Une approche de criblage à haut débit pour évaluer l’affinité de liaison des polluants environnementaux aux récepteurs nucléaires

Summary

Ce protocole décrit un système de criblage à haut débit qui utilise la polarisation de fluorescence d’une sonde fluorescente spécifique se liant à un récepteur nucléaire comme lecture pour le dépistage des polluants environnementaux.

Abstract

Des niveaux croissants de composés ont été détectés dans l’environnement, provoquant une pollution généralisée et posant des risques pour la santé humaine. Cependant, malgré leur forte présence dans l’environnement, il existe très peu d’informations concernant leurs effets toxicologiques. Il est urgent de développer des méthodes de criblage à haut débit (HTS) pour guider les études toxicologiques. Dans cette étude, un test de liaison récepteur-ligand à l’aide d’un système HTS a été mis au point pour déterminer le pouvoir de liaison des polluants environnementaux sur les récepteurs nucléaires. L’essai est effectué à l’aide d’un lecteur de microplaques (c’est-à-dire une plaque de 96 puits contenant divers produits chimiques) en mesurant la polarisation de fluorescence (FP) d’une sonde fluorescente spécifique. Ce test se compose de quatre parties : la construction et la transformation de vecteurs recombinants, l’expression et la purification de la protéine réceptrice (domaine de liaison au ligand), la liaison récepteur-sonde et la liaison compétitive des produits chimiques avec le récepteur. Le pouvoir de liaison de deux polluants environnementaux, l’acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) et le phosphate de triphényle (TPHP), avec le récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPARγ) a été déterminé pour illustrer la procédure d’essai. Enfin, les avantages et les inconvénients de cette méthode et ses applications potentielles ont également été abordés.

Introduction

Un grand nombre de produits chimiques ont été largement détectés dans l’environnement et le corps humain, ce qui soulève d’importantes préoccupations quant à leur impact sur l’environnement écologique et la santé humaine ^1,2,3. Malgré leur forte présence dans l’environnement, les informations concernant leurs effets toxicologiques sont rares. Par conséquent, il est urgent de développer des méthodes de criblage à haut débit (HTS) pour faciliter l’évaluation de la toxicité chimique.

Plusieurs méthodes de dépistage à haut débit (HTS) ont été signalées pour l’évaluation de la toxicité chimique, telles que les bioessais HTS utilisés dans les programmes Tox21 et ToxCast ^4,5. Ces méthodes permettent d’identifier rapidement les toxiques potentiels et de fournir des informations précieuses sur les mécanismes de toxicité chimique. Cependant, ces bioessais HTS reposent principalement sur des systèmes cellulaires, qui peuvent être complexes et coûteux. De plus, des méthodes de séquençage à haut débit ont également été utilisées pour l’évaluation de la toxicité chimique, mais l’évaluation à haut débit des produits chimiques reste difficile⁶. Des études antérieures ont mis au point des tests de liaison compétitive récepteur-ligand basés sur la polarisation de fluorescence (FP) pour déterminer le pouvoir de liaison de plusieurs polluants environnementaux, y compris les substances per- et polyfluoroalkylées (PFAS)^7,8,9, le bisphénol A (BPA)^10,11 et les matières particulaires (PM)¹², avec des récepteurs nucléaires tels que le récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR)^7, 8,9,10,13, récepteur farnésoïde X (FXR)^11,12 et récepteur thyroïdien (TR)^14,15. Cette approche est efficace, rentable et fournit des informations mécanistes.

Dans cette étude, le protocole de l’essai de liaison récepteur-ligand est décrit sur la base de la détection de la polarisation de fluorescence (FP) d’une petite sonde fluorescente. Le principe de l’essai de liaison récepteur-ligand basé sur la FP est illustré à la figure 1. Lorsqu’une petite molécule fluorescente est excitée par une lumière polarisée dans un plan, la lumière émise devient fortement dépolarisée en raison de la rotation moléculaire rapide. Cependant, lorsque le traceur se lie à un récepteur plus grand, sa rotation est ralentie. Une valeur FP élevée est détectée lorsque le traceur est lié au grand récepteur, tandis qu’une faible valeur FP est observée lorsque le traceur est libre. Le récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPARγ) a été purifié pour la liaison de la sonde au récepteur. La rosiglitazone (Rosi), l’acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) et le phosphate de triphényle (TPHP) ont été utilisés pour rivaliser pour la liaison de la sonde avec le récepteur. Rosi, un agoniste spécifique de PPARγ, a été utilisé comme témoin positif dans les essais de liaison compétitive des récepteurs. De plus, le PFOS et le TPHP ont déjà été identifiés comme des agonistes faibles du PPARγ dans des études antérieures 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. De plus, ils appartiennent à différentes catégories structurelles de composés connus pour leur exposition environnementale et se distinguent par leurs taux de détection relativement élevés dans les populations humaines. Ces composés ont été utilisés pour valider davantage l’applicabilité générale de l’essai de liaison à la concurrence. La procédure comprend quatre étapes : la construction et la transformation des vecteurs recombinants, l’expression et la purification de la protéine réceptrice (domaine de liaison ligand), la liaison récepteur-sonde et la liaison compétitive des produits chimiques avec le récepteur.

Protocol

Les détails des réactifs et de l’équipement sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Construction et transformation de vecteurs recombinants

REMARQUE : PPARγ est un facteur de transcription dépendant du ligand avec une structure de récepteur nucléaire classique, comprenant un domaine de liaison à l’ADN qui régule les gènes cibles et un domaine de liaison au ligand activé par les ligands. Lors de l’activation du ligand, PPARγ forme un hétérodimère avec un autre récepteur nucléaire, le récepteur rétinoïde X (RXR), et se lie aux éléments de réponse de PPARγ, régulant ainsi la transcription des gènes cibles en aval ^9,16.

1. Concevoir des amorces pour le PPARγ-LBD (voir le tableau 1) et amplifier le segment d’ADN du PPARγ-LBD (voir le tableau 2 et le tableau 3).
2. Linéariser le vecteur pET28a marqué His×6 en le digérant avec les endonucléases de restriction XhoI et BamHI¹⁸.
3. Clonez le segment d’ADN PPARγ-LBD dans le vecteur pET28a marqué His×6 à l’aide du kit de clonage disponible dans le commerce, ce qui permet d’obtenir le plasmide recombinant pET28a-PPARγ-LBD-6×His¹⁸.
4. Transfectez le plasmide d’expression recombinant pET28a-PPARγ-LBD-6×His dans des cellules BL21 (DE3) d’Escherichia coli pour l’expression de la protéine¹⁸.
5. Ajouter 5 μL du vecteur recombinant aux cellules BL21(DE3) compétentes, incuber sur la glace pendant 30 min, effectuer un choc thermique à 42 °C pendant 45 s, puis retourner immédiatement dans la glace.
6. Ajouter 900 μL de milieu LB, agiter à 37 °C pendant 1 h (160-200 tr/min), puis centrifuger à ~3000 x g pendant 5 min à température ambiante.
7. Jeter le surnageant, remettre la pastille bactérienne en suspension dans 100 μL de milieu LB et l’étaler sur un milieu solide. Retournez les plaques et cultivez à 37 °C pendant 12 à 16 h.
8. Sélectionner des colonies individuelles pour l’identification du séquençage et l’expression et la purification ultérieures des protéines.

2. Expression et purification de la protéine réceptrice

1. Incuber les cellules BL21 (DE3) transformées dans un milieu de 200 mL LB complété par 100 μg/mL d’ampicilline sur un agitateur orbital (230 tr/min) pendant 1 à 2 h à 37 °C.
2. Induire les cellules lorsque l’OD₆₀₀ atteint 0,4-0,6 unités d’absorbance en ajoutant 10 μM d’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) et incuber à 16 °C pendant 16 h.
3. Recueillir la suspension bactérienne et centrifuger à 8000 × g, 4 °C, pendant 10 min.
4. Lyser les cellules dans un tampon de lyse soluble de 20 mL (50 mM de NaH₂PO₄, 300 mM de NaCl, 10 mM d’imidazole, pH 8,0), en ajoutant 200 μL de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et 200 μL de lysozyme. Remettre la pastille bactérienne en suspension à l’aide d’une pipette de 5 mL, puis procéder à la sonication à 30 % de puissance pendant 20 min.
5. Ajouter un tampon de lyse égal à 5 fois le volume de la colonne pour équilibrer la colonne de nickel. Répétez ce processus deux fois et mettez-le de côté.
6. Centrifuger la suspension bactérienne soniquée à 8000 × g pendant 15 min à 4 °C pour obtenir le lysat surnageant bactérien (CL).
7. Chargez le CL sur la colonne de nickel (pour l’adsorption des protéines) pour obtenir le flux continu (FT).
8. Laver la colonne avec 5 fois le volume de la colonne de tampon de lavage (50 mM de NaH₂PO₄, 300 mM de NaCl, 20 mM d’imidazole, pH 8,0) pour obtenir l’éluat de lavage (W1-W6).
9. Laver la colonne avec 1 mL de tampon d’élution (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8,0) pour éluer la protéine cible et obtenir les fractions protéiques (E1-E5).
10. Prélever une aliquote de 20 μL de chaque fraction (CL, FT, W1-W6 et E1-E5) et analyser à l’aide de la norme SDS-PAGE¹⁸ avec coloration au bleu brillant de Coomassie. PPARγ-LBD fonctionne sous la forme d’une protéine de 34,9 kDa sur un gel dénaturant.

3. Essai de liaison au récepteur

REMARQUE : Dans cet essai, C1-BODIPY-C12 a été utilisé comme sonde fluorescente spécifique au site pour établir le système de liaison récepteur-ligand. C1-BODIPY-C12, un ligand spécifique de PPARγ, est un analogue fluorescent de l’acide gras avec le groupe fluorescent BODIPY incorporé dans l’acide gras en position C1.

1. Diluer le PPARγ-LBD humain purifié dans un tampon Tris-HCl (20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 8,0) jusqu’à une plage de concentration de 1 nM à 6400 nM. Diluez également la sonde C1-BODIPY-C12 dans un tampon Tris-HCl à une concentration de 50 nM.
2. Mélanger la solution diluée de PPARγ-LBD (55 μL par puits) et la solution de sonde C1-BODIPY-C12 (55 μL par puits) dans une plaque noire de 96 puits. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
3. Mesurez la polarisation de fluorescence (FP) avec le lecteur de microplaques.
4. Tracez les valeurs FP en fonction de la concentration du récepteur, ajustez la courbe à l’aide de la liaison spécifique avec l’équation de pente de Hill à l’aide d’un logiciel statistique et graphique, et calculez la valeur_{K d} .

4. Essai de liaison concurrentiel

REMARQUE : Dans ce test, 800 nM de PPARγ-LBD humain et 50 nM de sonde C1-BODIPY-C12 ont été utilisés pour la liaison au récepteur. La rosiglitazone (Rosi), le phosphate de triphényle (TPHP) et l’acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) ont été utilisés pour concurrencer la liaison de la sonde au PPARγ.

1. Diluer les trois composés dans le tampon Tris-HCl dans une plage de concentration de 0 à 200 μM.
2. Préparer la solution de liaison récepteur-sonde avec une concentration finale de 800 nM de PPARγ-LBD humain et de 50 nM de sonde C1-BODIPY-C12.
3. Mélangez la solution de liaison récepteur-sonde (55 μL par puits) et la solution composée (55 μL par puits) dans une plaque noire à 96 puits. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
4. Mesurez la polarisation de fluorescence (FP) avec le lecteur de microplaques.
5. Tracez les valeurs FP en fonction de la concentration du ligand. Obtenir la concentration inhibitrice demi-maximale (CI₅₀) de chaque ligand de la courbe de compétition à l’aide du modèle sigmoïdal traité par un logiciel de graphisme et d’analyse.

Results

Expression protéique et purification de PPARγ-LBD
PPARγ-LBD a été exprimé de manière hétérologue dans BL21 (DE3) sous la forme d’une protéine marquée à l’histidine. La protéine a été détectée dans les fractions solubles, et le PPARγ-LBD purifié a montré une seule bande sur SDS-PAGE avec une masse moléculaire apparente d’environ 34,9 kDa (figure 2), ce qui correspond à la masse moléculaire prédite de la protéine.

La liaison de la sonde C 1-BODIPY-C₁₂ au PPARγ-LBD
Dans le test de liaison aux récepteurs, C1-BODIPY-C12, un acide gras marqué par BODIPY qui peut se lier au PPARγ-LBD, a été utilisé comme sonde de fluorescence pour étudier le pouvoir de liaison des polluants environnementaux avec hPPARγ-LBD. Comme le montre la figure 3A, les valeurs de polarisation de fluorescence (FP) sont passées de 20 à 250 lors de l’ajout de PPARγ-LBD, indiquant la liaison de C1-BODIPY-C12 au récepteur. La courbe de liaison a atteint la saturation à 800 nM PPARγ-LBD, avec une constante de dissociation (K_d) de 253,5 nM ± 10,05 nM. Par conséquent, 800 nM PPARγ-LBD a été choisi pour les essais de liaison compétitive ultérieurs.

La liaison compétitive des polluants environnementaux au PPARγ-LBD
La rosiglitazone (Rosi), un agoniste spécifique de PPARγ, a été utilisée comme témoin positif pour déplacer la sonde fluorescente dans les essais de liaison compétitive des ligands. Comme le montre la figure 3B, Rosi a inhibé la liaison de la sonde C1-BODIPY-C12 à PPARγ-LBD de manière dose-dépendante, avec une IC₅₀ de 6,89 μM, démontrant la faisabilité du test. Ensuite, les affinités de liaison du TPHP et du PFOS au PPARγ-LBD ont été déterminées. Comme le montre la figure 3C, D, le TPHP et le PFOS ont également inhibé la liaison de la sonde C1-BODIPY-C12 au PPARγ-LBD de manière dose-dépendante, avec des valeurs IC₅₀ de 60,45 μM et 37,27 μM, respectivement.

Figure 1 : Illustration schématique des essais de liaison compétitive des récepteurs basés sur la polarisation de fluorescence (FP). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse SDS-PAGE du PPARγ-LBD purifié. M est le marqueur de poids moléculaire de la protéine. Cl est le lysat cellulaire, FT est la fraction à écoulement, W1-W6 sont les solutions de lavage, E1 est l’éluat et E2-E4 sont les protéines PPARγ-LBD purifiées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Courbe de liaison du récepteur basée sur la polarisation de fluorescence (FP) et courbes de liaison compétitives. (A) Courbe de liaison basée sur FP de C 1-BODIPY-C₁₂ à PPARγ-LBD humain. (B-D) Courbes de liaison compétitives basées sur FP de Rosi, TPH et PFOS au PPARγ-LBD humain. Les barres d’erreur désignent l’écart-type (ET) pour trois expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

ID	Suiv
pET28a-Humain PPARG-P1	CAAATGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-PPARG-P2 humain	GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
Séquence nucléotidique PPARγ-LBD	AGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGAT ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCAGCAGCGGCCTG GTGCCGCGCGGGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA TGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC CTCCGGGCCCTGGCAAAACATTTGTATGACTCATACATAAAGTCCTTCC CGCTGACCAAAGCAAAGGCGAGGGCGATCTTGACAGGAAAGACAACA GACAAATCACCATTCGTTATCTATGACATGAATTCCTTAATGGGAGA AGATAAAATCAAGTTCAAACACATCACCCCCCTGCAGGAGCAGAGCAA AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTCAGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGTGG AGGCTGTGCAGGAGATCACAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTTTG TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAATATGGAGTCCA CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCTCCTTGATGAATAAAGATGGGGT TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCCAAGGCTTTTAAAG AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA TATTTATTGCTGTCATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTGCTGAA TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAAGACAACCTGCTACAAGCCCTGG AGCTCCAGCTGAAGCTGAAGCTGAACCCTGAGTCCTCACAGCTGTTTG CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCTCAGACAGATTGTCACGGA ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGAAGACGGAAACCGACATG AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTACAAGGACTTGGACTGG CTCGAGGCCACCCACCC

Tableau 1 : La séquence d’amorces et de nucléotides du domaine de liaison au ligand PPARγ.

Noms des réactifs expérimentaux	Volume/Dose
pET28a-Humain PPARG-P1	1 μL
pET28a-PPARG-P2 humain	1 μL
2×phanta Max Master Mix	12,5 μL
ADNc	2 μL
jjH2O	8,5 μL

Tableau 2 : Système de réactifs expérimentaux PCR.

Noms des expériences	Température	Heure
Pré-dénaturation	95 °C	3 minutes
Dénaturation	95 °C	15 s
Recuit	65 °C	15 s
Extension	72 °C	Durée : 6 minutes
Boutique	12 °C	--

Tableau 3 : Programme de réaction expérimentale par PCR.

Discussion

La polarisation de fluorescence (FP), la résonance plasmonique de surface (SPR) et la résonance magnétique nucléaire (RMN) sont des techniques couramment utilisées pour évaluer les interactions de liaison directe entre les protéines et les composés^19,20. La PF a été largement utilisée dans l’étude des interactions moléculaires pour la découverte de médicaments et le criblage chimique 21,22,23. En comparaison, les tests SPR et RMN sont coûteux et prennent du temps, ce qui les rend moins adaptés aux applications de criblage à haut débit (HTS). Ce protocole décrit une méthode d’analyse récepteur-ligand basée sur la PF avec un système de détection de plaques multipuits, permettant le HTS des produits chimiques.

Le choix de la sonde appropriée pour un test de liaison au récepteur est crucial. La sonde doit être composée de deux composants : un ligand spécifique pour le récepteur nucléaire et un groupe fluorescent. En règle générale, de telles sondes peuvent être obtenues dans le commerce, comme l’illustre la sonde C1-BODIPY-C12 utilisée dans cette étude. C1-BODIPY-C12 est un analogue fluorescent de l’acide gras, avec le groupe fluorescent BODIPY incorporé en position C1, et est un ligand spécifique de PPARγ. Si une sonde fluorescente disponible dans le commerce n’est pas une option, elle doit être synthétisée chimiquement en attachant un groupe fluorescent à un ligand spécifique connu.

La structure classique d’un récepteur nucléaire comprend un domaine de liaison à l’ADN responsable de la régulation de l’expression du gène cible et un domaine de liaison au ligand (LBD), généralement situé à l’extrémité C-terminale²⁴ du récepteur. Le site de liaison du corégulateur se trouve généralement dans le domaine de la fonction d’activation transcriptionnelle du récepteur nucléaire, où il interagit avec les facteurs de corégulation nucléaire²⁵. Ces corégulateurs peuvent augmenter ou supprimer l’activité transcriptionnelle du récepteur, modulant ainsi l’expression des gènes. La DCL, située dans une région spécifique de la protéine réceptrice, régule les changements conformationnels du récepteur lors de la liaison du ligand, qui à son tour active ou inhibe son activité transcriptionnelle. Étant donné que le LBD est un domaine bien défini crucial pour la reconnaissance et la liaison de ligands spécifiques de petites molécules²⁴, seul le receptor-LBD a été utilisé dans le test de liaison compétitive du récepteur dans cette étude. Cette approche, qui impliquait l’expression et la purification du domaine de liaison au ligand de PPARγ, a permis de réduire les coûts de dosage.

Les réactifs utilisés dans cette méthode, y compris les tampons pour la purification des protéines, la sonde C1-BODIPY-C12 et le Tris-HCl, sont disponibles dans le commerce et peu coûteux, ce qui constitue un avantage significatif pour le test. La détection par polarisation de fluorescence (FP) est effectuée dans une plaque multipuits (96 puits ou 384 puits), avec un temps de lecture rapide de 3 à 5 minutes par plaque, ce qui améliore le débit et l’efficacité des tests. L’approche de liaison récepteur-ligand est très flexible et peut être facilement adaptée à divers récepteurs, à condition que les protéines réceptrices soient disponibles. Cette adaptabilité élargit le champ des recherches qui peuvent être menées à l’aide de cette méthode. Dans l’ensemble, la combinaison de ces avantages - facilité d’utilisation, rentabilité, capacité de débit élevée, traitement rapide et flexibilité dans l’adaptation des récepteurs - fait de cette méthode une option prometteuse pour le dépistage des polluants environnementaux toxiques.

Les résultats actuels démontrent que le PFOS et le TPHP peuvent se lier au PPARγ, ce qui est cohérent avec les résultats antérieurs des essais d’amarrage moléculaire et de gènes rapporteurs ^9,26. De plus, la méthode décrite dans ce manuscrit a été utilisée pour évaluer le pouvoir de liaison de plusieurs polluants environnementaux avec les récepteurs nucléaires. Par exemple, à l’aide de l’essai de liaison compétitive récepteur-ligand basé sur le FP, le pouvoir de liaison de 19 substances per- et polyfluoroalkylées (PFAS) et de 7 composés bisphénols A (BPA) au récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes β/δ (PPARβ/δ)^7,10, 12 PFAS au PPARγ ^9,13, 7 composés BPA et 3 composants de matières particulaires (PM_2,5) au récepteur farnésoïde X (FXR)^{11, 12} et 8 polybromodiphényléthers (PBDE) et 6 polychlorobiphényles (PCB) dans le récepteur thyroïdien (TR)^14,15 ont été déterminés. Ces résultats mettent en évidence le potentiel de cette méthode pour cribler les interactions de liaison entre les polluants environnementaux et les récepteurs nucléaires.

Des études antérieures ont rapporté des méthodes de dosage de polarisation de fluorescence (FP) pour PPARγ qui impliquent l’utilisation de la filtration sur gel pour mesurer la liaison, ce qui nécessite au moins 1,5 h pour détecter la liaison d’un seul composé²³. En revanche, cette méthode permet de détecter des affinités de liaison pour au moins 12 composés avec PPARγ en 10 min. De plus, certains kits d’analyse disponibles dans le commerce (voir la Table des matériaux) coûtent plus de 3000 $ pour un format de 800 × 20 μL. Ces méthodes sont particulièrement coûteuses et prennent beaucoup de temps. Cette étude présente des améliorations par rapport à ces méthodes existantes.

L’une des limites potentielles de cette méthode est que la sonde de fluorescence doit être un ligand du récepteur, et que les sondes de fluorescence n’interagissent pas directement avec les polluants environnementaux. Par conséquent, il est crucial de s’assurer que la sonde et les polluants environnementaux sont séparés dans la solution. De plus, ce test reflète une situation in vitro et ne peut pas capturer entièrement les interactions in vivo , car les récepteurs sont hétérodimériques in vivo²⁷. Par conséquent, bien que cette méthode serve d’outil de dépistage rapide, une étude plus approfondie de l’activation des récepteurs et des mécanismes toxicologiques associés in vivo est nécessaire.

Un autre inconvénient est le phénomène de « décalage vers la droite » observé dans les tests de polarisation de fluorescence (FP) lors de l’évaluation de l’affinité de liaison, ce qui peut conduire à une sous-estimation systématique des affinités mesurées. Dans des études antérieures, l’affinité de liaison de la rosiglitazone avec PPARγ a été évaluée à l’aide du test de transfert d’énergie de résonance de fluorescence résolu en temps (TR-FRET)²⁸, qui est une méthode très sensible pour mesurer l’affinité de liaison ligand-récepteur. Cependant, le test TR-FRET est relativement long et fastidieux, nécessitant une incubation de 4 heures de la solution réactionnelle à température ambiante avant la détection. Bien que le test FP présente une sensibilité plus faible que le test TR-FRET, il est plus adapté au criblage à haut débit de ligands environnementaux qui se lient aux récepteurs nucléaires. Néanmoins, le test FP peut manquer certains ligands environnementaux faibles. De plus, dans des études antérieures, l’affinité de liaison du SPFO avec le PPARγ a été déterminée à l’aide de la dialyse à l’équilibre (EqD)²⁹, une autre méthode très sensible pour mesurer l’affinité de liaison ligand-récepteur. Cependant, l’EqD s’appuie sur des équipements analytiques coûteux (LC-MS/MS), ce qui limite son application et exclut les capacités de criblage à haut débit.

Bien que ce test de polarisation de fluorescence (FP) présente un phénomène de « décalage vers la droite », qui peut entraîner des valeurs de CI₅₀ généralement plus élevées, il n’affecte pas le classement d’affinité relative ni les prédictions ultérieures de l’évaluation des risques. De plus, le test FP est rentable, rapide et capable de cribler un large éventail de composés pour leur affinité envers plusieurs récepteurs nucléaires. Dans l’ensemble, le criblage à haut débit des ligands environnementaux basé sur la PF facilite l’identification rapide des polluants environnementaux toxiques.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C1-BODIPY-C12 Sonde	Thermo Fisher Scientific, Chine	102209-82-3	Se lie à PPAR&gamma ;-LBD et émet de la fluorescence.
Coomassie Brilliant Blue R-250	Solarbio, Chine	6104-59-2	Teindre les bandes protéiques.
Prisme GraphPad	Dotmatics		https://www.graphpad.com/features
imidazole	Solarbio, Chine	I8090	Préparez des tampons pour le processus de purification des protéines.
Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside	Solarbio, Chine	367-93-1	Induire l’expression de PPAR&gamma ;-LBD
Lecteur de microplaques	Biotek , USA	Synergy H1  ;	Détection de la valeur FP
NaCl	Shanghai Reagent	7647-15-5	Préparez des tampons pour le processus de purification des protéines.
NaH2PO4 · ; 2H2O	Shanghai Reagent	13472-35-0	Préparer des tampons pour le processus de purification des protéines.
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences, Chine	SA005005	Purification des protéines.
Origine 8.5  ;	OriginLab, Northampton, Massachusetts, États-Unis
Acide perfluorooctanesulfonique (PFOS)	J& K Scientific Ltd, Chine	1763-23-1	Les polluants environnementaux détectés
Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)	Solarbio, Chine	P0100	Inhibent la dégradation des protéines.
PPAR&gamma ;-Competitor Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	PV6136	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPAR&gamma ;-LBD Ligand Screening Assay Kit	Cayman	600616	https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)	aladdin, Chine	122320-73-4	Les agonistes de PPAR&gamma ;
Shaker	ZHICHENG, Chine	ZWY-211C	Expansion de la culture bactérienne et induction de l’expression protéique Phosphate de
triphényle (TPHP)	Macklin, Chine	T819317	Les polluants environnementaux détectés
Tris	Solarbio, Chine	T8230	Préparez des tampons pour le processus de purification des protéines.
Tryptone	OXOID Limited, Chine	LP0042B	Préparer le bouillon de lysogénie (LB) moyen.
Nettoyeur à ultrasons	Kimberly, Chine	LHO-1	Perturber les bactéries pour obtenir une lyse complète
Urea	Solarbio, Chine	U8020	Préparer des tampons pour le processus de purification des protéines.
Extrait de levure	OXOID Limited, Chine	LP0021B	Préparer le bouillon de lysogénie (LB) moyen.