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Dévoilement des protéoformes d’histones à l’aide de l’électrophorèse sur gel 2D-TAU

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DOI :

10.3791/67321

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18 octobre 2024

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1Research Center on Advanced Biochemistry and Molecular Biology, Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Græcia University of Catanzaro, 2Department of Pharmacy, Health and Nutritional Sciences, University of Calabria

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette méthode décrit une stratégie simple et rapide pour la caractérisation et l’investigation des protéoformes d’histones.

Résumé

Les histones subissent diverses modifications post-traductionnelles (PTM) telles que la méthylation, l’acétylation, la phosphorylation, l’acylation et l’ubiquitination, qui contrôlent la dynamique des nucléosomes et déterminent le destin cellulaire. Le nucléosome, qui est l’unité fonctionnelle de la chromatine, comprend l’ADN, quatre paires d’histones (H3, H4, H2A et H2B) constituant le noyau globulaire, et l’histone de liaison H1, qui stabilise la structure de la chromatine. Les queues amino-(N)-terminales des histones dépassent des domaines centraux globulaires et subissent des PTM distincts qui influencent le paysage chromatique. Certaines preuves suggèrent que l’homéostasie des histones PTM est cruciale pour préserver toutes les activités physiologiques. La dérégulation des PTM des histones est la principale cause de prolifération cellulaire anormale, d’invasion et de métastases. Par conséquent, le développement de méthodes pour caractériser les PTM d’histones est crucial. Ici, nous décrivons une technique efficace pour isoler et analyser les isoformes d’histones. La méthode, basée sur la combinaison de deux séparations orthogonales, permet l’enrichissement des isoformes d’histones et l’identification ultérieure par spectrométrie de masse. La technique, décrite à l’origine par Shechter et al., combine des gels de polyacrylamide acide-urée (TAU-GEL), qui peuvent séparer les protéines d’histones basiques en fonction de leur taille et de leur charge, et des gels de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE), qui peuvent séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire. Le résultat est une carte bidimensionnelle des isoformes d’histones, adaptée à la digestion dans le gel, suivie d’une identification par spectrométrie de masse et d’une analyse par transfert Western. Le résultat est une carte bidimensionnelle des isoformes d’histones, adaptée à la fois à la digestion en gel, suivie de l’identification par spectrométrie de masse et de l’analyse par transfert Western. Cette approche protéomique est une méthode robuste qui permet l’enrichissement d’une seule isoforme d’histones et la caractérisation de nouvelles PTM d’histones.

Introduction

L’apparition, la progression et la chimiorésistance du cancer sont liées à des événements génétiques et épigénétiques, y compris les PTM d’histones. Les histones subissent une variété de PTM qui régulent la dynamique de la chromatine et dictent le destin cellulaire1.

Le nucléosome est l’unité fonctionnelle de la chromatine et est un complexe moléculaire d’ADN et de protéines qui permet à l’ADN d’être emballé dans le noyau. Il se compose de quatre paires d’histones (H3, H4, H2A et H2B) qui constituent le noyau du nucléosome, ainsi que de l’histone de liaison H1, qui aide à stabiliser la structure de la chromatine. Les queues amino-terminales des histones dépassent de leurs domaines centraux globulaires et subissent des modifications post-traductionnelles spécifiques qui affectent le paysage chromatinal2.

Jusqu’à présent, au moins 23 classes de PTM d’histones sont connues. Ces PTM sont des modifications covalentes qui consistent principalement en la méthylation, l’acétylation, la phosphorylation, la glycosylation, l’ubiquitylation, la SUMOylation et l’ADP-ribosylation3. De plus, une corrélation étroite entre l’homéostasie de l’épigénome et le recâblage métabolique a récemment été proposée, ce qui explique la croissance exponentielle du nombre possible d’histones PTM 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Les PTM d’histones, déposées, effacées et transduites par des enzymes modificatrices, sont nommées respectivement écrivains, effaceurs et lecteurs. Ils affectent les propriétés physiques et chimiques de la structure de la chromatine, affectant le profil d’expression des gènes, y compris l’expression des gènes suppresseurs de tumeurs et des oncogènes 14,15,16.

Le nombre d’histones protéoformes augmente lorsqu’elles sont incorporées dans le nucléosome en tant que variantes d’histones. Ces variantes sont des isoformes non alléliques d’histones canoniques, et elles ajoutent de la complexité en modifiant les propriétés chimiques et physiques de la chromatine. Par rapport aux histones canoniques, les variants d’histones ont des domaines fonctionnels qui subissent des modifications post-traductionnelles uniques ou interagissent avec des composants spécifiques de la chromatine, ce qui a un impact sur la dynamique et la stabilité du nucléosome17.

Dans les cellules cancéreuses, la dérégulation des PTM et des variantes d’histones affecte le profil d’expression génique, entraînant une prolifération cellulaire anormale, une invasion, des métastases et l’activation des voies de résistance aux médicaments 3,18,19,20. Les mutations au sein des histones ou des complexes de remodelage de la chromatine peuvent modifier le phénotype cellulaire, contribuant ainsi à la transformation néoplasique. L’accumulation d’altérations épigénétiques, telles que la méthylation des histones, est un facteur clé dans l’activation des voies de résistance aux médicaments 21,22,23. Les mutations au sein du complexe SWI/SNF, qui se compose de 15 sous-unités codées par 29 gènes, ont un impact sur plus de 20 % des cancers humains dans de nombreux types de tumeurs. Au cours de la dernière décennie, des stratégies médicamenteuses basées sur l’épigénétique (epi-drugs) ont été développées, et de nombreux médicaments ciblant le cancer avec des modèles anormaux de modification des histones ont été approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis23.

L’analyse des protéines d’histones est assez difficile, ce qui en fait un domaine d’étude exigeant. Récemment, les méthodes de spectrométrie de masse sont devenues la méthode privilégiée pour caractériser et étudier les protéoformes d’histones. Cependant, les conditions d’extraction drastiques, combinées à la faible solubilité de certaines variantes et à l’homologie de séquence élevée, rendent leur analyse difficile.

Au cours de la dernière décennie, plusieurs méthodes basées sur la spectrométrie de masse ont été développées pour le profilage et l’investigation des histones 24,25,26,27. Dans cette étude, nous présentons une méthode rentable et fiable pour créer une carte bidimensionnelle des protéoformes d’histones, ce qui peut augmenter les chances de découvrir de nouvelles modifications post-traductionnelles.

L’électrophorèse TAU 2D combine la séparation dans des conditions acides avec SDS PAGE. Dans la première dimension, l’état acide du milieu donne une charge positive nette aux protéines basiques. Étant donné que les histones sont des protéines très basiques et ont un point isoélectrique (pH) plus élevé par rapport au milieu, elles deviennent chargées positivement et migrent sous un champ électrique. Dans la deuxième dimension, les histones sont dénaturées par SDS et séparées en fonction de leur poids moléculaire. La carte 2D résultante peut être utilisée comme un outil pour enrichir des protéoformes spécifiques à une résolution ponctuelle pour l’analyse par spectrométrie de masse et les études immunologiques28,29. Après électrophorèse, les taches TAU 2D peuvent être décolorées, digérées par la trypsine et analysées par spectrométrie de masse. Alternativement, la carte TAU 2D peut être tamponnée sur un filtre nitrocellulose/PVDF et étudiée par immunocoloration27.

Dans ce contexte, les méthodes pourraient être stratégiques pour améliorer l’identification et l’analyse de nouvelles modifications post-traductionnelles corrélées au recâblage métabolique30,31.

Nous avons encore amélioré la méthode originale en incorporant une étape de sonication, ce qui est utile pour la dégradation de l’ADN et l’amélioration de la solubilité des protéines. De plus, nous avons prolongé l’étape d’incubation pour l’extraction des histones, afin d’obtenir un échantillon de protéines de haute pureté. De plus, dans notre protocole, nous avons exécuté la première dimension à basse tension pendant une durée plus longue pour obtenir une meilleure résolution. Le gel résultant a été utilisé pour étudier les histones canoniques PTM et caractériser de nouvelles modifications telles que la glycation10,32.

Dans l’ensemble, nous avons développé une méthode d’extraction et de purification des histones, suivie de la résolution des protéoformes d’histones à l’aide d’une carte bidimensionnelle. Les travaux comprennent également une procédure de digestion en gel pour l’analyse par spectrométrie de masse et les étapes de l’analyse bidimensionnelle par transfert de Western.

Protocole

1. Extraction d’histones

  1. Effectuez l’extraction d’histones à partir d’au moins 1 x 10cellules 6 , qui sont confluentes à 80 %. Pour cette expérience, nous avons utilisé des lignées cellulaires MCF-10A de l’ATCC. Après le placage, laver les cellules trois fois avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x. Effectuez toutes les étapes sur de la glace.
  2. Préparez un tampon de lyse cellulaire contenant 10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de KCl et 1,5 mM de MgCl2. Ajouter 1 mM de dithioérythritol et d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase juste avant l’utilisation.
  3. Ajoutez 800 μL de tampon de lyse cellulaire dans la boîte de Pétri contenant les cellules, grattez et recueillez les cellules dans un tube de 1,5 mL, puis incubez sur un rotateur à 300 tr/min, 4 °C pendant 1 h.
  4. Centrifugation à 10 000 x g, 4 °C, pendant 10 min dans une microcentrifugeuse prérefroidie avec un rotateur pour tubes de 1,5 mL.
  5. Laver la pastille avec 400 μL de tampon de lyse cellulaire et centrifuger à 10 000 x g, 4 °C, pendant 10 min. Jetez le surnageant. Répétez l’étape de lavage 3 fois.
    REMARQUE : Utilisez une microcentrifugeuse pré-refroidie (4 °C) avec un rotateur pour tubes de 1,5 ml pour toutes les étapes. Manipulez le granulé avec précaution pour éviter toute perte de matière.
  6. Remettre la pastille en suspension dans 640 μL de 0,2 M H2SO4 et incuber sur un rotateur à 300 tr/min, à 4 °C, pendant 16 h.
    ATTENTION : L’acide sulfurique est un produit chimique dangereux ; Veuillez l’utiliser sous une hotte chimique.
  7. Centrifugeuse à 16 000 x g, 4 °C, pendant 10 min. Transférez le surnageant dans un tube frais et conservez-le jusqu’aux étapes suivantes. Jetez les débris nucléaires.
  8. Précipiter les histones en ajoutant 212 μL d’acide trichloracétique, goutte à goutte (la concentration finale de TCA est de 33 %). Mélangez la solution en inversant le tube 10x. Incuber sur glace, dans l’obscurité, pendant 16 h.
    ATTENTION : Le TCA est un produit chimique dangereux ; Utiliser sous une hotte chimique.
  9. Histones à granulés par rotation dans une centrifugeuse prérefroidie à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirez délicatement le surnageant et lavez la pastille 3 fois avec 200 μL d’acétone froide.
  10. Remettre le granulé en suspension avec de l’acétone froide, puis sonicer haute puissance 2x avec 3 cycles de 30 s on/off, en alternance avec une pause de 10 min sur glace.
    REMARQUE : La procédure a été effectuée à l’aide d’un ultrasonisateur. Cette étape est essentielle pour éliminer l’ADN enveloppé d’histones.
  11. Centrifuger à 16 000 x g pendant 10 min, jeter l’acétone et remettre l’échantillon en suspension dans 100 μL d’eau doublement distillée. Déterminer la concentration en protéines à l’aide de la méthode d’analyse de Bradford, conformément aux instructions du fabricant33.
    REMARQUE : Après centrifugation, la pastille apparaît parfois blanche ou translucide. Un précipité blanc et opaque pourrait indiquer la présence de contaminants salins qui pourraient nuire à la séparation 2D. Si c’est le cas, répétez les étapes de lavage à l’acétone jusqu’à ce que la pastille devienne translucide.
  12. Lyophiliser 70 μg d’histones, selon les instructions du fabricant. Réglez le lyophilisant à 30 °C pendant 60 min. Vérifiez le volume du tube et répétez l’étape à 30 °C jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement lyophilisé (généralement, 90 min sont nécessaires pour lyophiliser complètement l’échantillon). Après 60 min, vérifiez le volume toutes les 10 min, car le processus dépend de l’échantillon.
    REMARQUE : Si la quantité de protéines d’histones est faible, commencez à partir de 2 x 106 cellules. Dans ce cas, utilisez le même volume de réactifs que celui utilisé pour 1 x 106 cellules. Vérifier la pureté de tous les produits chimiques utilisés au cours de la procédure ; tous les réactifs doivent être de qualité HPLC.

2. Mini électrophorèse 2D sur gel triton-acide-urée (TAU)

  1. Préparez un mini-gel TAU pour un mini système d’électrophorèse vertical sur gel de polyacrylamide, comme décrit ci-dessous.
    1. Préparez le gel de séparation : 6 M d’urée, 15 % d’acrylamide/bisacrylamide (29:1), 5 % d’acide glacial acétique, 0,25 % de Triton X-100 (v/v), 0,4 % de TEMED (v/v), 0,1 % d’APS (p/v). Pour préparer la solution, dissoudre l’urée dans de l’acrylamide/bis et 1 mL d’eau ultrapure en agitant doucement à température ambiante ; Ajoutez les autres composants et réglez le volume. Pour un gel mini-TAU, préparer 10 mL de solution. Remplissez les plaques de gel prédéfinies avec la solution, en évitant la formation de bulles d’air à seulement 1,5 cm du haut. Recouvrez la solution de 1 mL d’isopropanol pour niveler le gel.
    2. Préparez le gel d’empilage : 6 M d’urée, 6 % d’acrylamide/bisacrylamide (29:1), 5 % d’acide glacial acétique, 0,25 % de Triton X-100 (v/v), 0,4 % de TEMED (v/v), 0,1 % d’APS (p/v). Pour préparer la solution, dissoudre l’urée dans de l’acrylamide/bis et 1 mL d’eau ultrapure ; Ajoutez les autres composants et ajustez au volume. Remplissez les plaques de gel avec une solution d’empilage, placez un peigne en gel à 10 puits entre les plaques et insérez-le jusqu’à ce que la solution de gel arrive à mi-hauteur des dents du peigne. Laisser polymériser le gel 16 h à 4 °C.
      REMARQUE : Insérez soigneusement le peigne pour assurer la formation régulière de puits.
  2. Préparez 100 μL de tampon d’échantillon TAU en dissolvant 6 M d’urée, 5 % d’acide glaciaire acétique et de l’eau doublement distillée. Dissoudre l’échantillon lyophilisé préparé dans 30 μL de tampon d’échantillon TAU.
  3. Remplissez la mini-cassette avec un tampon de coulage TAU, concentration finale d’acide acétique de 5 %. Rincez les puits du gel TAU à l’aide d’une seringue remplie de tampon courant et chargez l’échantillon dans le puits à l’aide d’une micropipette.
  4. Connectez la chambre électrophorétique à l’alimentation, avec l’électrode positive (rouge) placée en bas. Faites attention, lorsque l’IP > pH, les protéines sont chargées positivement, de sorte que la migration se fait de l’électrode positive à l’électrode négative. Faites fonctionner le gel d’abord à 30 V pendant 70 min, puis à la tension constante de 25 V pendant 17 h.
    REMARQUE : Pendant ce temps, coupez de temps en temps l’alimentation électrique et rincez les puits de gel à l’aide d’une seringue jetable. Faites attention à éliminer toutes les bulles de la surface inférieure du gel à l’aide d’une seringue pour éviter la perte d’échantillon et la présence d’un étalement dans les protéines résolues.
  5. Retirez le gel des plaques de gel et coupez la ligne d’intérêt avec un scalpel propre. Manipulez soigneusement le gel pour éviter la casse du gel. Comme la ligne d’intérêt est incolore, chargez l’échantillon dans le puits numéro 1 pour identifier et couper exactement la voie d’intérêt.
    REMARQUE : Pour vérifier la séparation sur le gel mini-TAU, préparez et analysez l’échantillon en double. L’un de ces gels peut être coloré à l’aide de Coomassie Brilliant Blue. Le schéma de séparation est illustré à la figure 1A.
  6. Lavez la voie avec 15 ml de Tris-HCl 0,5 M pH 8,8 pendant 15 min.
  7. Préparez 15 ml de tampon d’équilibrage 1 avec de l’urée 6 M, du Tris-HCl 0,5 M, un pH 6,8, 30 % de glycérol, 20 % de SDS et 2 % de dithioérythritol. Préparez 15 ml de tampon d’équilibrage 2, en utilisant 6 M d’urée, 0,5 M de Tris-HCl, un pH de 6,8, 30 % de glycérol, 20 % de SDS et 2 % d’iodoacétamide. Préparez les tampons d’équilibrage 1 et 2 juste avant utilisation ; Stockez le tampon d’équilibrage 2 dans l’obscurité.
  8. Incuber la voie de gel, sous une légère agitation, dans 10 mL de tampon d’équilibrage 1 pendant 15 min, puis décanter. Incuber la voie de gel, sous une légère agitation, avec 10 mL de tampon d’équilibrage 2 pendant 15 min à l’obscurité, puis décanter.
  9. Préparez un gel d’acrylamide SDS 15 % résolutif en suivant le tableau 1. Installez la plaque de gel et remplissez-la avec la solution de gel de résolution. Remplissez la solution jusqu’à ce qu’elle soit à 1,5 cm de l’extrémité de la longue plaque de gel. Mettez 1 mL d’isopropanol sur la surface pour niveler le gel et lui permettre de polymériser.
  10. Après la polymérisation du gel, décantez l’isopropanol et séchez le puits avec du papier de chromatographie sur cellulose 3MM Chr. Insérez la voie résultante de l’étape 8 dans le puits de gel.
  11. Scellez la voie au gel de résolution avec une solution d’étanchéité de 0,5 % d’agarose à bas point de fusion dans 1 tampon Tris/glycine/SDS et 5 μL de bleu de bromophénol à 0,003 %. Laisser polymériser le gel d’agarose pendant 30 min.
    REMARQUE : Évitez la formation de bulles d’air lors du scellement de l’agarose pour éviter les taches de gel.
  12. Mettez les plaques de gel dans la cassette et remplissez-la de 1x tampon Tris/glycine/SDS. Faites couler le gel à 120 V jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol atteigne le fond. Retirez délicatement le gel des plaques, jetez l’excès d’agarose et colorez le gel à l’argent à l’aide d’une procédure compatible avec la spectrométrie de masse ou le transfert pour le dosage immunologique.

3. Coloration à l’argent 32

  1. Préparez les réactifs suivants - Fixateur : 50 % de méthanol, 5 % d’acide acétique, 45 % d’eau désionisée ; Solution de lavage : 50 % de méthanol, 50 % d’eau déminéralisée ; Sensibilisant : 0,02 % Na2S2O3 5H2O dans de l’eau désionisée ; Réactif d’argent : 0,1 % de nitrate d’argent dans de l’eau désionisée froide (4 °C) ; Révélateur : 0,04 % de formol et 2 % de Na2CO3, formaldéhyde (37 %) (ajouter juste avant l’utilisation) 0,4 mL d’eau désionisée et remplir jusqu’à 1000 mL ; Réactif stop : 5 % d’acide acétique ; Solution de stockage du gel : 1 % d’acide acétique.
    REMARQUE : Étant donné que les produits chimiques utilisés pour la coloration sont dangereux, effectuez toutes les étapes sous une hotte chimique.
  2. Suivez la procédure décrite dans le Tableau 2 en tenant compte de ce qui suit. Effectuez toutes les incubations en agitant doucement. Préparez le réactif stop avant de commencer l’étape de développement ; Cela garantira le développement du gel avec l’intensité opportune. Au cours de l’étape de développement, les taches apparaîtront sous forme de signaux jaunes qui deviendront brun clair à la fin de l’incubation. L’intensité des différentes taches dépendra de la quantité d’histones protéoformes. Le gel est prêt pour l’excision localisée et la digestion dans le gel (Figure 1B)

4. Digestion dans le gel

  1. Préparez les solutions suivantes : 50 mM de bicarbonate d’ammonium (NH4HCO3)/50 % (v/v) d’acétonitrile ; 10 mM de dithiothréitol (DTT) dans 50 mM NH4HCO3 ; 55 mM d’iodoacétamide (AIA) dans 50 mM NH4HCO3 ; 0,1 % d’AGF ; 50 mM NH4HCO3, pH 8 ; Acétonitrile de qualité HPLC ; Tubes en silicone de 1 ml.
    REMARQUE : Pour éviter la contamination humaine par la kératine, par les cheveux ou la peau, utilisez des gants propres et travaillez dans un endroit propre.
  2. Excisez les points d’intérêt des histones du gel coloré à l’aide d’un scalpel propre et placez-les dans un tube de silicium frais (1,5 ml). Prenez soin d’exciser un seul endroit et de le mettre dans un seul tube pour éviter la contamination croisée des isoformes.
  3. Ajouter à chaque point de gel 250 μL de 50 mM de NH4HCO3/50 % d’acétonitrile et incuber sous agitation douce dans un thermomélangeur à température ambiante. Décantez la solution et répétez cette étape 3 fois. Les morceaux de gel apparaîtront transparents.
  4. Déshydratez les taches de gel en ajoutant de l’acétonitrile (200 μL). À ce stade, les morceaux de gel prendront une couleur blanc opaque.
  5. Décanter l’acétonitrile et laisser sécher à l’air libre pendant 10 min. Le morceau de gel apparaîtra sec dans le tube. La réduction et l’alkylation ne sont pas essentielles puisque les protéines d’histones ont été réduites et alkylées lors de l’étape d’équilibration.
  6. Réhydratez les taches de gel dans 20 μL de solution de trypsine (0,1 mM HCl) ou un volume suffisant pour couvrir les morceaux de gel. Placez les tubes dans le thermomélangeur et incubez, sous une légère agitation, à 37 °C pendant au moins 4 h jusqu’à 16 h.
  7. Transférez le surnageant contenant les peptides tryptiques dans un tube frais. Ajouter 50 μL de solution d’extraction (60 % d’acétonitrile, 1 % de TFA) aux morceaux de gel et sonicer 2 fois dans un bain-marie à ultrasons pendant 10 min à 4 °C.
  8. Transférez le surnageant, contenant des peptides tryptiques supplémentaires, dans le tube frais. Utilisez un lyophilisateur pour sécher les peptides extraits en mélange. Réglez le lyophiliseur à 30 °C et séchez la solution ; Une pastille lyophilisée apparaîtra dans le tube.
    REMARQUE : Cette étape dépend du volume ; En général, 1 h suffit, mais vérifiez le volume toutes les 10 minutes jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement sec.
  9. Ajouter 15 μL de TFA à 0,1 % dans chaque tube et incuber doucement dans un thermomélangeur à 25 °C. Transférez le surnageant dans le flacon pour l’analyse LC-MS/MS.

5. Transfert western 2DTAU

  1. Préparez le tampon de transfert, 250 mM de base Tris, 92 mM de glycine et 10 % de méthanol à l’aide d’eau doublement distillée.
  2. Coupez la membrane de nitrocellulose et le papier filtre aux dimensions du gel.
  3. Équilibrez le gel et faites tremper la membrane, le papier filtre et les papiers filtres dans le tampon de transfert pendant 15 min. Utilisez des membranes en nitrocellulose ou en PVDF. Si vous utilisez des membranes PVDF (polyvinylidene difluorure), activez-les en les trempant dans 100 % de MetOH.
  4. Préparez le sandwich de gel dans la cassette pour un transfert semi-sec comme suit : Électrode négative/Papier filtre/Gel/Membrane nitrocellulosique/Papier filtre/Électrode positive. Éliminez toutes les bulles d’air entre le gel et la membrane pour assurer de bons résultats.
  5. Placez la cassette dans l’unité semi-sèche et faites fonctionner le transfert à 25 V pendant 30 min. À la fin, démontez le sandwich de transfert et stockez la membrane pour le test immunologique. Vérifiez l’efficacité du transfert avec la coloration Ponceau. Marquez la membrane avec un signe en haut à droite pour préserver la bonne orientation du filtre.
  6. Incuber avec des anticorps primaires et secondaires selon l’expérience (Figure 2).

Résultats

Sur la figure 1A, il est possible d’observer comment les protéines d’histones migrent dans un gel 1D. Il s’agit d’une étape préliminaire importante pour comprendre le temps de fonctionnement de la première dimension. Une fois que le bon moment de séparation est déterminé, exécutez la deuxième dimension. La carte 2D des protéoformes d’histones montre un motif topographique distinctif (Figure 1B). Chaque point de la figure 1B représente un type d’histone spécifique. Observez la région exacte du gel où se trouve chaque histone protéoforme. L’identification par spectrométrie de masse de chaque histone protéoforme est rapportée dans Perri et al.32. Par conséquent, chaque tache de cette condition est associée à un type d’histones spécifique. La présence de taches supplémentaires, à côté des taches canoniques, peut indiquer l’existence de nouvelles modifications. Les images sur gel peuvent être acquises à l’aide de la densitométrie, et l’image résultante peut être analysée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

La fiabilité de la carte TAU 2D dépend de la rotondité du spot. Si la course a été effectuée correctement, les taches apparaîtront comme des signaux distincts et aucune traînée horizontale ou verticale ne sera visible. À l’inverse, les impuretés dans l’échantillon, les solutions et la superposition d’agarose peuvent provoquer des stries et/ou des rayures dans le gel. La qualité du gel aura un impact sur la numérisation de l’image et l’analyse quantitative et qualitative qui s’ensuit. De plus, cela pourrait influencer le succès de l’analyse Western Blot et des investigations sur la SEP. Pour vérifier la fiabilité de la méthode, nous avons sondé la membrane nitrocellulosique des protéoformes d’histones résolues avec l’anticorps primaire Acetylated-Lysine (Ac-K2-100) Rabbit mAb32 (Figure 2). Un anticorps secondaire HRP anti-lapin a été utilisé pour détecter les signaux d’histones. Comme prévu, à l’aide d’un densitomètre, il est possible de quantifier la modification post-traductionnelle particulière sur chaque variante d’histones présente dans le blot.

figure-results-1
Figure 1 : TAUgel 1D et 2D. (A) Image représentative du motif topographique des histones obtenue à l’aide du TAUgel 1D. (B) Image représentative du motif topographique des histones obtenue à l’aide de TAUgel 2D. Les identifications de données sont rapportées par Perri et al. 32. Comme prévu, chaque tache représente une histone protéoforme spécifique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Transfert Western représentatif du 2DTAU. Sur l’image, il est possible d’observer le niveau d’acétylation de la lysine dans chaque histone protéoforme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

RéactifsConcentration : 15 %
40 % Acrylamide/Bis3.75
1,5 M Tris pH 8,82,5 ml
Eau MilliQ3,6 ml
10 % FDS100 μL
10 % APS50 μL
TEMED5 μL

Tableau 1 : Composition de la solution de gel de résolution.

PasHeure
Fixation 50 % méthanol / 5 % acide acétique1 h
Lavage 30 % éthanol2 x 20 min
Laver l’eau déminéralisée1 x 20 min
Réactif de thiosulfate sensibilisant1 minute
Laver l’eau déminéralisée3 x 20 s
Argent Nitrate d’argentDurée : 30 minutes
Laver l’eau déminéralisée3 x 1 min
Développeur de développement25-30 min Remarque : Développer le gel jusqu’à ce que les taches soient visibles (brun clair)
solution d’arrêt1 x 10 min
Laver l’eau déminéralisée2 x 5 min
Laver l’eau déminéralisée1 h

Tableau 2 : Méthode de coloration à l’argent.

Discussion

Au cours de la dernière décennie, le traitement des patients atteints de cancer a été révolutionné par l’identification de diverses altérations moléculaires qui stimulent le développement et la progression du cancer. L’avancée la plus significative en oncologie moderne est le développement d’une thérapie basée sur une analyse moléculaire complète. Les progrès technologiques en génomique et en protéomique ont joué un rôle crucial dans le profilage de biomarqueurs spécifiques pour la détection précoce, la surveillance, le pronostic et la surveillance des médicaments. La protéomique est définie comme l’analyse du complément protéique complet d’une cellule, d’un tissu ou d’un organisme dans une condition particulière, et elle comprend également l’étude des interactions protéiques, des modifications post-traductionnelles et de la localisation34. Un domaine spécifique de la protéomique est l’épi-protéomique, qui implique l’étude systématique des modifications post-traductionnelles des histones. Ceux-ci ont été liés au développement et à la progression du cancer35. L’article décrit une méthode pour identifier des isoformes d’histones spécifiques qui contribuent au phénotype cellulaire.

L’étape critique de la méthode est l’extraction des histones en raison de leur faible solubilité et de leur basicité élevée. Ses principales limites sont la complexité de la carte 2D et le faible nombre de variantes, ce qui peut rendre l’analyse MS/MS difficile.

Dans l’ensemble, le principal avantage de cette approche est qu’elle peut être mise en œuvre dans n’importe quel laboratoire, et qu’un mini appareil en gel peut être possédé avec les précautions appropriées. Dans ce contexte, nous sommes convaincus que cette méthode pourrait aider un grand nombre de scientifiques, tels que ceux qui ne peuvent pas bénéficier d’une grande installation dans leur établissement, à identifier de nouveaux épi-marqueurs, dans le but d’améliorer la connaissance de l’épi-protéome. De plus, cette méthode peut être combinée à la spectrométrie de masse, qui peut être externalisée en tant que service, pour découvrir de nouvelles protéoformes. Il peut également être utilisé avec des tests immunologiques pour confirmer les changements dans une modification post-traductionnelle spécifique pour laquelle un anticorps commercial est disponible.

La méthode a été utilisée pour étudier les changements typiques dans les modifications des histones liées au développement du cancer du sein28et pour examiner les modifications de H1 dans les cellules souches embryonnaires de souris36. De plus, la méthode a été utilisée avec succès pour mesurer le niveau de carbonylation des histones37 dans les fibroblastes à croissance rapide et pour explorer de nouvelles modifications des histones, telles que la glycation des histones et la MARylation des histones38.

De notre point de vue, nous sommes convaincus que cette méthode peut être appliquée avec succès pour profiler de nouvelles PTM d’histones, en particulier celles associées à l’activation anormale de voies métaboliques spécifiques, telles que l’acétylation, la malonylation, la méthylation, la lipidation, la lactylation, la butylation, etc. En fin de compte, la méthode pourrait également servir d’outil micro-préparatif pour isoler les protéoformes individuelles et pourrait faciliter l’analyse des PTM liées au métabolisme, améliorant ainsi notre compréhension de ce domaine de recherche crucial.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Le travail a été soutenu par PRIN2022, DS, CF et AC ont été soutenus par PRIN2022, et MLC a été soutenu par le programme de doctorat en oncologie moléculaire, école de programme de doctorat UMG. Le travail a également été soutenu par le projet PNRR INSIDE CUP : B83C22003920001

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,4-DithioérythritolSIGMA- ALDRICHD8255  ;Réactif pour l’entretien &minus ; les groupes SH à l’état réduit ; réduit quantitativement les disulfures.
1,5 M Tampon Tris-HCL, pH 8,8BIO-RAD161-0798Gel résolvant Tampon
10x Tris/Glycine/SDS  ;BIO-RAD  ;1610772Utilisez ce tampon de course Tris/glycine/SDS prémélangé 10x pour séparer les échantillons de protéines par SDS-PAGE.
2-PropanolSIGMA-ALDRICH33539Le 2-Propanol (Isopropanol) est un alcool secondaire. Il a été testé comme substitut du carburant pour une utilisation dans diverses piles à combustible. La poudre de CuO dissoute dans du 2-propanol a été utilisée pour la synthèse assistée par ablation laser de colloïdes de Cu. La suspension de 2-propanol avec du Zn(NO3)2 a été utilisée pour la fabrication de photoanode en acier inoxydable revêtue de dioxyde de titane (P25-TiO2/SS) recouverte d’une couche uniformément épaisse de P25-TiO2.Cette photoanode a été utilisée pour le processus de dégradation photocatalytique électrochimique (ECPC).
30 % Acrylamide/Bis Solution  ;BIO-RAD16101582,6 % de réticulant. Réactif de pureté d’électrophorèse  ;
Acide acétique GlacialCarlo Erba Reagennts401392L’acide acétique est un réactif chimique important avec de nombreuses applications industrielles.
AcétonePanreac Applichem211007.1214Acétone  ; est un solvant, réputé pour sa polyvalence dans diverses applications de laboratoire, de fabrication et de nettoyage.
AcétonitileVWR83640320pour HPLC  ;   ; Agarose de qualité LC-MS
Invitrogen15510-027Agarose  ; est a  ; hétéropolysaccharide  ; Fréquemment utilisé en biologie moléculaire.
Bicarbonate d’ammoniumSIGMA-ALDRICHA6141minimum 99,0 %
Persulfate d’ammoniumSIGMA-ALDRICHA3678Pour la biologie moléculaire, Pour l’électrophorèse, &ge ; 98 %  ;
Bioruptor plusDiagenodeB01020001 - B01020002- B01020003sonicateur
DithiothreitolSIGMA- ALDRICHD9163-5GAgent réducteur utilisé pour réduire les liaisons disulfure dans les protéines.
Kit de teinture à l’argent Dodeca  ;BIO-RAD161-0480Le kit de coloration à l’argent Dodeca est facile à utiliser pour la détection des niveaux non agrammiques de protéines dans les gels de polyacrylamide.
GlycérolGE - Soins de santé Sciences de la vie171325010LLe glycérol est un composé triol simple, il est impliqué pour aider à la coulée des gels de gradient, stabilisateur de protéines et composant tampon de stockage.
Inhibiteur de la phosphatase Stop  ;Thermo SCIENTIFIC78428Le cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase Thermo Scientific Halt préserve l’état de phosphorylation des protéines pendant et après la lyse cellulaire ou l’extraction des protéines tissulaires  ; Cocktail à usage unique (100X).  ;   ;
Inhibiteur de la protéase Stop  ;Thermo SCIENTIFIC78430Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) sont des solutions mères concentrées prêtes à l’emploi d’inhibiteurs de protéase à ajouter aux échantillons pour prévenir la dégradation protéolytique lors de la lyse cellulaire et de l’extraction des protéines. Cocktail à usage unique (100X).  ;   ;
Acide chlorhydriqueSIGMA-ALDRICHH1758BioRéactif, pour la biologie moléculaire
IodoacétamideSIGMA-ALDRICHI6125&ge ; 99 % (RMN), cristall
KClSIGMA-ALDRICHP9541Chlorure de potassium, KCl, est  ; Généralement utilisé dans les routines de laboratoire. Son utilisation comme tampon de stockage pour les électrodes de pH et comme solution de référence pour les mesures de conductivité est bien établie.
Lignée cellulaire MCF10ATCCCRL-10317  ;lignée cellulaire épithéliale isolée en 1984 à partir de la glande mammaire d’une femme blanche de 36 ans aux seins fibrokystiques. Cette lignée cellulaire a été déposée par la Michigan Cancer Foundation.
MgCl2SIGMA-ALDRICH208337Le chlorure de magnésium est un solide cristallin incolore.
N,N,N',N'-Tétraméthyléthylène-diamineSIGMA-ALDRICHT9281Pour l’électrophorèse, environ 99
Tampon salin phosphaté 1XCorning153736311 X PBS (solution saline tamponnée au phosphate) est  ; un tampon  ; solution saline équilibrée  ; Utilisé pour diverses applications biologiques et de culture cellulaire, telles que le lavage des cellules avant la dissociation, le transport de cellules ou de tissus, la dilution de cellules pour le comptage et la préparation de réactifs.
Hexacyanoferrate de potassiumSIGMA-ALDRICH60299Accepteur d’électrons, utilisé dans les systèmes impliquant le transport d’électrons,
solution SDS 20 % (p/v)  ;BIO-RAD161-0418Dodécylsulfate de sodium. Réactif de pureté d’électrophorèse  ;
Thiosulfate de sodium, ReagentPlus 99 %SIGMA- ALDRICH21,726-3Thiosulfate de sodium, ReagentPlus 99
 % Acide sulfuriqueSIGMA-ALDRICH339741Acide sulfurique, réactif, est  ; Un acide extrêmement corrosif qui se présente sous la forme d’un liquide jaunâtre légèrement visqueux. Il est soluble dans l’eau et est un acide diprotique. Il a de très fortes propriétés corrosives, déshydratantes et oxydantes en plus d’être hygroscopique.
Acide trichloracétiqueSIGMA-ALDRICHT6399-5GL’acide trichloracétique (TCA) est  ; Utilisé comme réactif pour la précipitation des protéines 1,2 et des acides nucléiques 3.  ;
Acide trifluoroacétiqueRiedel-de Haë ; n34957Acide trifluoroacétique
Triton X-100SIGMA- ALDRICHT9284-1LTriton X-100 est un tensioactif polyoxyéthylène non ionique qui est le plus fréquemment utilisé pour extraire et solubiliser les protéines.
Trypsine du pancréas porcinSIGMA-ALDRICHT6567Qualité protéomique, BioRéactif, Urée diméthylée
SIGMA-ALDRICH33247L’urée est un agent chaotrope et est utilisée pour la dénaturation des protéines. Il perturbe les liaisons hydrogène dans la structure secondaire, tertiaire et quaternaire des protéines. Il peut également perturber la liaison hydrogène présente dans la structure secondaire de l’ADN
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Références

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Mots-clés

lectrophor se bidimensionnellePTM des histonesSpectrom trie de masseStructure de la chromatineSDS PAGEDigestion in gelColoration au nitrate d argentModifications pig n tiques

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