Identification et quantification des métabolites dérangés chez les patients gravement malades à l’aide de la métabolomique basée sur la RMN

Summary

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est utilisée pour identifier la dérégulation des métabolites chez les patients atteints de diverses maladies. Cette technique permet de quantifier les métabolites dérangés, démêlant ainsi les informations physiopathologiques. Ici, nous décrivons la procédure étape par étape de l’approche basée sur la RMN pour la caractérisation métabolique des patients.

Abstract

La métabolomique est en train de devenir une approche importante pour refléter la réponse de l’individu aux conditions physiopathologiques. La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) a évolué en tant qu’outil permettant d’identifier les dérégulations métaboliques chez les patients gravement malades atteints de maladies telles que le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), la pancréatite aiguë (SAP), l’insuffisance rénale aiguë (IRA) et la septicémie. Les données spectrales de l’échantillon de sérum du groupe d’étude et du groupe témoin sont enregistrées à l’aide d’un spectromètre RMN de 800 MHz et traitées à l’aide d’outils de traitement et d’analyse RMN. De plus, une analyse statistique rigoureuse, telle que des tests univariés et multivariés, est effectuée pour identifier les métabolites significatifs, qui sont ensuite identifiés et quantifiés avec précision à l’aide d’un logiciel de quantification des métabolites RMN. De plus, l’analyse des voies met en évidence les cycles biochimiques perturbés qui entraînent la gravité de la maladie. Grâce à cette approche globale, les chercheurs visent à mieux comprendre les altérations métaboliques associées à ces maladies graves, ce qui pourrait ouvrir la voie à une meilleure compréhension de la maladie et à de meilleures stratégies de diagnostic et de traitement.

Introduction

Malgré les efforts continus déployés dans le monde entier pour fournir un diagnostic efficace des maladies, la thérapie ciblée n’a toujours pas atteint son véritable potentiel. Diverses approches, telles que la transcriptomique, la protéomique, etc., ont permis d’identifier plusieurs biomarqueurs, mais ceux-ci n’ont pas eu suffisamment d’utilité clinique en raison du manque de sensibilité et de spécificité ^1,2. La thérapie ciblée est un grand défi dans certaines maladies multifactorielles, conduisant finalement à une mortalité plus élevée. Il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme sous-jacent et la physiopathologie de maladies complexes existant avec une grande hétérogénéité. Ainsi, à cet égard, l’évolution de la métabolomique a révolutionné le développement thérapeutique, ce qui pourrait éventuellement aider à adapter les schémas thérapeutiques à diverses maladies graves telles que le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), la septicémie et la pancréatite aiguë sévère (PAS).

La métabolomique est une approche globale visant à identifier et à quantifier les molécules de faible poids moléculaire (métabolites tels que les acides aminés, les lipides, les peptides, les acides organiques et les vitamines) dans divers biofluides, cellules ou extraits de tissus. Ces métabolites, qui pèsent généralement moins de 1500 Da, jouent un rôle actif dans les processus biochimiques, reflétant un contour progressif de l’état biologique de l’organisme. Ils comprennent des substrats pour des processus enzymatiques clés, des intermédiaires dans les voies biologiques et des sous-produits du métabolisme cellulaire. Par conséquent, la métabolomique capture une empreinte détaillée des influences alimentaires, des interactions médicamenteuses et des états pathologiques. Les modifications métabolitiques sont des indicateurs très sensibles du métabolisme et des voies biologiques, permettant des corrélations avec les expressions phénotypiques et les anomalies physiopathologiques qui en résultent ^3,4. Les variations initiales des métabolites peuvent servir d’indicateurs précoces de la gravité de la maladie, tandis que les changements temporels peuvent aider à surveiller l’efficacité du traitement, la progression de la maladie et les résultats cliniques ^5,6,7. La métabolomique améliore ainsi les essais cliniques et diverses autres approches omiques en redéfinissant les maladies par le biais de paramètres cliniques, physiologiques et biochimiques 8,9,10,11,12,13. Les capacités analytiques de la métabolomique sont utilisées pour surveiller et déterminer la sensibilité aux maladies grâce à des concentrations de métabolites modifiées^14,15.

Dans ce contexte, la spectrométrie de masse (MS) et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) sont devenues les principales plateformes analytiques pour le profilage des métabolites dans les échantillons biologiques. Ces méthodes sont utilisées pour l’identification et la quantification ciblées et non ciblées des métabolites 16,17,18. Chaque plateforme a ses avantages et ses limites, mais la nature non destructive de la RMN la rend préférable dans diverses études in vivo et pour la caractérisation de la structure de composés inconnus, en particulier dans les premières étapes de la recherche métabolomique. Le fractionnement, la dérivation et l’ionisation de l’échantillon requis avant la spectrométrie de masse peuvent introduire des biais et souvent entraîner une perte d’échantillon, affectant les caractéristiques dynamiques que la spectroscopie RMN peut capturer avec une préparation minimale ou nulle de l’échantillon. La principale limitation de la RMN est sa sensibilité plus faible par rapport à la MS, qui offre une limite de détection plus basse, ce qui rend difficile la détection de métabolites moins abondants¹⁹. Cependant, des progrès tels que les aimants supraconducteurs à haute résolution, les sondes RMN refroidies par cryogénie et les techniques qui améliorent la sensibilité ont atténué cette limitation 20,21,22. En tant qu’approche complémentaire à la génomique et à la protéomique, le profilage métabolique à l’aide de la spectroscopie RMN gagne du terrain en tant que technique privilégiée 23,24,25. La préparation minimale des échantillons, la reproductibilité et la répétabilité de la RMN en font un outil précieux pour capturer les caractéristiques dynamiques inhérentes aux métabolites malgré ses problèmes de sensibilité²⁶.

Plusieurs groupes de recherche ont effectué avec succès la métabolomique, mettant en évidence le profil métabolique dérégulé des patients pour diverses maladies²⁷ telles que le SDRA^{28, 29, 30, 31, 32, 33}, la pneumonie³⁴, la septicémie⁷, les calculs biliaires³⁵ et la pancréatite³⁶. Des études métabolomiques basées sur la RMN portant sur des patients gravement malades ont joué un rôle déterminant dans le suivi de la progression du syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS) au syndrome de dysfonctionnement multiviscéral (MODS), qui est l’une des principales causes de mortalité et de morbidité en unité de soins intensifs (USI)³⁷. Dans une étude menée par Stringer et al., des échantillons de plasma ont été utilisés pour examiner les altérations métaboliques chez les patients atteints de lésions pulmonaires aiguës induites par la septicémie (ALI) par rapport aux patients témoins³⁸. Les principaux métabolites trouvés élevés dans cette étude pilote reflétaient les voies métaboliques impliquées et leur association avec les scores cliniques. Cette recherche a été étendue à la métabolomique sérique afin de différencier le sepsis des premiers stades des mécanismes de lésions pulmonaires dans le SDRA³². De plus, une autre étude sur le SDRA a identifié de puissants biomarqueurs sériques qui différencient nettement les lésions pulmonaires aiguës/SDRA et les témoins sains, offrant des informations sur les changements métaboliques systémiques correspondant à l’apparition aiguë des lésions pulmonaires^39,40.

La spectroscopie RMN est une technique analytique automatisée à haut débit qui fournit des informations robustes et impartiales sur l’empreinte métabolique, révélant la physiopathologie sous-jacente³⁸. L’application clinique et l’interprétation biologique des données RMN dépendent de l’obtention de spectres de haute qualité contenant des informations riches. Par conséquent, il est crucial d’assurer une collecte, un traitement et une analyse des données précis, uniformes et bien formulés. Par conséquent, l’objectif de cette étude est de tirer parti des étapes essentielles de la métabolomique basée sur la RMN pour l’identification et la quantification des métabolites. Cette étude met en évidence les étapes clés du protocole requis pour l’étude métabolomique clinique (Figure 1), telles que la sélection des échantillons appropriés, la collecte et le stockage, le traitement et la préparation des échantillons, l’acquisition et l’analyse des données, l’identification et la quantification du métabolite d’intérêt, et éventuellement, l’interprétation des résultats dans un contexte clinique pour en tirer des informations pertinentes. Chacune de ces étapes est essentielle pour tirer parti de la spectroscopie RMN en métabolomique afin de découvrir des informations biologiques et cliniques importantes.

Protocol

L’approbation éthique (code CEI : 2022-71-PhD-126) a été obtenue auprès de l’IEC de l’Institut postuniversitaire des sciences médicales Sanjay Gandhi (SGPGIMS), Lucknow. Des consentements écrits et éclairés ont été obtenus des patients ou de leurs proches pour réaliser l’étude et publier les données à des fins de recherche. De plus, la recherche a été menée conformément aux directives institutionnelles.

1. Conception de l’étude et autorisation éthique

1. Déterminez la taille de l’échantillon pour chaque groupe. Examinez attentivement et établissez les critères de sélection des participants. De plus, si la conception de l’étude exige l’inclusion d’échantillons humains ou animaux, obtenez l’autorisation éthique du comité d’éthique de l’établissement (CEI) approprié avant de commencer le prélèvement des échantillons.
2. Sélectionnez les patients atteints de SDRA classés comme légers, modérés et sévères, sur la base des critères diagnostiques de la définition de Berlin 2012 basée sur la pression partielle d’oxygène dans le sang artériel (PaO2) par rapport à la fraction d’oxygène inspiré (FiO2) (P/F). Les patients atteints de SDRA avec une plage P/F de 300 à 200 sont considérés comme légers, 200 à 100 comme modérés et inférieurs à 100 comme sévères³⁸. Ici, nous nous sommes concentrés sur deux groupes : les patients atteints de SDRA léger et modéré (voir tableau 1).
   REMARQUE : L’étude implique l’utilisation de sérum obtenu à partir d’échantillons de sang pour effectuer une métabolomique basée sur la RMN. Dans cette étude, les participants inclus à titre de référence avaient un âge moyen de 42 ans (± 10,9 ans), avec une répartition par sexe de 2 hommes et 6 femmes.

Catégorie	Rapport P/F
Douleur légère	300-200
Modéré	200-100
Forte douleur	100-0

Tableau 1 : Catégorisation des patients atteints de SDRA.

2. Sélection, collecte et traitement de l’échantillon

1. Effectuez l’isolement sérique en suivant les étapes décrites ci-dessous.
   1. Pour l’expérience, prélever 2 mL d’échantillons de sang dans les artères à l’aide d’une aiguille stérile dans un flacon ordinaire (sans additifs) et stérile. Laissez l’échantillon coaguler pendant 30 minutes à température ambiante. Pour cette étude, 4 patients diagnostiqués avec un SDRA léger et 4 patients atteints d’un SDRA modéré ont été sélectionnés.
   2. Centrifuger l’échantillon à 3100 x g pendant 15 min pour séparer le sérum²⁵. Transférez le sérum dans des tubes de microcentrifugation stériles, en faisant des aliquotes de plus petit volume (c’est-à-dire 400-500 μL), étiquetez-les de manière appropriée (nom du patient, n° CR, point du jour, etc.) et conservez-les à -80 °C pour une analyse future.
      REMARQUE : À ce stade, l’expérience peut être interrompue et reprise à un moment opportun.
2. Traitez l’échantillon de sérum avant les expériences RMN en suivant les étapes suivantes.
   1. Décongelez l’échantillon avant d’effectuer les expériences RMN. Mélanger 250 μL d’aliquote du sérum avec 250 μL de solution tampon de phosphate salin (contenant 100 % de D₂O, 0,9 % de NaCl, 50 mM de tampon de phosphate de sodium, pH 7,4) pour minimiser la variation du pH.
   2. Agitez le mélange pendant quelques secondes (~15 s) pour vous assurer qu’il est homogène. Enfin, transférez l’échantillon préparé dans un tube RMN propre avec un insert coaxial contenant du propionate de triméthylsilyle (TSP) à une concentration de 0,05 mM, qui sert d’étalon externe pour l’étalonnage et la quantification⁴¹.
      REMARQUE : À titre de référence, un composé inerte et non réactif qui n’interagit pas avec les analytes est utilisé. Parmi les autres composés de référence couramment utilisés, citons le tétraméthylsilane (TMS) et le triméthylsilylpropanesulfonate de sodium (DSS).

3. Expérimentation RMN

REMARQUE : L’accent est mis sur l’identification de petites molécules dans les échantillons de sérum, c’est pourquoi nous avons utilisé la séquence d’impulsions Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), qui supprime les signaux des macromolécules. Tous les échantillons de sérum de cette étude ont été enregistrés à l’aide d’un spectromètre RMN de 800 MHz équipé d’une tête de sonde inverse à bande de 5 mm TCI à triple résonance refroidie par cryogénie et d’un gradient z blindé.

1. Placez l’échantillon dans l’aimant. Écrivez la commande wrpa (mentionner le numéro de l’expérience) et appuyez sur Entrée pour configurer une expérience de protons avec le programme d’impulsions cpmg. Mentionnez le nom du patient et d’autres détails nécessaires en cliquant sur l’option Titre.
2. Verrouillez le champ magnétique en écrivant la commande Verrouiller, appuyez sur Entrée et sélectionnez l’option 90 % H₂O et 10 % D₂O plus loin. Réglez et faites correspondre la sonde manuellement à l’aide de l’ATMM pour optimiser l’efficacité des impulsions de radiofréquence et maximiser la sensibilité. Effectuez un calage dégradé 1D en cliquant sur topshim.
3. Réglez les paramètres d’acquisition suivants, y compris un retard de relaxation de 5 s, une largeur de balayage spectral de 12 parties par million (ppm) et un temps d’écho de 300 μs. Tous ces paramètres peuvent être facilement modifiés en sélectionnant l’option Paramètres d’acquisition dans le panneau supérieur.
4. Appliquez un élargissement de ligne de 0,3 Hz à l’aide d’une fonction de fenêtre exponentielle, en collectant des données en 64 000 points sur 128 balayages. Ces paramètres peuvent être modifiés de la même manière en sélectionnant l’option Paramètres d’acquisition dans le panneau supérieur. En cliquant sur Paramètres d’acquisition, une liste de spécifications apparaîtra, et les attributs mentionnés, ainsi que d’autres paramètres, pourront être modifiés lors de l’optimisation.
5. Acquérir les spectres RMN à l’aide d’outils de traitement et d’analyse RMN. Une fois les spectres finaux obtenus, écrivez les commandes apk et absn et appuyez sur Entrée pour effectuer la correction de phase et la correction de base, respectivement. Cliquez sur l’option Calibrer l’axe présente sur le panneau supérieur, puis calibrez le pic TSP à 0 ppm automatiquement ou manuellement.
6. Transférez les données acquises du système vers le poste de travail, où un traitement et une analyse ultérieurs sont effectués.
   REMARQUE : La phase expérimentale est maintenant terminée et peut être mise en pause. Le prétraitement, l’analyse et l’interprétation des données peuvent être effectués facilement.

4. Prétraitement des données

1. Effectuer le prétraitement des données à l’aide d’outils de traitement et d’analyse RMN et d’un logiciel de quantification des métabolites RMN.
   1. Parfois, seule la correction automatique ne suffit pas, et dans ce cas, une correction manuelle est également nécessaire. Pour effectuer une correction de phase manuellement, cliquez sur l’option Processus dans la barre de menu supérieure des outils de traitement et d’analyse RMN. Cliquez ensuite sur Ajuster la phase, faites glisser la souris et observez jusqu’à ce que les spectres soient corrigés en phase. Une fois cela fait, cliquez sur l’option Enregistrer et retourner (présente sous la forme d’une icône) disponible dans la même barre de menu.
   2. Pour effectuer une correction manuelle de la ligne de base (méthode Whittaker), ouvrez le fichier spectral dans le module processeur du logiciel de quantification des métabolites RMN. Sélectionnez l’option Correction de la ligne de base. Sélectionnez ensuite l’option Méthode Whittaker. Maintenant, placez les points à la base des pics dans l’ensemble du spectre (0,0 à 10 ppm, généralement dans le cas du sérum ou selon la disponibilité du métabolite dans le spectre) pour ajuster la base. Une fois que tous les fichiers spectraux ont été corrigés de base, enregistrez-les dans un seul dossier. Un traitement ultérieur, à l’aide du processeur ou du module de profilage du logiciel de quantification des métabolites RMN, peut être effectué à l’aide du même fichier enregistré dans le format spécifique.
   3. Effectuez le binning à l’aide du module profiler du même logiciel. Sélectionnez l’option Outils, puis Traitement par lots, puis Regroupement spectral.
2. Pour générer la feuille de regroupement finale à utiliser pour l’analyse statistique, sélectionnez le dossier contenant tous les fichiers spectraux corrigés de la ligne de base après avoir cliqué sur Regroupement spectral.
3. Divisez les spectres en un nombre défini de bacs de taille égale avec une largeur spectrale définie, allant de 0,01 à 0,04 ppm (peut être optimisé selon l’étude). Ce processus simplifie et organise les données spectrales, ce qui facilite une analyse plus cohérente. Spécifiez la taille du compartiment ainsi que les valeurs de ppm de début et de fin, et désignez le dossier dans lequel les feuilles de regroupement de sortie seront enregistrées.
4. Exclure les régions de décalage chimique correspondant à l’eau et au solvant TSP (4,8-5,2 et 0,0-0,7 ppm) pour éviter les interférences spectrales 42,43,44.
5. Cette feuille de calcul contient les noms des échantillons sur une ligne et les différentes valeurs de groupe ainsi que les ppm dans les autres rangées. Avant d’utiliser cette feuille pour l’analyse statistique, modifiez-la en organisant les échantillons en groupes pour l’analyse et en l’enregistrant uniquement au format CSV (délimité par des virgules).
   REMARQUE : Par exemple, lorsque nous comparons le groupe léger avec le groupe modéré de patients atteints de SDRA, nous avons organisé les données avec des étiquettes légères et modérées, ajouté un numéro de série et enregistré le fichier au format CSV.

5. Analyse statistique

REMARQUE : La feuille de compartimentage obtenue à l’étape précédente sert de fichier d’entrée pour l’analyse statistique. Dans cette étude, le module d’analyse statistique (un facteur) du logiciel d’analyse statistique métabolomique a été utilisé.

1. Avant l’analyse statistique, effectuez l’étape de normalisation à l’aide de la somme, du logarithme et de Pareto, mais elle peut varier d’une étude à l’autre⁴⁵.
2. Effectuer des analyses univariées et multivariées pour distinguer les différents groupes et déterminer la précision des métabolites identifiés.
   1. Effectuez une analyse en composantes principales (ACP), une analyse discriminante partielle des moindres carrés (PLS-DA) et une analyse discriminante orthogonale partielle des moindres carrés (OPLS-DA) pour observer la discrimination entre les groupes produisant des scores d’importance variable de projection (VIP) pour chaque métabolite responsable de la différence dans le profil métabolique.
   2. Appliquer des méthodes univariées, telles que le test t de Student et l’ANOVA, pour identifier les métabolites significatifs en fonction du critère d’avoir une valeur p inférieure à 0,05. Les deux tests donnent des diagrammes à moustaches montrant la différence de concentration relative des métabolites.
   3. Effectuer une analyse de biomarqueurs, qui permet d’obtenir une aire sous le graphique de la courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur (AUROC). La valeur AUC (aire sous la courbe) > 0,8 est considérée comme significative⁴⁶.
   4. Sélectionnez la liste finale des métabolites significatifs à l’aide des critères score VIP>1, valeur p corrigée de Bonferroni<0,05⁴⁴ et AUC > 0,8⁴⁶.
3. Identifiez les métabolites comme décrit ci-dessous.
   1. Le binning fournit des métabolites significatifs sous la forme de valeurs ppm plutôt que de noms. Identifiez les métabolites correspondant à des valeurs spécifiques en ppm à l’aide de bases de données telles que la Banque de résonance magnétique biologique (BMRB)⁴⁷et la Base de données sur le métabolome humain (HMDB).
   2. En dehors de ceux-ci, utilisez la littérature précédemment publiée^42,44 pour l’identification et la validation.
   3. Utilisez le module de profilage du logiciel de quantification des métabolites RMN pour confirmer les métabolites identifiés avec leurs valeurs ppm.

6. Quantification des métabolites à l’aide d’un logiciel de quantification des métabolites RMN

REMARQUE : Le module profileur du logiciel est largement utilisé pour quantifier les métabolites identifiés.

1. Avant de commencer la quantification, calibrez le composé de référence sélectionné pour l’étude (cuillère à café utilisée dans cette étude) à l’aide du module processeur. Cliquez sur l’option Calibrer CSI (indicateur de forme chimique). Mentionner la concentration du composé de référence (0,05 mM pour cette étude). Ensuite, faites glisser le pic du logiciel sur le pic de référence spectrale et ajustez correctement sa hauteur et sa largeur. Une fois que les pics de référence spectrale correspondent au pic du logiciel, cliquez sur Accepter.
2. Ouvrez les spectres souhaités dans le module de profilage et sélectionnez la bibliothèque de composés appropriée pour l’étude.
3. En bas de l’écran, une liste de métabolites s’affiche. Sélectionnez le métabolite d’intérêt dans cette liste. Une fois sélectionné, le ppm possible du métabolite choisi apparaîtra dans le coin supérieur des spectres.
4. Sélectionnez la valeur en ppm dans le coin supérieur et zoomez sur les spectres jusqu’à l’échelle ppm spécifique du métabolite.
5. À ce stade, deux pics apparaîtront à l’écran : l’un représentant les données enregistrées et l’autre, affiché sous forme de pointillé, représentant le pic logiciel. Alignez les deux pics. Faites glisser le pic du logiciel et ajustez sa hauteur et sa position pour qu’elles correspondent au pic présent dans l’échantillon.
6. Une fois correctement aligné, la concentration du métabolite peut être obtenue à partir de la valeur affichée sous la rubrique concentration en mM pour ce métabolite (figure 1).
7. Suivez la même procédure pour tous les métabolites et échantillons et exportez les valeurs quantifiées dans une feuille de calcul. Pour générer le fichier de sortie, cliquez sur l’option Opérations par lots dans le menu Outils . Spécifiez le dossier souhaité pour l’enregistrement du fichier de sortie.

7. Analyse des voies

REMARQUE : Les métabolites significatifs identifiés après l’analyse sont utilisés pour déterminer les principales voies influençant directement l’issue dans les groupes de maladies. Le module d’analyse des trajectoires du logiciel d’analyse statistique métabolomique et la base de données KEGG sont généralement utilisés à cette fin.

1. Entrez la liste des métabolites significatifs obtenus dans le module. Une liste contenant les noms des chemins est générée.
2. Sélectionnez les trajectoires finales en fonction d’un critère d’avoir un facteur d’impact supérieur à 0,1. Les valeurs d’impact significatives indiquent des voies liées à la maladie³⁰.
3. Analysez minutieusement les voies résultantes pour élucider la dérégulation associée à la gravité de la maladie. L’un des inconvénients de cette méthode est son inefficacité à identifier les voies dérégulées lorsque les métabolites significatifs sont inférieurs à 3.
4. Pour faire face à la même situation, le métabolite identifié et sa corrélation avec la gravité de la maladie peuvent également être déterminés en utilisant la littérature précédemment publiée. Effectuez une étude approfondie de la littérature et observez si le métabolite identifié suit également la même tendance selon vos intérêts.

Figure 1 : Étapes fondamentales de la métabolomique basée sur la RMN. La figure présente les étapes clés de la métabolomique basée sur la RMN : la collecte et la préparation d’échantillons, la spectroscopie RMN, le prétraitement des données, la réalisation d’analyses statistiques, l’identification et la quantification des métabolites et l’interprétation de la signification biologique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Results

Pour réaliser une étude métabolomique, il est essentiel de déterminer la taille de l’échantillon et les groupes spécifiques qui seront analysés. La sélection d’une taille d’échantillon adéquate est essentielle pour obtenir des résultats significatifs qui correspondent précisément à la gravité de la maladie⁴⁸. Cependant, dans ce travail particulier, nous avons utilisé une petite taille d’échantillon pour démontrer les étapes impliquées dans l’identification et la quantification des métabolites à l’aide de la métabolomique basée sur la RMN, qui était principalement destinée à la référence. Dans cette étude, nous avons examiné les différences métaboliques entre les patients aux stades léger et modéré du SDRA au jour 1 de leur admission en soins intensifs, y compris un total de 8 sujets. Conformément au protocole, les spectres RMN de tous les échantillons ont été acquis et traités, et finalement, une feuille de calcul a été créée avec les résultats du binning.

Nous avons ensuite effectué une analyse statistique rigoureuse, où les feuilles de compartimentage ont été utilisées comme fichiers d’entrée, en normalisant les données à l’aide de la somme, du logarithme et de Pareto. Nous avons réalisé l’ACP (Figure 2A) et l’OPLS-DA (Figure 2B), où la première a montré un regroupement, mais la seconde a révélé une discrimination claire entre les groupes et a mis en évidence des différences métaboliques. L’analyse statistique du test de permutation (20x) a donné des valeurs de R2Y = 0,99 et Q2 = 0,47. Par la suite, nous avons effectué un test t d’étudiant (Figure 2C) et une analyse de biomarqueurs (Figure 2D) pour identifier les métabolites dérégulés. En suivant les critères décrits dans la section sur le protocole, nous avons filtré les résultats en fonction des métabolites significatifs (tableau 2).

Figure 2 : Analyse multivariée et univariée. (A) Analyse en composantes principales (ACP) et (B) Analyse discriminante orthogonale partielle des moindres carrés (OPLS-DA) des patients atteints de SDRA léger (représentés par la couleur rouge) et des patients atteints du SDRA modéré (représentés par la couleur verte). (C) Les diagrammes boîte-moustache mettent en évidence les différences de concentration relative de métabolites entre les patients atteints de SDRA léger et modéré détectés par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire à protons dans des échantillons de sérum. L’axe des x représente les groupes d’étude, et l’axe des y montre la concentration relative lorsque les patients atteints de SDRA léger (représentés par la couleur rouge) et les patients atteints du SDRA modéré (représentés par la couleur verte) ont été comparés le jour 1 de l’admission en soins intensifs. (D) Le graphique de l’aire sous la courbe (AUC) des métabolites significatifs prédisant la gravité obtenu après avoir effectué une analyse de biomarqueurs comparant les patients atteints de SDRA léger et modéré au jour 1 de l’admission en soins intensifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

S.No.	Nom	Localisation spectrale (ppm)	Valeur p	VIP	Valeur AUC
1	Lactate	1.34	0.04	1.99	1
2	Isoleucine	1.42	0.03	2.01	0.875

Tableau 2 : Liste des métabolites significatifs obtenus après comparaison des patients atteints de SDRA léger et modéré au jour 1 de l’admission en soins intensifs.

Comme les résultats ont été obtenus en valeurs ppm, nous avons attribué les métabolites à l’aide de la littérature antérieure et les avons validés à l’aide du profileur. Après l’assignation, le lactate et l’isoleucine ont été obtenus en tant que métabolites significatifs, qui ont également été rapportés dans certaines études antérieures sur le SDRA^30,40. Nous avons veillé à ce que les pics soient bien résolus et ne se chevauchent pas. Après identification, nous avons filtré la liste des métabolites significatifs en utilisant les critères mentionnés dans le protocole. Nous avons ensuite quantifié les métabolites d’intérêt à l’aide du module profileur en ouvrant les spectres, en recherchant le métabolite d’intérêt et en ajustant le pic logiciel au pic obtenu dans les spectres. Cela a fourni les valeurs quantifiées des métabolites en mM. Une feuille de calcul contenant les noms des échantillons, les noms des métabolites et les concentrations a été générée à titre de référence. Après quantification avec le logiciel, une validation par d’autres approches, telles que la protéomique, peut être effectuée.

De plus, les métabolites identifiés sont analysés de manière approfondie afin de déterminer leur corrélation avec la gravité de la maladie et d’identifier les voies biochimiques dans lesquelles ces métabolites sont activement impliqués. Étant donné que seuls deux métabolites significatifs ont été identifiés après l’utilisation des critères mentionnés dans la section sur le matériel et la méthode, l’analyse des voies à l’aide du logiciel n’a pas été possible. Par conséquent, une étude approfondie de la littérature a été effectuée pour mettre en évidence les cycles métaboliques perturbés. Les deux métabolites identifiés dans cette étude ont été corrélés avec succès avec la gravité du SDRA. L’augmentation du lactate dénotait une inflammation pulmonaire et une respiration anaérobie, tandis qu’une augmentation de l’isoleucine indiquait un catabolisme protéique associé à des lésions pulmonaires, à une infection et au métabolisme énergétique⁴⁰. La compréhension de ces voies métaboliques a un double objectif. Tout d’abord, il révèle la complexité de la maladie, en donnant un aperçu de ses mécanismes biologiques. Deuxièmement, il contribue aux progrès thérapeutiques en guidant les cliniciens dans l’adaptation des traitements aux patients, améliorant ainsi les résultats cliniques.

Discussion

La métabolomique identifie et quantifie efficacement les métabolites, en ciblant les cycles métaboliques qui deviennent perturbés au cours de la maladie. La qualité des résultats dépend de l’exécution méticuleuse de chaque étape de l’approche métabolomique. Chaque étape, de la sélection et de la collecte de l’échantillon à l’identification de la voie, est essentielle pour identifier avec précision les principaux facteurs contribuant à la maladie. Avant d’effectuer une métabolomique, un examen approfondi de la littérature est essentiel et une attention particulière doit être portée à chaque étape.

Lors de la conception d’une étude métabolomique, la sélection d’un échantillon est cruciale pour extraire des informations significatives et assurer une préparation idéale de l’échantillon, que ce soit pour une empreinte métabolique ciblée ou non ciblée de l’état clinique considéré. Un traitement initial approprié des échantillons est crucial, et les protocoles doivent être systématiquement suivis pour tous les échantillons tout au long de l’étude⁴⁹. Une prudence supplémentaire est nécessaire lorsque l’on travaille avec des échantillons cliniques. Les échantillons couramment utilisés pour la métabolomique basée sur la RMN comprennent les biofluides, les extraits cellulaires et les extraits de tissus^50,51. Le liquide céphalo-rachidien (LCR) et l’urine nécessitent souvent un prétraitement minimal et sont fréquemment étudiés dans des contextes tels que les affections rénales, les maladies neurodégénératives et la toxicité des médicaments. Le sang total, le plasma et le sérum fournissent des informations complètes sur un large éventail de maladies critiques et sont préférés en raison de leur facilité de collecte. Une large gamme d’autres biofluides, tels que le liquide séminal, la salive, la bile, le liquide de dialyse, le liquide amniotique, le condensat d’haleine expirée, les aspirations pulmonaires, le liquide synovial et le liquide de lavage mini-broncho-alvéolaire (mBALF), ont été largement utilisés pour leur spécificité et leur précision à l’aide de la RMN 52,53,54. Chaque biofluide présente ses avantages et ses défis en termes de collecte, de disponibilité et de contenu informatif, en fonction de l’étude ou de la conception expérimentale⁵⁵. Nous nous sommes concentrés sur des échantillons de sérum de patients atteints de SDRA pour cette étude, car les échantillons de sang offrent généralement des informations au niveau de l’ensemble du corps et ne sont pas significativement influencés par des variations quotidiennes extrêmes. D’autre part, les échantillons d’urine sont soumis à diverses fluctuations et peuvent être influencés par l’alimentation, le mode de vie, les médicaments et les facteurs environnementaux²⁷. Un stockage adéquat des échantillons est également important pour éviter l’activité enzymatique ou la dégradation microbienne. Les échantillons sont généralement cryoconservés à -80 °C avec des cycles de congélation-décongélation minimaux pour prévenir la dégradation métabolique et maintenir la stabilité de l’échantillon. L’échantillon peut être stocké à -80 °C pendant de longues périodes, ce qui permet de mener facilement des expériences RMN. Cependant, il est conseillé de planifier et d’effectuer l’expérience le plus tôt possible pour des résultats optimaux.

Dans cette étude, nous avons utilisé un spectromètre RMN de 800 MHz pour l’acquisition de données, qui fournit des données spectrales à haute résolution. Pour cette expérience, nous avons adhéré aux mêmes paramètres d’acquisition que ceux mentionnés ci-dessus. Cependant, il est important de noter que les mêmes paramètres d’acquisition décrits dans ce protocole peuvent être appliqués à l’aide de spectromètres RMN fonctionnant à d’autres intensités de champ magnétique. Le nombre de balayages peut être augmenté lorsque vous utilisez un champ magnétique plus faible pour améliorer la résolution. Bien que des intensités de champ plus élevées puissent offrir une résolution améliorée, les aspects fondamentaux du processus d’acquisition, tels que les séquences d’impulsions, les retards de relaxation et le contrôle de la température, restent cohérents entre les différents instruments, garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats.

Le suivi d’une procédure standardisée est essentiel pour maintenir la reproductibilité et l’impartialité, car les écarts peuvent entraver l’analyse et l’évaluation ultérieures des données. Chaque étape de l’expérimentation RMN doit être réalisée méticuleusement, car la qualité des spectres en dépend. Une attention particulière doit être accordée au calage, car il définit la forme du pic, et les paramètres d’acquisition doivent être optimisés en fonction de l’échantillon et de la conception de l’étude. Pour les échantillons à faible concentration métabolique dans l’échantillon, le nombre de balayages peut être augmenté. L’acquisition de données en RMN implique une optimisation standard des expériences 1D et 2D adaptée au choix de l’échantillon et aux informations spécifiques requises. Diverses expériences de RMN ont été optimisées pour obtenir des spectres de haute qualité à partir de biofluides, minimisant ainsi l’impact des macromolécules indésirables. La séquence d’impulsions^{CPMG 56} est préférée pour des échantillons tels que le sérum, le plasma ou le liquide céphalo-rachidien. Cette technique supprime les signaux larges des macromolécules telles que les lipides et les protéines, qui ont de longs temps de relaxation transverse et peuvent obscurcir les résonances des métabolites de faible poids moléculaire.

Le prétraitement des données englobe les méthodes intermédiaires utilisées pour assurer une analyse et une interprétation uniformes et homogènes des données. Ce processus consiste notamment à éviter les signaux indésirables ou les régions spectrales sujettes aux incohérences et à corriger les décalages de crête. Dans les biofluides, l’exclusion des régions indésirables signifie souvent la suppression des signaux, tels que ceux de l’eau, qui dominent la gamme de 4,6 ppm à 5 ppm. Les décalages de pic, causés par les variations du pH, de la température, de la concentration en sel, des facteurs de dilution et de la composition ionique, peuvent être minimisés en utilisant des tampons à un pH homéostatique. De plus, l’utilisation de composés de référence standard, l’alignement des pics et le binning peuvent aider à réduire les décalages de pics. L’alignement des pics est crucial pour corréler les motifs entre différents spectres acquis dans des conditions identiques.

Le traitement des spectres doit être effectué correctement pour assurer un regroupement précis plus tard dans l’analyse. Tous les spectres doivent être étalonnés et alignés uniformément, et les corrections de base et de phase peuvent être effectuées manuellement ou automatiquement. Une correction de phase et de base appropriée, ainsi qu’un étalonnage, sont essentiels. Il est essentiel d’effectuer une correction de base pour éviter les distorsions qui peuvent affecter l’identification et la quantification des métabolites⁵⁷. La correction de phase est nécessaire pour s’assurer qu’aucun pic déformé ou inversé ne peut affecter l’interprétation des résultats. Décidez soigneusement des critères de sélection des métabolites significatifs et filtrez les résultats en conséquence. Étant donné que le binning fournit des résultats sous forme de valeurs ppm, identifiez avec précision le nom du métabolite à l’aide de diverses sources mentionnées dans le protocole. Si plusieurs métabolites sont présents aux mêmes valeurs ppm, identifiez-les par la forme du pic.

Avant d’effectuer l’analyse statistique, une normalisation est effectuée pour réduire les variations dans l’ensemble de données, qu’elles soient induites ou non, dues aux différences d’amplitude et aux fluctuations des concentrations de métabolites. Ce processus implique diverses méthodes de centrage, de mise à l’échelle et de transformation, choisies en fonction de la distribution et de la variabilité des données. L’objectif est de minimiser les biais systématiques indésirables tout en préservant les facteurs biologiques d’intérêt. Des méthodes multivariées, y compris PCA, PLS-DA et OPLS-DA, sont utilisées pour établir des métabolites différentiels avec des valeurs VIP supérieures à 1. La prédictibilité et la validation croisée du modèle sont déterminées à l’aide des valeurs R2 (qualité de l’ajustement) et Q2 (qualité de la prédiction), tandis que les statistiques des tests de permutation valident le modèle. Une carte thermique basée sur la corrélation de Pearson évalue la robustesse du modèle en énumérant les métabolites régulés à la hausse et à la baisse dans les sous-phénotypes et les endotypes résultants.

Des méthodes univariées, telles que le test t de Student et l’ANOVA, comme la correction de Bonferroni ou la minimisation du FDR (taux de fausses découvertes) et Benjamini-Hochberg, sont utilisées pour réduire la probabilité de faux positifs. Ces méthodes fournissent une mesure approximative de caractéristiques potentiellement importantes, indépendamment de leur corrélation au sein ou entre les molécules et d’autres facteurs de confusion. Les métabolites significatifs sont identifiés sur la base d’une valeur p inférieure à 0,05, qui sont ensuite utilisées pour corroborer les endotypes métaboliques dans les sous-groupes^{de résultats 45}.

Des diagrammes individuels à moustaches et AUROC sont utilisés pour évaluer la spécificité et la sensibilité des endotypes dans les sous-groupes de résultats. Le score clinique est combiné avec le modèle dans AUROC pour valider la précision du modèle. La valeur AUC > 0,8 est considérée comme significative⁴⁶. Divers autres tests sont disponibles en ligne pour tester l’exactitude de la discrimination et l’efficacité des métabolites identifiés. Il s’agit notamment de la classification aléatoire des forêts, de la carte thermique, de la corrélation, ^etc.45.

Diverses approches sont utilisées pour quantifier les métabolites significatifs, y compris l’intégration des pics, qui peut être difficile pour les débutants en raison de leur nature avancée. Identifier les pics caractéristiques des métabolites en se référant aux déplacements chimiques individuels pour une identification précise. Déterminez l’aire de ces pics caractéristiques par rapport à l’aire du pic de référence, TSP. Pour calculer la concentration absolue d’un métabolite (Cm), utilisez l’équation suivante :

Cm = Im.nr.Cr/Ir.nm

Où Cr est la concentration du composé de référence (TSP) dans la solution, Im et Ir sont les zones de pics intégrées (peuvent être obtenues à l’aide d’un outil de traitement et d’analyse RMN) du métabolite et de la référence (TSP), respectivement, et nm et nr sont le nombre de protons représentant le métabolite et les pics de référence, respectivement²⁴.

Alternativement, un logiciel automatisé de quantification des métabolites RMN est utilisé pour obtenir les concentrations de métabolites pour un ou plusieurs spectres en fonction de la concentration de l’étalon de référence, TSP. La quantification à l’aide d’un logiciel simplifie le processus et réduit la probabilité d’erreurs par rapport à d’autres méthodes. Bien que ce document de recherche mette en évidence l’utilisation d’un logiciel pour la quantification des métabolites, il peut y avoir des problèmes si le métabolite d’intérêt n’est pas présent dans la bibliothèque de logiciels. De plus, le logiciel est payant, de sorte que seuls les chercheurs disposant d’une licence autorisée peuvent l’utiliser.

La métabolomique s’est avérée déterminante dans la résolution des complexités de diverses maladies en identifiant les cycles métaboliques dérégulés contribuant à la gravité de la maladie. Cependant, il a été difficile de traduire ces résultats dans la pratique clinique. La communauté médicale met maintenant l’accent sur une approche de médecine personnalisée pour améliorer les résultats de la maladie. Alors que l’identification des métabolites dérégulés était auparavant suffisante, les efforts actuels se concentrent sur une quantification précise pour définir des plages spécifiques à la maladie. Ces informations sont inestimables pour les cliniciens dans la personnalisation des stratégies de traitement. Les progrès des techniques de quantification ont facilité les efforts de recherche, de nombreux groupes de recherche dans le monde entier employant avec succès ces approches à l’aide de logiciels spécialisés.

Ces progrès soulignent le potentiel de la métabolomique à avoir un impact significatif sur la médecine personnalisée et à améliorer les résultats cliniques. De plus, l’intégration des données métabolomiques avec d’autres données omiques, telles que la génomique et la protéomique, promet de fournir une compréhension plus complète des mécanismes de la maladie et d’affiner davantage les interventions thérapeutiques. À mesure que la technologie continue d’évoluer, la précision et l’utilité de la métabolomique en milieu clinique devraient augmenter, ouvrant la voie à des solutions de soins de santé plus efficaces et personnalisées.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centirfuge	Sigma aldrich	3-18KS
Chenomx NMR suite  ;	NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Canada		Logiciel de quantification des métabolites RMN
Insert coaxial	Sigma aldrich	Z278513
Oxyde de deutérum	Sigma aldrich	151882
Eppendorf tubes	Tarsons	500020
Metaboanalyst	Wishart Research Group		Logiciel d’analyse statistique
Tube RMN	Wilmad	Z412007	Pipette
	Eppendorf de 5 mm de diamètre plus	3123000039	0-100 &mu ; l
Flacons de prélèvement	d’échantillons Flacons cryo chill	Tarsons 523194
Azoture de sodium	Sigma aldrich	S2002
Cristal de chlorure	de sodium Sigma aldrich	S9625
Phosphate de sodium dibasique	Sigma aldrich	567550
Phosphate de sodium monobasique	Sigma aldrich	S0751
Topspin 3.6.4	Outil de traitement et d’analyse RMN	Bruker
Sel Tsp	Sigma aldrich	269913