophyllienne) et le pic gauche (hétérotrophe = population négative à l’autofluorescence chlorophyllienne) (Figure 4A).
    REMARQUE : Les marqueurs fluorescents peuvent également être utilisés pour distinguer deux (ou plus) partenaires phototrophes au sein d’une même culture (par exemple, mVenus pour Synechocystis).
  3. Séparez les deux organismes hétérotrophes en fonction de leurs marqueurs fluorescents ou de leurs propriétés de diffusion (FSC, SSC, si possible).
    REMARQUE : La séparation basée sur les propriétés de diffusion n’est applicable que si les cellules ont, par exemple, une taille ou une morphologie de cellule différente qui entraîne des changements visibles dans la diffusion (par exemple, Synechocystis : cellules sphériques de ~1,5 à 3 m de diamètre par rapport à U. maydis cellules allongées d’une longueur de 10 m et d’un diamètre d’environ 1 à 2 m²⁶).
  4. Exemple : Utiliser l’histogramme du canal FITC-H (ex. : 488 nm, ém. : 525/40 nm) affichant uniquement la population « hétérotrophe » pour distinguer les cellules hétérotrophes contenant de la GFP (par exemple, U. maydis etGFP) de celles sans GFP (par exemple, S. cerevisiae RFP/mKate2) (Figure 4B). Alternativement, utilisez l’histogramme du canal PC5.5-H (ex. : 561 nm, ém. : 710/50 nm) affichant uniquement la population « hétérotrophe » pour distinguer les cellules hétérotrophes contenant RFP (par exemple, S. cerevisiae RFP/mKate2) et celles sans RFP (par exemple, U. maydis GFP) (Figure 4C).
    REMARQUE : Gardez à l’esprit que deux (ou plus) types de cellules différents peuvent « coller » ensemble pendant la mesure. Ces « doublets » ou « multiplets » peuvent facilement être détectés dans les diagrammes à points des deux marqueurs fluorescents (par exemple, APC-H sur FITC-H pour identifier les doublets de phototrophes et les partenaires hétérotrophes marqués GFP).
  5. Pour l’analyse de base des données en Python, suivez les instructions de ce Jupyter (https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow).
    REMARQUE : Ce bloc-notes prend en charge trois étapes d’analyse des données. i) Importer des données : Importation de fichiers FCS. ii) Effectuer un contrôle de qualité : vérifier l’intégrité des données et le nombre d’événements. iii) Visualiser les données : utilisez des graphiques tels que des histogrammes, des nuages de points et des graphiques de densité pour visualiser les données. De plus, la procédure comment effectuer un gating pour isoler les populations d’intérêt reproduisant la figure 4 est affichée.
    Pour faciliter l’analyse des co-cultures dans les projets à long terme, il est recommandé au chercheur d’utiliser les méthodes ci-dessus pour compter le nombre de cellules et créer des courbes standard pour comparer les valeurs de DO aux nombres absolus de cellules. La densité optique est une mesure relative qui peut varier en fonction de l’espèce, de la déformation, des conditions de croissance et du spectromètre. Par conséquent, la génération de courbes standard « internes » est nécessaire pour la conversion précise des valeurs OD en numéros de cellules.

figure-protocol-1
Figure 1 : Quantification microscopique de cellules morphologiquement distinguables. (A) Une chambre de comptage de Neubauer. (B) Les anneaux de Newton indiquent le positionnement correct du lamelle spéciale. (C) Représentation schématique de l’architecture de la chambre avec la cavité centrale de volume défini pour le comptage des cellules. (D) La grille de la chambre de comptage de Neubauer représentée se compose de neuf grands carrés d’une taille de 1 mm² (rouge). Les quatre grands carrés dans les coins sont divisés en 16 carrés (bleu). Le grand carré central est divisé en 25 carrés de groupe d’une taille de 0,04^mm2 (orange). Chaque carré de groupe se compose de 16 plus petits carrés (vert). Le chiffre a été généré à partir des informations des fabricants accessibles au public. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etablissement de co-cultures de S. elongatus phototrophes et de levures hétérotrophes
Nous avons déjà présenté des résultats détaillés de la co-culture de Synechococcus elongatus PCC 7942 avec une variété de sous-souches de S. cerevisiae. Pour une description complète des résultats de co-culture avec cette paire cyanobactéries/levures, voir⁸. Par souci de concision et d’exactitude, ces résultats ne sont pas reproduits ici. Brièvement, les résultats antérieurs indiquent un certain nombre de considérations qui sont importantes pour l’établissement de co-cultures cyanobactériennes-levures à long terme. La capacité de la levure à survivre dans des conditions où les cyanobactéries fournissent les seules formes de carbone fixe dépend fortement de l’efficacité avec laquelle la souche de levure peut utiliser le saccharose. Les souches de S. cerevisiae qui ont évolué ou qui ont été modifiées pour métaboliser plus efficacement le saccharose^27,28 étaient plus susceptibles de survivre à la transition vers le mode de croissance en co-culture, ont atteint des densités cellulaires plus élevées et ont montré une plus grande robustesse dans les expériences de co-culture de cyanobactéries à long terme (de quelques jours à quelques semaines)⁸. La phase initiale de l’inoculation d’une co-culture était particulièrement importante pour la viabilité de la levure, probablement en raison des contraintes de dilution de la culture, de la composition du milieu de commutation et/ou du retrait d’une source de carbone plus concentrée. Par conséquent, les efforts visant à faciliter la transition d’un milieu de croissance plus riche à une disponibilité minimale de carbone au début de la coculture peuvent améliorer le rendement et la cohérence des expériences (voir l’étape 1.2.1.1). De plus, S. cerevisiae a présenté des réponses de stress compatibles avec l’hyperoxie lorsqu’il a été inoculé dans des cultures denses de S. elongatus, ce qui correspond à la formation d’O₂ en tant que sous-produit primaire de la photosynthèse oxygénée. Par conséquent, les efforts visant à prévenir la prolifération du partenaire cyanobactérien et/ou l’alternance des cycles de lumière « jour/nuit » pourraient prolonger considérablement la viabilité de S. cerevisiae dans les cocultures à long terme. Voir la section Discussion pour un résumé supplémentaire des phénomènes courants dans les co-cultures par rapport aux échantillons de contrôle axéniques.

Suivi de la croissance des cocultures à l’aide de différentes méthodologies
Dans la section suivante, la quantification exemplaire d’un consortium tripartite artificiellement mélangé de Synechocystis et des deux levures S. cerevisiae et U. maydis à l’aide de trois méthodes différentes est décrite. Pour le mélange, les DO₇₅₀ (pour les cyanobactéries) et DO₆₀₀ (pour les hétérotrophes) des cultures uniques ont été déterminées et ajustées à DO 0,1. Des cultures simples ont été mélangées dans un rapport de 1:1:1 en utilisant la densité optique (qui est distincte du comptage des cellules, voir ci-dessus). Pour faciliter la discrimination des levures dans le cytomètre, les souches rapporteures de S. cerevisiae FY1679-O1B²⁹ génétiquement modifiées produisent constitutivement mKate2 cytoplasmique (génotype : URA3Δ/pTDH3 ::mKate2 ; souche : S. cerevisiae mKate2³⁰) et la souche AB33³¹ d’U. maydis produisent constitutivement l’eGFP (génotype : pep4Δ/pRpl40 ::egfp ; souche : U. maydis eGFP³²) ont été utilisés. Il convient de noter que la souche cyanobactérienne était équipée d’un plasmide réplicatif favorisant l’expression constitutive et forte de la version protéique fluorescente jaune mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, souche Synechocystis mVenus, similaire à³³) et en outre, présente la forte autofluorescence typique due à la présence de la machinerie photosynthétique.

Quantification microscopique à l’aide de chambres de comptage : Tous les types de cellules du mélange artificiel utilisé de trois micro-organismes peuvent être facilement discriminés au microscope (figure 2A) : Synechocystis et S. cerevisiae sont représentés par des cellules sphériques qui diffèrent toutefois considérablement par leur diamètre (Synechocystis : diamètre approximatif de 1,5 à 3 m, S. cerevisiae : diamètre approximatif de 3 à 6 m), tandis que les cellules d’U. maydis ont une morphologie allongée en forme de cigare et une longueur d’au moins 10 m (figure 2A). Ces traits morphologiques clairs permettent la quantification exacte de chaque partenaire dans le mélange. À titre d’exemple, 37, 18, 36 et 21 cellules de S. cerevisiae sont comptées dans les quatre grands carrés, respectivement (figure 2B). La valeur moyenne est de 28 cellules. Étant donné qu’un grand carré de l’hémocytomètre utilisé a une aire de 1^mm2 et que la profondeur de la chambre était de 0,02 mm, cela donne 28 cellules par 0,02 μL. Cela correspond à 1 400 cellules/μL, ce qui équivaut à 1,4 x 10⁶ cellules/mL. Les autres types de cellules ont été dénombrés, et les concentrations ont été déterminées en conséquence (figure 2C, tableau 2).

figure-results-1
Figure 2 : Quantification microscopique d’un consortium tripartite composé de Synechocystis et des levures S. cerevisiae et U. maydis. (A) Image microscopique à contraste différentiel (CID) d’un mélange combiné artificiellement des micro-organismes indiqués. Toutes les espèces se distinguent facilement par leur morphologie. Barre d’échelle : 10 μm. (B) Résultats de comptage exemplaires pour un mélange assemblé artificiellement des souches indiquées sur la base de cultures axéniques avec une DO de 0,1. Les quatre grands carrés situés sur les bords de la grille ont été analysés (marque rouge sur la figure 1D). (C) La valeur moyenne des différentes cellules comptées dans les quatre carrés a été utilisée pour calculer la concentration des cellules dans la suspension à l’aide de l’équation suivante : Valeur moyenne/(profondeur de la chambre [0,02 mm] x taille du carré compté [1 mm²] x 1 000). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Quantification à l’aide de compteurs de particules : Les compteurs de particules déterminent le nombre de particules dans une suspension en fonction de leur taille. Dans l’exemple de jeu de données, un compteur de particules avec un capillaire de 45 μm a été utilisé. Étant donné que les cellules de S. cerevisiae et d’U. maydis présentent des dimensions similaires, elles ne peuvent pas être distinguées dans le compteur de particules, tandis que les cellules plus petites de Synechocystis peuvent être clairement séparées. L’analyse des cultures uniques montre donc des pics à des positions identiques se référant à 3 à 6 μm pour les deux levures (Figure 3A). Pendant la mesure, une pression négative est appliquée, ce qui fait entrer les cellules dans le capillaire. Cela modifie brièvement la résistance électrique afin que l’appareil puisse déterminer la taille des particules en fonction de la modification. Dans la culture mixte, deux pics distincts peuvent être détectés, l’un associé aux cellules cyanobactériennes plus petites et l’autre représentant une fraction conjointe des deux espèces de levures (Figure 3B). Il est important de noter qu’en plus des pics reflétant les cellules vivantes, des pics supplémentaires ont été détectés à environ 1 μm (Figure 3), correspondant à des débris cellulaires et à des particules plus petites. Les signaux qui apparaîtraient à des diamètres plus grands que prévu peuvent être causés par des agrégations de cellules. Il est à noter que la forme des pics reflète l’homogénéité des cellules : un pic pointu montre des cellules très homogènes, ce qui est peu probable pour une co-culture. Dans une co-culture, on s’attend à ce qu’il y ait un pic très large ou même deux pics si les partenaires de la co-culture sont clairement de taille différente. Pour les cultures axéniques de champignons hétérotrophes, le pic peut être un pic de largeur moyenne.

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Figure 3 : Quantification d’un consortium tripartite composé de Synechocystis mVenus et des levures S. cerevisiae mKate2 et U. maydis eGFP à l’aide d’un compteur de particules. (A) Sortie visuelle des analyses des cultures axéniques des trois souches comme indiqué dans les graphiques (compteur de cellules avec capillaire de 45 μm). (B) Fichier de sortie visuelle exemplaire pour l’analyse du consortium tripartite artificiel dans des conditions identiques. Le compteur de particules ne permet pas de discriminer les deux espèces de levures qui sont toutes deux représentées par le deuxième pic. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Quantification par cytométrie unicellulaire : À l’aide du cytomètre en flux unicellulaire, les différentes populations cellulaires peuvent être facilement distinguées en fonction de leurs propriétés d'(auto-)fluorescence et de diffusion de la lumière. Les cellules phototrophes (Synechocystis) peuvent être différenciées des cellules hétérotrophes (U. maydis et S. cerevisiae) sur la base de l’autofluorescence rouge des pigments photosynthétiques qui est mesurée dans le canal APC-H (Figure 4A). Sur la base de cette séparation initiale des cellules phototrophes et hétérotrophes, les deux populations hétérotrophes peuvent être distinguées en fonction de leurs marqueurs fluorescents eGFP dans le canal FITC-H et mKate2 dans le canal PC5.5 (Figure 4B,C). Dans un diagramme à points montrant les propriétés de diffusion des trois populations (FSC-H et FSC-Width), les populations peuvent également être distinguées avec seulement quelques chevauchements mineurs des populations (figure 4D).

Avec cette méthode, 10 μL des échantillons dilués ont été analysés avec un débit de 10 μL/min, permettant une quantification d’environ 70 000 cellules en 1 min. Environ 60 % de ces cellules ont pu être attribuées à Synechocystis (4,23 x 10⁶ cellules/mL), tandis que les 40 % restants étaient répartis également entre U. maydis (1,35 x 10⁶ cellules/mL) et S. cerevisiae (1,36 x 10⁶ cellules/mL, figure 4E, tableau 2).

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Figure 4 : Quantification d’un consortium tripartite composé de la cyanobactérie Synechocystis mVenus et des levures U. maydis eGFP et S. cerevisiae mKate2 par cytométrie en flux unicellulaire. Exemples de tracés obtenus après mesure d’une culture mixte de Synechocystis mVenus (vert foncé), U. maydis eGFP (vert clair) et S. cerevisiae mKate2 (rouge) dans un rapport de 1/3 OD₇₅₀ / 1/3 OD₆₀₀ / 1/3 OD₆₀₀ sur un cytomètre (A) montrant un histogramme du nombre d’événements et de la fluorescence dans le canal APC-H (ex. : 638 nm, émissaire : 660/10 nm) de toutes les cellules utilisées pour différencier les cellules phototrophes et hétérotrophes en fonction de leur autofluorescence. (B) Un histogramme du nombre d’événements et de la fluorescence dans le canal FITC-H (ex. : 488 nm, ém. : 525/40 nm) de toutes les cellules hétérotrophes utilisées pour différencier les cellules eGFP d’U. maydis et de S. cerevisiae mKate2 en fonction de leurs propriétés de fluorescence verte. (C) Un histogramme du nombre d’événements et de la fluorescence dans le canal PC5.5-H (ex. : 561 nm, ém. : 710/50 nm) de toutes les cellules hétérotrophes utilisées pour différencier les cellules eGFP d’U. maydis et de S. cerevisiae mKate2 en fonction de leurs propriétés de fluorescence rouge. (D) Un diagramme à points des signaux de diffusion dans la largeur FSC sur le canal FSC-H utilisé pour identifier les populations cellulaires sans propriétés de fluorescence. E) Les statistiques de population, y compris le nombre d’événements, les pourcentages, les moyennes arithmétiques et les écarts-types (ET) des canaux de fluorescence pertinents. La quantité totale de cellules, ainsi que leur taille et leur fluorescence, ont été déterminées dans un volume de 10 μL avec un débit de 10 μL/min. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour visualiser de manière comparative le résultat des différentes méthodes de quantification, les nombres de cellules déterminés sont présentés dans les deux tableaux suivants (tableau 2 et tableau 3). Les concentrations finales de cellules déterminées à l’aide des trois méthodes décrites précédemment se situent dans une fourchette similaire pour toutes les méthodes. Le cytomètre fournit la taille d’échantillon la plus élevée, suivi du compteur de particules et de la quantification microscopique, avec une diminution d’environ un ordre de grandeur entre les méthodes.

Co-culture 1:1:1	Photomètre	Cytomètre		Compteur de particules		Chambre de comptage de microscopie
Organisme	DIAMÈTRE EXTÉRIEUR_750/600	numération cellulaire	cellules/mL	numération cellulaire	cellules/mL	numération cellulaire	cellules/mL
Saccharomyces cerevisiae mKate2	0.0333	13,618	1,36 x 10⁶	1,546*	2,58 x 10⁶*	112	1,40 x 10⁶
Ustilago maydis eGFP	0.0333	13,541	1,35 x 10⁶	1,546*	2,58 x 10⁶*	89	1,11 x 10⁶
Synechocystis sp. PCC 6803 mVénus	0.0333	42,330	4.23 x 10⁶	3,094	5,16 x 10⁶	271	3,39 x 10⁶

Tableau 2 : Comparaison des différentes méthodes de quantification : Culture mixte artificielle. Notez que U. maydis et S. cerevisiae ne peuvent pas être distingués à l’aide d’un compteur de particules (*).

Culture unique	Photomètre	Cytomètre		Compteur de particules		Chambre de comptage de microscopie
Organisme	DIAMÈTRE EXTÉRIEUR_750/600	numération cellulaire	cellules/mL	numération cellulaire	cellules/mL	numération cellulaire	cellules/mL
Saccharomyces cerevisiae mKate2	0.1	38,936	3,89 x 10⁶	1,928	3,21 x 10⁶	403	4,03 x 10⁶
Ustilago maydis eGFP	0.1	36,927	3,69 x 10⁶	2,465	4,11 x 10⁶	307	3,07 x 10⁶
Synechocystis sp. PCC 6803 mVénus	0.1	127,864	1,28 x 10⁷	8,186	1,36 x 10⁷	428	1,07 x 10⁷

Tableau 3 : Comparaison des différentes méthodes de quantification : Calibrage avec des cultures simples/axéniques.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La manipulation de micro-organismes dans des cultures axéniques uniques dans un contexte de laboratoire est établie depuis des décennies pour de nombreux modèles microbiens. Pourtant, bien que la forme de vie dominante dans la nature soit constituée de communautés microbiennes, la combinaison de deux partenaires ou plus dans un seul récipient de culture est moins établie, et les lacunes dans les connaissances et la méthodologie existantes posent des défis. Il est également plus difficile de prédire le comportement des cellules dans une communauté, car des interactions émergentes et des échanges de métabolites se produisent entre les cellules, influençant fortement le destin de la co-culture^34,35. Par conséquent, l’établissement de la co-culture n’est pas trivial, y compris au niveau de la définition du milieu de croissance, de l’identification des conditions de croissance communes, de l’échange interspécifique de métabolites / signaux traces et de la composition de la co-culture qui en résulte au fil du temps. Les progrès de ces dernières années dans l’assemblage de cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre avec des partenaires hétérotrophes permettent maintenant de déduire les premières règles et la méthodologie qui peuvent fournir une ligne directrice utile pour la conception de nouvelles paires de co-culture. Sur la base de ces connaissances, la première partie de ce protocole fournit des directives étape par étape pour l’assemblage de co-cultures contenant une cyanobactérie sécrétée de saccharose et une ou plusieurs levures.

L’un des facteurs essentiels à prendre en compte lors de la première tentative d’établissement d’une coculture entre des microbes non apparentés est la composition d’un milieu de croissance commun qui satisfait à tous les besoins en nutriments des deux espèces ou plus. En raison de l’espace limité, il n’est pas possible de fournir ici un protocole entièrement détaillé pour ce processus, qui peut également nécessiter un haut degré de personnalisation dans certains cas, mais au lieu de cela, ce qui suit décrit les considérations importantes à garder à l’esprit. Une première approche simple consiste à comparer le milieu de croissance cyanobactérien typique (p. ex., BG11 ; voir le tableau 1) avec tout milieu minimal établi composé pour l’espèce hétérotrophe d’intérêt. Compléter le milieu cyanobactérien standard avec tous les composants manquants contenus dans le milieu minimal hétérotrophe est un bon point de départ pour les essais initiaux ^8,36. Gardez à l’esprit que, parce que les milieux minimaux sont souvent complétés par une source importante de carbone organique pour la croissance hétérotrophe (par exemple, 1 % à 4 % de glucose), ils sont souvent conçus pour supporter une densité cellulaire hétérotrophe plus élevée que celle susceptible d’être obtenue lors des expériences initiales de co-culture. De même, certains composants courants du milieu peuvent également agir comme une source de carbone organique indépendamment de la photosynthèse fournie par le partenaire cyanobactérien (par exemple, le citrate), ce qui peut compliquer l’analyse ultérieure des co-cultures cyanobactéries/hétérotrophes. Par conséquent, il n’est peut-être pas nécessaire de compléter le milieu cyanobactérien minimal avec la concentration complète des éléments manquants lors de la conception d’un milieu de coculture. Par exemple, de nombreux organismes varient dans leur efficacité d’utilisation de différentes formes d’azote environnemental (par exemple, N₂, nitrate, nitrite, urée) et peuvent être complètement incapables d’utiliser certaines des sources d’azote les plus oxydées. De même, de nombreux microbes peuvent nécessiter une supplémentation en vitamines essentielles (par exemple, la vitamine_B12), en cofacteurs ou en acides aminés essentiels, car ils ne disposent pas de voies de biosynthèse complètes pour la synthèse directe de ces composés. Pour ces raisons, il peut être plus pratique de commencer par simplement « fusionner » le milieu minimal établi du partenaire cyanobactérien (p. ex., BG11) avec un milieu minimal bien défini de l’hétérotrophe (p. ex., synthétique défini [SD]). Des cycles ultérieurs d’élimination/réduction répétitive des composants superflus peuvent être utilisés pour optimiser le milieu et réduire l’abondance de tout composé pouvant inhiber la croissance de l’un des partenaires. Un point de départ utile est de tamponner le milieu à un pH neutre ou légèrement basique, car ces conditions ont tendance à être favorisées par la plupart des espèces modèles de cyanobactéries.

À ce stade, il est souvent utile d’effectuer des tests préliminaires de croissance de l’hétérotrophe soutenu dans le nouveau milieu de co-culture lorsqu’un excès de saccharose est fourni. Bien sûr, lors de la sélection d’un hétérotrophe potentiel, il est important d’en choisir un qui est capable de cataboliser la ou les sources primaires de carbone organique qui seront fournies par le partenaire cyanobactérien. Il est utile de noter ici que le saccharose, en tant que glucide dominant fourni dans de nombreuses cultures cyanobactériennes/hétérotrophes modifiées⁴, n’est pas un glucide qui est aussi universellement utilisé par les microbes hétérotrophes que le glucose : des transporteurs de saccharose dédiés doivent être codés par les espèces hétérotrophes ou des invertases extracellulaires peuvent être nécessaires pour convertir le saccharose en fructose et en glucose qui sont souvent reconnus par des transporteurs de plus haute affinité⁸. Une observation importante fréquemment rapportée par plusieurs laboratoires de recherche sur les communautés microbiennes mixtes est que des synergies et des antagonismes d’ordre supérieur émergent entre les partenaires phototrophes et hétérotrophes ^4,8,13. Par exemple, d’autres métabolites naturellement sécrétés (p. ex., acides organiques, formes réduites d’azote) ou cofacteurs (p. ex., sidérophores) peuvent permettre des taux de croissance plus élevés de l’un ou des deux partenaires lorsqu’ils sont cultivés dans le même milieu par rapport aux témoins axéniques. À l’inverse, il a été rapporté que des sous-produits métaboliques potentiellement nocifs, tels que l’hyperoxygénation du milieu par séparation photosynthétique de l’eau, provoquent une inhibition interspécifique de la croissance chez l’un ou les deux partenaires⁸. Par conséquent, les contrôles axéniques peuvent fournir un point de référence utile, mais les performances de co-culture peuvent différer des attentes en raison de ces propriétés émergentes.

En fonction du partenaire hétérotrophe et de la capacité de S. elongatus à excréter du saccharose (en fonction du niveau d’induction et de la concentration utilisée de l’IPTG), différents ratios des deux organismes doivent être testés. Le succès des cultures dépend principalement de la capacité de S. elongatus à maintenir la croissance du partenaire hétérotrophe (c’est-à-dire qu’il peut produire suffisamment de source de carbone). Bien que la prolifération de la souche hétérotrophe soit généralement limitée par le manque de carbone organique fourni dans la composition du milieu de coculture, les cyanobactéries peuvent dépasser celles de la souche hétérotrophe, ce qui peut entraîner des interactions inhibitrices émergentes (p. ex., conditions hyperoxiques ^8,13). Lorsque l’on tente initialement de déterminer des rapports appropriés de densité cellulaire pour la cyanobactérie : levure, une bonne règle approximative est que le partenaire cyanobactérien peut supporter un volume cellulaire égal des cellules hétérotrophes qui l’accompagnent. Étant donné que les levures eucaryotes ont tendance à avoir des volumes cellulaires considérablement plus importants que les cyanobactéries modèles sécrétant du saccharose, cela peut probablement signifier que la densité des cellules cyanobactériennes sera considérablement plus élevée (p. ex., 50 à 100 fois pour S. cerevisiae) à l’état d’équilibre. Par conséquent, un bon point de départ lors de la mise en place d’une nouvelle co-culture avec les conditions de laboratoire et d’espèce spécifiques au chercheur serait de calculer le volume cellulaire moyen de la cyanobactérie et de la levure (sur la base des valeurs publiées ; par exemple, voir B10NUMB3R5³⁷) pour estimer le rapport volumétrique. Les flacons initiaux peuvent être ensemencés avec ce rapport de cellules. Pour explorer l’espace de solution, le chercheur peut souhaiter maintenir la concentration de cyanobactéries constante (p. ex., DO₇₅₀= 0,3) tout en faisant varier la concentration de cellules de levure à la hausse ou à la baisse d’environ un ordre de grandeur par paliers en fonction du débit autorisé par l’espace de culture phototrophe disponible du chercheur. Bien sûr, cette « règle empirique » volumétrique dépend de la vitesse à laquelle le partenaire phototrophe est capable de sécréter des photosynthétiques organiques (par exemple, le saccharose) qui peuvent être utilisés par le partenaire hétérotrophe. Une fois que les conditions de coculture ont été établies, un suivi minutieux de la performance de croissance des deux partenaires au fil du temps fournira des données précieuses sur les ratios d’espèces idéaux, surtout si les cocultures précoces peuvent être maintenues pendant des jours ou des semaines, permettant ainsi au chercheur d’identifier le rapport à l’état d’équilibre atteint vers la fin d’une coculture. Cette information peut être utilisée lors de la sélection de la densité d’inoculation initiale pour chaque espèce partenaire dans les expériences ultérieures afin d’aider la culture à atteindre plus rapidement le rapport idéal d’espèces autodéterminé.

Dans la deuxième partie du protocole, des instructions détaillées pour l’analyse de la co-culture sont fournies. Une quantification fiable des co-cultures est essentielle à leur mise en œuvre réussie : la croissance (ou au moins l’activité métabolique) du partenaire phototrope sécrétant du carbone est essentielle pour soutenir les hétérotrophes. Bien que le rapport cyanobactéries/hétérotrophes utilisé pour inoculer la culture ne soit pas toujours critique à optimiser, car les co-cultures à plus long terme ont tendance à converger vers des proportions stables, il peut être important d’intégrer des méthodes pour contrôler la croissance effrénée de l’un ou l’autre des partenaires par dilution de la culture ou encapsulation d’une ou plusieurs espèces 36,38,39,40. Comme nous l’avons mentionné ci-dessus, les sous-produits du partenaire cyanobactérien peuvent être inhibiteurs de l’hétérotrophe à des concentrations élevées (p. ex., O₂), et certains produits du métabolisme hétérotrophe peuvent également nuire à la santé des cyanobactéries. La plupart des cocultures publiées utilisent des hétérotrophes qui ont un taux de croissance plus rapide que la plupart des espèces cyanobactériennes modèles ; Par conséquent, le taux de croissance hétérotrophe tend à être limité par l’apport de carbone organique produit par la cyanobactérie. Néanmoins, la détermination de la dynamique de l’abondance des espèces au fil du temps est une valeur essentielle pour élucider les échecs de stabilité et optimiser les co-cultures robustes en culture à long terme.

Des protocoles de quantification à l’aide de chambres de comptage, de compteurs de particules et de cytométrie en flux sur cellule unique sont fournis. Toutes les techniques sont des outils précieux pour la caractérisation des co-cultures, mais avec des conditions préalables, des avantages et des limites différents. Les chambres de comptage sont très largement applicables pour la quantification de la co-culture, à condition que tous les partenaires de la culture puissent être distingués visuellement par leurs formes cellulaires ou d’autres propriétés. Le grand avantage est le prix bas de cet appareil, de sorte qu’il est pratiquement réalisable pour tous les laboratoires. Outre les informations sur la composition et le rapport de co-culture des différents partenaires, il est possible de se faire une idée de la morphologie et de la valeur adaptative de la cellule, et de détecter les contaminants potentiels. Cependant, l’application de la chambre de comptage prend également beaucoup de temps, s’accompagne d’une charge de travail élevée et ne peut prendre en charge qu’un faible débit.

Les compteurs de particules et la cytométrie en flux à cellule unique offrent tous deux les énormes avantages d’un débit élevé et d’une manipulation pratique et rapide. Alors que le compteur de cellules repose sur des différences claires dans la taille des cellules des partenaires de la co-culture, la cytométrie unicellulaire peut également discriminer les marqueurs de fluorescence, ce qui permet de quantifier les co-cultures avec plus de deux membres de la même taille ou même deux mutants différents du même organisme sur la base de marqueurs fluorescents différents. Dans l’exemple fourni d’un assemblage artificiel de Synechocystis avec S. cerevisiae et U. maydis, les rapporteurs de fluorescence intracellulaires mKate2 et eGFP ont été utilisés pour distinguer les deux levures. Les mêmes rapporteurs fluorescents pourraient également être utilisés pour distinguer deux souches génétiquement modifiées du même organisme (par exemple S. cerevisiae) qui ne pourraient pas être séparées sur la seule base de leurs propriétés de diffusion de la lumière. Des stratégies similaires ont été mises en œuvre pour suivre les consortiums de bactéries synthétiques⁴¹. En fonction du type de cellule, du nombre de partenaires dans un consortium et de leur gamme potentielle d’autofluorescence, la sélection des marqueurs fluorescents nécessite une attention particulière pour éviter le chevauchement des qualités spectrales, en particulier compte tenu des propriétés d’autofluorescence des cyanobactéries. ⁴²

Nous préconisons ici comment adhérer aux principes directeurs de FAIR en termes de stockage, de gestion et de partage des données scientifiques. FAIR est un acronyme qui signifie Findable, Accessible, Interoperable, and Reusable⁴³. À mesure que ces principes sont de plus en plus acceptés, ils promettent de transformer le paysage de la recherche biologique, en favorisant une approche plus ouverte, collaborative et efficace de la gestion et de l’utilisation des données. Bien que les éléments essentiels de l’accessibilité puissent être assurés par le dépôt de données dans un contexte de recherche annoté (ARC)⁴⁴, il est important de permettre la reproduction des étapes de traitement des données à l’aide d’un logiciel en libre accès. Les fichiers FCS bruts stockent à la fois des données et des métadonnées (informations sur les lasers et les détecteurs, y compris les longueurs d’onde, les filtres, etc.) sur les expériences de cytométrie en flux⁴⁵. Ils peuvent être chargés et lus en dehors d’un logiciel propriétaire qui permet une analyse sophistiquée des données, par exemple, un certain nombre de packages sont disponibles pour travailler avec des données brutes dans l’environnement Python. Le package développé montre comment charger, lire et visualiser des fichiers .fcs bruts contenant des données de cytométrie en dehors du logiciel propriétaire à l’aide de l’un des nombreux packages disponibles dans Python²³. L’utilisation de logiciels ouverts tels que décrits ci-dessus élimine le besoin de frais de licence coûteux associés aux logiciels propriétaires, offre un contrôle total sur le traitement des données (par exemple, la transformation, la compensation, le gating) et permet en outre l’intégration de nombreux outils en un seul endroit.

Un avantage supplémentaire précieux de l’utilisation de la cytométrie unicellulaire en conjonction avec un trieur de cellules est la possibilité de collecter également des cellules d’un type distinct par FACS. Cela peut être extrêmement précieux pour l’application de technologies -omiques afin d’obtenir des informations détaillées sur l’interaction entre les espèces au sein de la co-culture, comme RNASeq ou la métabolomique. L’inconvénient évident de ces appareils est leur prix élevé, de sorte que l’abordabilité et la disponibilité de ces machines peuvent être une limitation apparente dans certains laboratoires.

Il est intéressant de noter qu’une comparaison directe des méthodes de quantification présentées par les trois partenaires d’un consortium a révélé une très bonne concordance entre les différentes techniques, indiquant que le mélange qui a été assemblé sur la base des mesures de DO est quantifié de manière fiable par toutes les méthodes décrites. Il est intéressant de noter que le nombre total de cyanobactéries était environ 3 à 4 fois plus élevé que le nombre des deux espèces de levures, un phénomène probablement dû à la taille plus petite de leurs cellules. Cette observation est conforme à la connaissance commune selon laquelle les DO ne fournissent pas d’informations sur le nombre réel de cellules sans étalonnage⁴⁶. Les levures ont cependant montré des comptages à un niveau comparable (tableau 2 et tableau 3). De plus, la comparaison avec la quantification des cultures uniques démontre que les trois méthodes sont des outils fiables pour discriminer les types de cellules, à l’exception du compteur de particules qui n’a pas séparé les deux espèces de levures.

Essentiellement, les applications de cytométrie unicellulaire sont clairement l’outil le plus puissant pour surveiller la composition des co-cultures, permettant de compter 1 000 à 10 000 cellules par seconde. Cela est particulièrement vrai si le nombre de partenaires dépasse les deux ou si les partenaires sont de forme et/ou de diamètre similaires. Notamment, il existe de nombreuses alternatives qui permettent le suivi des co-cultures. La croissance de microbes marqués par fluorescence dans les cocultures peut, par exemple, être suivie en continu par fluorimétrie ou microbioréacteurs⁴⁷. Cependant, celles-ci se limitent souvent à une co-culture de deux partenaires et nécessitent une conception expérimentale minutieuse, par exemple dans le choix des marqueurs de fluorescence. Le séquençage d’amplicons (séquençage de l’ARNr 16S) et d’autres techniques de séquençage de nouvelle génération, en combinaison avec une bio-informatique sophistiquée, constituent une autre option pour la caractérisation des communautés synthétiques 48,49,50. Ces techniques sont adaptées aux approches à haut débit et peuvent traiter les interactions établies dans les cultures à long terme, les questions évolutives ou le suivi des mutations avec plusieurs partenaires microbiens.

Dans l’ensemble, les cocultures microbiennes simplistes conçues de manière rationnelle fournissent une puissante approche « ascendante » pour interroger la dynamique inter-espèces qui peut être plus difficile à approcher au sein des communautés multi-espèces qui dominent le monde naturel 51,52,53. Nous présentons ici un protocole simplifié qui peut être facilement adapté par la communauté scientifique pour l’établissement et l’analyse de nouvelles paires de cyanobactéries et de partenaires hétérotrophes. Il est évident qu’il reste beaucoup de recherches à faire pour tirer parti des connaissances fondamentales potentielles qui peuvent être obtenues grâce à des cocultures microbiennes artificielles et pour déterminer si des consortiums microbiens synthétiques peuvent correspondre au potentiel qui leur est souvent attribué dans la littérature pour des applications biotechnologiques.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) - SFB1535 - Projet ID 458090666 (projet B03 à KS, AM et IA), et Major Research Instrumentation INST 208/808-1. DCD est actuellement en visite à HHU Düsseldorf en tant que Mercator Fellow de l’SFB1535. Un soutien supplémentaire à l’EJK a été fourni par les prix #1845463 et #2334680 de la National Science Foundation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10x Objectif Ph1	Carl Zeiss AG	46 04 01-9904
525/40 nm Filtre passe-bande	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0051	Filtre FITC (en laser 488 nm)
Filtre passe-bande 660/10 nm	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0055	Canal APC (en laser 638 nm)
Filtre passe-bande 710/50 nm	Beckman Coulter, Inc.	B71092	PC5.5 canal (en laser 561 nm)
Accuvettes pour Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	A35473	Gobelets d’échantillons avec couvercles
Tube d’ouverture 30 &mu ; M pour Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	C92760
Autoclave	Lab Associates	EQM-ARBP	pour la stérilisation du matériel
Flacons à chicanes ROTILABO® ;, Col droit, 250 ml	Carl Roth GmbH + Co. KG	LY95.1
BG11 / CoYBG11 composants	différents fournisseurs		voir tableau 1 ;
Filtre stérile sur flacon	Sigmaaldrich	Z222593	aux milieux stériles si vous ne souhaitez pas utiliser l’autoclave
Capillaire 45 & micro ; m	Omni Life Science	OLS 5651738
CASY Cell Counter Modèle TTC	Schaerfe Systems
CASY cups	Omni Life Science	OLS 5651794
CASYclean	Omni Life Science	OLS 5651786	Solution de nettoyage
CASYton	Solution Omni Life Science	OLS 5651808	Isotonic solution ;
Tubes à centrifuger (50 mL)	Sigmaaldrich	CLS430828
CO₂	BOC	270182-L	pour l’approvisionnement en cultures axéniques de cyanobactéries
CONTRAD® ; 70	Beckman Coulter, Inc.	81911	Solution de nettoyage en profondeur
Verre de couverture 20 & times ; 26 x 0,4 mm	VWR International GmbH	631-1190	Verre de protection pour chambre de comptage
Cuvettes	Sarstedt ;	67.742
Cyanobactéries BG-11 Solution d’eau douce	Merck KGaA	C3061
Logiciel CytExpert v. 2.6	Beckman Coulter, Inc.		Logiciel d’application de cytomètre CytoFLEX
Sheath Fluid	Beckman Coulter, Inc.	B51503	à fluide Sheat
CytoFLEX S	Beckman Coulter, Inc.
Nettoyeur BE51180 DxH pour Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	628022	Solution de nettoyage
Centrifugeuse à tube Eppendorf (petite)	Labstac	CEN16-15	pour centrifuger moins de 2 ml de culture
Éthanol	Carl Roth GmbH + Co. KG	K928.1
Tubes FACS	Beckman Coulter, Inc.	2523749	tubes pour le mode semi-automatique
Agent de nettoyage FlowClean, 500ml	Beckman Coulter, Inc.	C48093	Solution de nettoyage quotidien
Cylindres gradués	Sigmaaldrich	Z131121	pour la préparation des milieux
HEPPSO	Merck KGaA	R426725
Infors MultiTron photoincubateur	Infors AG		lumière LED blanche
IPTG	Merck KGaA	I6758	Préparer les aliquotes, stocker à -20° ; C, décongeler et garder sur la glace ;
Isoton II pour Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	8448011	Solution isotonique
Kaluza c. 2.2	Beckman Coulter, Inc.	B16406	Logiciel d’analyse de données de cytométrie
KimWipes	VWR International GmbH	115-2221	Tissus non pelucheux
KOH	Merck KGaA	221473
KPO₃	Noah Chemicals	7790-53-6
Béchers de mesure	VWR	213-3747
Micro plaque de test, 96 puits, couvercle à enfiler, fond plat, PS, transparent	SARSTEDT AG & Co. KG	82.1581.001
Base de microscope	Carl Zeiss AG	47 09 18-9902/16
Tête de microsope	Carl Zeiss AG	47 30 14
Système de purification d’eau Milli-Q	Merck Millipore	C85358
Multitisseur 4e compteur de particules	Beckman Coulter, Inc.	B23005	Alternative au compteur de cellules CASY
Neubauer amélioré, profondeur 0,02 mm	Assistent Allemagne		Chambre de comptage
Neubauer améliorée, profondeur 0,1 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	640010	Chambre de comptage
Prêt à l’emploi Fluorosphères QC	quotidiennes Beckman Coulter, Inc.	C65719	Référence pour les
bouteilles QC SCHOTT	Dutscher	90347	pour le stockage
Specord® ; 200 Plus Spectrophotomètre	Analytique Jena GmbH		OD600/750
Saccharose	Merck KGaA	84100
Centrifugeuse de table (grande)	Labstac	CEN18-06R	collecter la biomasse de culture
Levure Base d’azote, sans acides aminés, sans sulfate d’ammonium	Thermo Fisher Scientific Inc.

capillaire Cytomètre 11743014

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Roell, G. W., Zha, J., Carr, R. R., Koffas, M. A., Fong, S. S., Tang, Y. J. Engineering microbial consortia by division of labor. Microb Cell Factories. 18 (1), 35(2019).
Grandel, N. E., Reyes Gamas, K., Bennett, M. R. Control of synthetic microbial consortia in time, space, and composition. Trends Microbiol. 29 (12), 1095-1105 (2021).
Weiland-Bräuer, N. Friends or Foes-Microbial Interactions in Nature. Biology. 10 (6), (2021).
Santos-Merino, M., Yun, L., Ducat, D. C. Cyanobacteria as cell factories for the photosynthetic production of sucrose. Front Microbiol. 14, 1126032(2023).
Klähn, S., Hagemann, M. Compatible solute biosynthesis in cyanobacteria. Environ Microbiol. 13 (3), 551-562 (2011).
Dean, P. N., Bagwell, C. B., Lindmo, T., Murphy, R. F., Salzman, G. C. Introduction to flow cytometry data file standard. Cytometry. 11 (3), 321-322 (1990).
Rippka, R., Stanier, R. Y., Deruelles, J., Herdman, M., Waterbury, J. B. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).
Hays, S. G., Yan, L. L. W., Silver, P. A., Ducat, D. C. Synthetic photosynthetic consortia define interactions leading to robustness and photoproduction. J Biol Eng. 11, 4(2017).
Ducat, D. C., Avelar-Rivas, J. A., Way, J. C., Silver, P. A. Rerouting carbon flux to enhance photosynthetic productivity. Appl Environ Microbiol. 78 (8), 2660-2668 (2012).
Thiel, K., et al. Redirecting photosynthetic electron flux in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 by the deletion of flavodiiron protein Flv3. Microb Cell Factories. 18 (1), 189(2019).
Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Appl Microbiol Biotechnol. 100 (18), 7865-7875 (2016).
Feng, J., et al. Generation and comprehensive analysis of Synechococcus elongatus-Aspergillus nidulans co-culture system for polyketide production. Biotechnol Biofuels Bioprod. 16 (1), 32(2023).
Li, T., et al. Mimicking lichens: incorporation of yeast strains together with sucrose-secreting cyanobacteria improves survival, growth, ROS removal, and lipid production in a stable mutualistic co-culture production platform. Biotechnol Biofuels. 10, 55(2017).
JoVE Science Education Database. Microbiology. Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
Yeast Extract-Peptone-Dextrose (YEPD). (9), Cold Spring Harb Protoc. (2015).
Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. J Clin Lab Anal. 34 (1), e23024(2020).
Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eu J Immunol. 47 (10), 1584-1797 (2017).
Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). Eu J Immunol. 51 (12), 2708-3145 (2021).
Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
JoVE Science Education Database. Flow Cytometry. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. Current trends in flow cytometry automated data analysis software. Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).
Yurtsev, E., Friedman, J., Gore, J. FlowCytometryTools: Version 0.4.5. , Available from: https://pypi.org/project/FlowCytometryTools/ (2021).
White, S., et al. FlowKit: A Python Toolkit for Integrated Manual and Automated Cytometry Analysis Workflows. Front Immunol. 12, 768541(2021).
O'Neill, K., Aghaeepour, N., Spidlen, J., Brinkman, R. Flow cytometry bioinformatics. PLoS Comput Biol. 9 (12), e1003365(2013).
Klement, T., Milker, S., Jäger, G., Grande, P. M., Domínguez de María, P., Büchs, P. Biomass pretreatment affects Ustilago maydis in producing itaconic acid. Microb Cell Factories. 11, 43(2012).
Koschwanez, J. H., Foster, K. R., Murray, A. W. Sucrose utilization in budding yeast as a model for the origin of undifferentiated multicellularity. PLoS Biol. 9 (8), e1001122(2011).
Koschwanez, J. H., Foster, K. R., Murray, A. W. Improved use of a public good selects for the evolution of undifferentiated multicellularity. ELife. 2, e00367(2013).
Winston, F., Dollard, C., Ricupero-Hovasse, S. L. Construction of a set of convenient Saccharomyces cerevisiae strains that are isogenic to S288C. Yeast. 11 (1), 53-55 (1995).
Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 42 (4), 1047-1063 (2001).
Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173 (1 Spec), 33-38 (1996).
Behle, A., Saake, P., Germann, A. T., Dienst, D., Axmann, I. M. Comparative dose-response analysis of inducible promoters in cyanobacteria. ACS Synth Biol. 9 (4), 843-855 (2020).
Lindemann, S. R., et al. Engineering microbial consortia for controllable outputs. ISME J. 10 (9), 2077-2084 (2016).
Duncker, K. E., Holmes, Z. A., You, L. Engineered microbial consortia: strategies and applications. Microb Cell Factories. 20 (1), 211(2021).
Fedeson, D. T., Saake, P., Calero, P., Nikel, P. I., Ducat, D. C. Biotransformation of 2,4-dinitrotoluene in a phototrophic co-culture of engineered Synechococcus elongatus and Pseudomonas putida. Microb Biotechnol. 13 (4), 997-1011 (2020).
Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers-the database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Res. 38 (suppl_1), D750-D753 (2009).
Tóth, G. S., et al. Photosynthetically produced sucrose by immobilized Synechocystis sp. PCC 6803 drives biotransformation in E. coli. Biotechnol Biofuels Bioprod. 15 (1), 146(2022).
Weiss, T. L., Young, E. J., Ducat, D. C. A synthetic, light-driven consortium of cyanobacteria and heterotrophic bacteria enables stable polyhydroxybutyrate production. Metabol Eng. 44, 236-245 (2017).
Zhang, L., Chen, L., Diao, J., Song, X., Shi, M., Zhang, W. Construction and analysis of an artificial consortium based on the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973 to produce the platform chemical 3-hydroxypropionic acid from CO2. Biotechnol Biofuels. 13, 82(2020).
Jorrin, B., et al. Stable, fluorescent markers for tracking synthetic communities and assembly dynamics. Microbiome. 12 (1), 81(2024).
Yokoo, R., et al. Live-cell imaging of cyanobacteria. Photosynth Res. 126, 36-46 (2015).
Wilkinson, M. D., et al. The FAIR guiding principles for scientific data management and stewardship. Sci Data. 3, 160018(2016).
Venn, B., et al. Fostering the democratization of research data by using the Annotated Research Context (ARC) as practical implementation. E-Science-Tage 2021: Share Your Research Data. , (2021).
Ortolani, C. The Cytometric File. Flow Cytometry Today: Everything You Need to Know about Flow Cytometry. , Springer. Cham. (2022).
Beal, J., et al. Robust estimation of bacterial cell count from optical density. Communi Biol. 3 (1), 512(2020).
Funke, M., et al. Microfluidic biolector-microfluidic bioprocess control in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 107 (3), 497-505 (2010).
Zhang, P., Spaepen, S., Bai, Y., Hacquard, S., Garrido-Oter, R. Rbec: a tool for analysis of amplicon sequencing data from synthetic microbial communities. ISME Commun. 1 (1), 73(2021).
Ezzamouri, B., Shoaie, S., Ledesma-Amaro, R. Synergies of systems biology and synthetic biology in human microbiome studies. Front Microbiol. 12, 681982(2021).
Zaramela, L. S., Tjuanta, M., Moyne, O., Neal, M., Zengler, K. synDNA-a synthetic DNA spike-in method for absolute quantification of shotgun metagenomic sequencing. mSystems. 7 (6), e0044722(2022).
Bittihn, P., Din, M. O., Tsimring, L. S., Hasty, J. Rational engineering of synthetic microbial systems: from single cells to consortia. Curr Opin Microbiol. 45, 92-99 (2018).
San León, D., Nogales, J. Toward merging bottom-up and top-down model-based designing of synthetic microbial communities. Curr Opin Microbiol. 69, 102169(2022).
Fedeson, D. T., Ducat, D. C. Symbiotic Interactions of Phototrophic Microbes: Engineering Synthetic Consortia for Biotechnology. Role of Microbial Communities for Sustainability. , Springer. Singapore. (2021).

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Assemblage de co culture cyanobact ries s cr tant du saccharose microbes phototrophes consortiums microbiens cytom trie en flux comptage cellulaire marquage fluorescent comptage de particules quantification par microscopie

Assemblage et quantification de co-cultures combinant des levures hétérotrophes avec des cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre

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