Séparation des couches de granulosa du follicule préovulatoire aviaire et de cellules thèques pour les applications en aval

Les poules productrices d’œufs sont un élément clé de la chaîne d’approvisionnement alimentaire mondiale et constituent un modèle animal évolutif pour l’étude de la fertilité et du cancer de l’ovaire. Le poulet a une longue histoire d’utilisation en laboratoire, des études in ovo des vaccins antigrippaux¹ à l’étude de la croissance tumorale cancéreuse², et est un animal clé pour la compréhension du développement gonadique ^3,4,5. Comprendre le rôle du système reproducteur d’une poule, en particulier, la nature cyclique du développement folliculaire ovarien et les types de cellules impliquées, est un domaine de grand intérêt et d’application potentielle. Les approches multi-omiques pour interroger l’ovaire de la poule ont des applications pour augmenter le rendement agricole grâce à l’analyse de la productivité et à l’élucidation des facteurs de santé humaine par le biais de la poule comme modèle pour les maladies reproductives.

L’ovaire aviaire a des stades folliculaires de développement très distincts composés de (1) petits follicules primordiaux et primaires (>1 mm), (2) follicules de pré-recrutement de taille variable (blancs à jaune pâle, 2-8 mm) et (3) grands follicules préovulatoires remplis de vitellus (jaunes) (Figure 1)^5,6,7. Un ovaire aviaire sexuellement mature est composé d’un cortex externe qui abrite les follicules ovariens et de la moelle interne composée de muscles lisses, de nerfs et d’un système vasculaire⁸. L’ensemble du cycle de développement folliculaire se déroule dans le cortex. Cependant, ce n’est qu’à l’âge de cinq mois environ que seul l’ovaire gauche présente une hiérarchie de développement complète de follicules préovulatoires (c’est-à-dire jaunes), et que la poule subira sa première ovulation et ponte (ponte). Les follicules préovulatoires établissent une hiérarchie grossièrement visible d’environ 5 à 6 follicules qui vont du follicule le plus grand et le plus proche de l’ovulation - follicule F1 - au follicule le moins développé et le plus petit - F5 ou F6. Les follicules préovulatoires se distinguent facilement des follicules de pré-recrutement plus petits en raison de leur taille plus grande, de leur vaste innervation et de leur jaune foncé.

Tous les follicules contiennent des types de cellules spécialisées qui jouent des rôles variés dans la signalisation, la croissance et le développement du follicule au fur et à mesure qu’il progresse à travers les différentes étapes avant l’ovulation - il s’agit des cellules de la granulosa, des cellules thèques et des ovocytes (gamètes femelles) (Figure 2A). En particulier, les couches cellulaires de la granulosa créent la paroi interne du follicule, et les cellules de la thèque forment l’autre paroi entourant l’ovocyte. Au fur et à mesure qu’un follicule progresse dans la hiérarchie préovulatoire, les couches cellulaires de la thèque et de la granulosa commencent à s’amincir, en particulier le long d’un point directement situé en face de la tige du follicule préovulatoire. La tige est le point d’attache du follicule à l’ovaire (Figure 2B). Cette ligne des couches de la granulosa et de la thèque opposée à la tige s’appelle le stigmate (Figure 2C). Il est totalement dépourvu de système vasculaire et sera le point de rupture folliculaire lors de l’ovulation d’un follicule F1. Le disque germinal, ou la couche blanche duveteuse de cellules de soutien qui entoure l’ovocyte, est également visible (Figure 2B).

Les cellules de la granulosa et de la thèque sont des composants clés du développement du follicule, car elles entourent et soutiennent l’ovocyte grâce à une signalisation hormonale complexe. La couche cellulaire de la granulosa soutient les voies stéroïdogènes via la signalisation AMP cyclique (AMPc) pour provoquer la production de progestérone ^9,10,11. Les cellules thèques, quant à elles, produisent temporellement de l’œstradiol, ce qui est largement différent de celui des mammifères dont les cellules théques produisent des androgènes et de la progestérone 12,13,14. Associées à la signalisation externe, les cellules de la granulosa et de la thèque sont des moteurs cruciaux de la maturation des follicules et de la ponte. La technique de séparation des couches de la granulosa et de la thèque a été signalée pour la première fois par Gilbert et al. en 1977¹⁵. Obtenir une séparation complète des couches de la granulosa et de la thèque et s’assurer qu’aucun matériau de la granulosa ne reste peut présenter des difficultés avec la méthode Gilbert. De plus, l’absence d’un guide visuel clair pour effectuer la séparation peut rendre la tâche difficile à réaliser. Cette étude vise à décrire l’extraction et la séparation des couches de granulosa, de thèque et d’ovocytes des follicules préovulatoires, en offrant des adaptations et en fournissant une représentation visuelle claire à l’aide d’images et de vidéos (Figure 3). La visualisation de cette technique permettra aux scientifiques qui étudient les follicules ovariens aviaires de capturer de manière reproductible les couches de la granulosa et de la thèque pour les approches multi-omiques agricoles et biomédicales.

Tous les animaux utilisés dans cette étude ont été maintenus et euthanasiés conformément au protocole approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Delaware (IACUC Protocol 110R).

1. Préparation

1. Stérilisation
   1. Autoclave Bols en verre de 5 oz utilisant l’autoclave par gravité (121 °C pendant 20 min) recouverts d’une feuille d’aluminium avec du ruban autoclave sur le dessus pour maintenir et indiquer la stérilité.
      REMARQUE : Un bol sera nécessaire pour chaque follicule sur lequel la séparation est effectuée.
   2. Outils de dissection en autoclave utilisant l’autoclave par déplacement par gravité (121 °C pendant 20 min), y compris des ciseaux, des pinces courbes et des pinces droites dans les poches de stérilisation.
2. Mise en place de la zone de séparation
   1. Configurez la zone de séparation des follicules comme le montre la figure 4. Remplissez les récipients de stockage avec de la glace juste avant la séparation des follicules et remplissez-les si nécessaire tout au long du processus de séparation des follicules.
3. Solutions
   1. Diluer à 10x la concentration PBS pour 1x le stock de travail et placer au réfrigérateur à +4 °C la veille de la dissection.
   2. Diluer l’isopropanol à 70 % de la concentration de la matière première dans le flacon pulvérisateur.

2. Dissection

1. Euthanasier une femelle sexuellement mature.
   1. Choisissez une femelle sexuellement mature (elle doit pondre des œufs) et euthanasiez-le¹⁶ par une méthode approuvée (directives de l’AVMA) conformément au protocole de soins et d’utilisation de l’établissement, comme la luxation cervicale.
   2. Pour la capture du plus grand follicule F1, euthanasier l’animal dans les 4 premières heures suivant l’apparition de la lumière pour la journée. Palper le bas-ventre avant l’euthanasie pour confirmer la présence d’un œuf à coquille dure dans l’utérus ; Cela permet de s’assurer que la ponte et, par conséquent, la prochaine ovulation n’ont pas encore eu lieu.
2. Accédez à l’ovaire.
   1. Vaporisez la carcasse externe et les plumes avec 70 % d’isopropanol. Cela humidifie les plumes et nettoie le point d’incision.
   2. À l’aide de ciseaux de dissection et d’une main gantée, pincez et coupez une seule incision horizontale (transversale) de la ligne médiane d’environ 7,5 cm (3 pouces) de long. Pincez la peau, les muscles et les couches de graisse avant l’incision pour éviter la perforation des organes.
   3. Élargissez l’incision latéralement sur le côté droit de l’oiseau et sondez avec des doigts gantés pour pousser les organes viscéraux hors du chemin des ciseaux. Continuez jusqu’à ce que 2-3 des côtes de l’animal aient été coupées sur le côté droit.
   4. Élargissez l’incision vers le côté gauche de l’oiseau comme fait sur le côté droit. Procédez avec une prudence accrue car les follicules préovulatoires de l’ovaire sont situés ici, dépassent de la surface de l’ovaire et peuvent facilement se rompre. Utilisez une légère pression avec les doigts pour éloigner les follicules préovulatoires des ciseaux pendant que 2-3 côtes sont coupées sur le côté gauche de l’oiseau.
   5. Placez une main sur le bas-ventre de l’oiseau et l’autre fermement sur le dessous du sternum, et rétractez manuellement la poitrine de l’oiseau vers le haut pour permettre un accès supplémentaire à la cavité cœlomique de l’oiseau.
   6. En tenant chacune des cuisses de l’oiseau près de l’articulation du jarret, poussez-les manuellement vers l’arrière pour disloquer les deux articulations de la hanche simultanément. Il y a maintenant un accès complet à l’ovaire à la fois visuellement et spatialement.
3. Retirez les follicules préovulatoires.
   1. Effectuez toutes les étapes par une vue visuelle de routine. Si une personne a du mal à visualiser à n’importe quel stade, utilisez un microscope à dissection.
   2. En utilisant uniquement des doigts gantés, coupez doucement chaque follicule préovulatoire jaune visible et extrayez-le de l’ovaire. Pincez uniquement la tige pendant l’extraction pour aider à sectionner la tige. Ne pincez pas le follicule lui-même, sinon il pourrait se rompre.
   3. Placez chaque follicule dans le récipient stérile avec du PBS glacé.
   4. Laissez les follicules préovulatoires sur de la glace pendant au moins 5 minutes pour permettre la congélation du jaune. Le jaune chaud adhérera aux couches de cellules folliculaires environnantes, ce qui rendra les techniques de séparation ultérieures difficiles à réaliser.

3. Séparation en laboratoire

1. Prenez un follicule isolé du récipient stérile et remettez le récipient avec les follicules restants sur de la glace. Étudiez le follicule avant la manipulation, en prenant note de l’emplacement de trois caractéristiques : la tige, le stigmate et le disque germinatif (Figure 2).
2. Commencez par retirer la séreuse de la surface folliculaire. Roulez doucement le follicule sur une serviette en papier sèche pour enlever la couche séreuse, en la retirant doucement si nécessaire.
3. Tenez le follicule par la tige au-dessus du bol rempli de PBS. Utilisez la gravité pour visualiser où la tige se termine à la surface du follicule et, à l’aide de ciseaux, coupez uniquement la tige sans perforer la surface du follicule. Poursuivez l’ablation de la séreuse jusqu’à ce qu’elle ne soit plus visible.
4. À l’aide de la boîte lumineuse pour éclairer et du disque germinal comme référence, déplacez le stigmate du côté opposé et tenez doucement le follicule avec le côté du stigmate visible. Tenez le follicule directement au-dessus du bol de PBS glacé.
5. Prenez le scalpel, coupez doucement le long du stigmate et déposez immédiatement le follicule dans le PBS lorsque le jaune commence à tomber. Ne tenez pas le follicule fermement, car cela pousserait le jaune vers l’extérieur au lieu de le laisser tomber simplement par gravité.
6. À l’aide d’une paire de pinces à tissu droites non dentées, retirez délicatement la couche rose de la paroi folliculaire du jaune d’un côté de la tranche. Terminez cette extraction à l’aide de petits mouvements de pincement et de traction qui soulèvent la paroi du follicule pour l’éloigner du jaune.
7. La séparation des couches fonctionne mieux lorsqu’environ 5 mm de tissu de la paroi folliculaire ont été rétractés loin du jaune à la fois. Lorsqu’une section de 5 mm de la paroi folliculaire est rétractée avec succès du vitellus, utilisez une pince coudée en tandem avec la pince droite pour sonder le long de la coquille du follicule.
8. Dans certains cas, la couche de granulosa peut être plus étroitement associée au jaune que la couche de thèque. Dans cette situation, il suffit de sonder très doucement la surface du jaune à l’aide de l’une ou l’autre paire de pinces pour essayer de retirer la couche semblable à du papier de soie du jaune. Une fois que la couche de granulosa a été localisée, pincez-la solidement à la couche de thèque et procédez au retrait des deux couches du jaune comme décrit précédemment.
9. À l’aide de la pince incurvée, brossez légèrement le jaune pour l’éloigner des couches pincées. Balayez ou retirez l’excédent de jaune du bol. Ne grattez pas la couche de granulosa ; Cela provoquera des déchirures. Des mouvements vigoureux obscurcissent la solution PBS et réduisent la visualisation. Procédez avec des mouvements prudents et délibérés.
10. Après que chaque section de 5 à 10 mm de la paroi folliculaire est rétractée, faites une pause pour prendre les couches de thèque et de granulosa dans chaque ensemble de pinces et assurez-vous que les deux couches sont décollées l’une de l’autre progressivement, tout comme elles sont toutes deux retirées du jaune. Continuez ce processus autour de l’extérieur du follicule. Si la manipulation devient difficile en raison du lambeau de la couche de granulosa-thèque, tournez le follicule pour commencer le processus de l’autre côté de la tranche.
11. Au cours du processus de séparation, le disque germinatif (gamète femelle et vésicule germinale) sera rencontré. Il s’agit d’une zone qui adhère extrêmement à la fois à la couche de granulosa et au jaune. Approchez-vous du disque germinal avec précaution, à l’aide de la pince droite pour maintenir fermement la couche de granulosa sur la couche de thèque, tandis que la pince incurvée est utilisée dans de légers mouvements de brossage pour pousser le disque germinal loin des cellules de la granulosa sur la surface du vitellus.
    1. Si le disque germinal est souhaité comme spécimen de recherche, brossez le jaune à ce stade avec une pince coudée et rangez-le comme vous le souhaitez.
12. Continuez à séparer le jaune de la paroi folliculaire avec la pince incurvée jusqu’à ce que toute la sphère du follicule ait eu son jaune retiré.
13. Une fois que le reste du jaune a été brossé des couches, séparez la dernière partie de la couche de granulosa de la couche de thèque. La couche de granulosa entièrement séparée n’est peut-être pas entièrement dépourvue de matière vitelline, mais assurez-vous qu’elle n’en est pas recouverte. Placez la couche de granulosa et la couche calique dans des récipients séparés avec une température PBS de 4 °C.
    1. Une fois que la couche de granulosa se trouve dans un récipient séparé de la couche de granulosa, agitez doucement la couche de granulosa d’avant en arrière dans le PBS avec une pince pour vous assurer que tous les restes restants de la couche de granulosa se détachent.
       REMARQUE : Certaines méthodes de traitement après la séparation peuvent tenir compte de l’élimination des débris lipidiques par digestion ou centrifugation, selon l’étude souhaitée.
    2. Lorsque vous pratiquez cette technique pour la première fois, préparez et analysez histologiquement des échantillons représentatifs séparés pour confirmer la séparation et la collecte précises des couches.
       1. Pour ce faire, fixez des parties des tissus séparés dans du formol tamponné neutre à l’aide de cassettes de tissus en maille ou d’éponges pour éviter la perte d’échantillons, puis incorporez de la paraffine, sectionnez et colorez la section avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E).
       2. En raison de sa nature délicate, manipulez et placez soigneusement la couche de granulosa sur des éponges de biopsie dans une cassette histologique pour vous assurer que la couche cellulaire reste intacte.
       3. Placez la couche de thèque directement dans une cassette histologique. Cela permettra également de visualiser le niveau de contamination de l’échantillon par d’autres tissus folliculaires (c’est-à-dire un échantillon de couche cellulaire de la granulosa avec adhérence de la protéine jaune ou des cellules thécales).
          REMARQUE : Il n’est pas toujours possible d’obtenir une seule couche d’intérêt en raison de l’association étroite des tissus folliculaires. Cependant, la connaissance du niveau de contamination possible peut éclairer l’interprétation des approches multi-omiques ultérieures.

Ce protocole permet de séparer les couches de la granulosa et des cellules thécales du follicule ovarien (Figure 5 et Figure 6). Ces couches peuvent ensuite être préparées pour un examen histologique afin de confirmer la réussite de la séparation. Ces images histologiques, examinées et capturées par un pathologiste vétérinaire certifié (EMB), démontrent clairement la séparation efficace des couches de la granulosa et de la thèque pour les follicules préovulatoires F1 et F5 (Figure 7). Notamment, la couche de granulosa présente des plis complexes, une conséquence de sa nature fragile après l’extraction et la séparation du tissu thécal adjacent. Les cellules de la granulosa sont identifiables par leur forme cylindrique à colonnaire pseudostratifiée, caractérisée par une fixation étroite les unes aux autres et des bordures distinctes de la membrane cellulaire (figures 7A, B).

La couche cellulaire de la thèque est caractérisée par des cellules fusiformes avec de petits noyaux denses et peut inclure de grandes cellules lutéales (cellules polygonales élargies avec un cytoplasme clair à mousseux abondant indiquant une production d’hormones stéroïdes actives). Les cellules sanguines (cellules ovoïdes nucléées chez les espèces aviaires) et les vaisseaux de petit calibre sont courants dans la couche thécale et sont à prévoir. Le stroma ovarien sous-jacent sera également probablement visible avec l’échantillon de couche thécale (Figure 7C,D)8. Le tissu stromal a tendance à présenter une densité cellulaire réduite par rapport à la couche thécale et peut être visualisé par un changement brusque de l’orientation cellulaire de circonférentielle (les cellules s’alignent en couches parallèles les unes aux autres et circonférentielles à la lumière folliculaire) à multidirectionnelle (les cellules s’alignent dans de nombreuses directions) Dans les cas où les cellules de la granulosa sont retenues avec la couche thécale, une fine couche de cellules cylindriques de la granulosa sera évidente immédiatement au-dessus des cellules de la thèque (Figure 8). Pour assurer une séparation complète des couches, il est crucial d’observer minutieusement l’ensemble de la couche de thèque inversée. L’étape 3.10.1 identifie une étape de rinçage supplémentaire pour s’assurer qu’il reste peu ou pas de cellules de granulosa après la séparation des couches. En conclusion, l’examen histologique confirme la séparation réussie de la granulosa et de la couche thécale du follicule préovulatoire, mettant en évidence les caractéristiques distinctes de chaque couche et validant la méthode de séparation proposée.

Figure 1 : Ovaire, poule pondeuse mature. Ovaire de poule avec tous les follicules attachés. Les follicules préovulatoires sont marqués (F1-F5) pour démontrer une comparaison approximative de la taille des follicules les plus grands (F1) aux plus petits (F5 ou F6). Certains ovaires de poule peuvent avoir jusqu’à six follicules préovulatoires (non illustrés). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Anatomie du follicule préovulatoire ovarien, poule pondeuse mature. (A) Un schéma des couches cellulaires avec les types de cellules et les composants tissulaires importants qui composent le follicule préovulatoire (créé à l’aide de BioRender). Notez que le chiffre n’est pas à l’échelle. (B) Identification macroscopique de la tige (point d’attache folliculaire à l’ovaire) et du disque germinatif (site du gamète femelle) sur la structure folliculaire. (C) Identification grossière du stigmate sur la structure folliculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Déroulement général de la collecte et de la séparation des follicules ovariens chez les volailles. Un schéma du processus d’obtention et de collecte des couches cellulaires (créé à l’aide de BioRender). Le processus commence par l’obtention de poules sexuellement matures et l’extraction de leurs follicules ovariens. Ces follicules sont ensuite collectés dans un récipient avec 1x PBS et conservés sur de la glace. Un seul follicule est ensuite transféré dans une boîte contenant 1x PBS sur de la glace, où une boîte lumineuse est utilisée pour séparer les couches cellulaires. Une fois la séparation réalisée, les chercheurs peuvent utiliser l’échantillon à diverses fins, notamment l’analyse de l’ADN, l’analyse de l’ARN, l’analyse des protéines, la culture cellulaire ou l’histologie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Configuration en laboratoire pour la séparation folliculaire ovarienne. Une boîte lumineuse et un microscope de dissection sont nécessaires pour une bonne visualisation. Pour une conservation optimale des échantillons, les bols en verre et le PBS doivent être pré-refroidis et conservés sur de la glace jusqu’à ce que la séparation soit complète. Un plat en verre stérile, un récipient de collecte, une lame de scalpel et des outils de dissection seront nécessaires. Il est également recommandé d’avoir une feuille pour noter la qualité de la séparation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Séparation initiale des couches folliculaires dans les ovaires de poules pondeuses. Les pinces sont utilisées pour retenir à la fois la thèque (couche supérieure rose) et les couches de la granulosa (couche inférieure mince et blanche). À ce stade, dans le processus de séparation, les deux couches de la paroi folliculaire sont encore partiellement adhérentes l’une à l’autre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Séparation anatomique macroscopique représentative des couches folliculaires ovariennes chez la volaille. (A) Couche de granulosa isolée. (B) Couche de thèque isolée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Séparation histologique représentative des couches F1 et F5 de la granulosa et de la thèque du tissu ovarien chez les poules pondeuses. Identification histologique d’une couche de granulosa isolée des follicules préovulatoires (A) F1 et (B) F5 à un grossissement de 400x. Isolé de la couche cellulaire de la thèque des follicules préovulatoires (C) F1 et (D) F5 à un grossissement de 400X. Les cellules de la granulosa présentent une forme cylindrique à pseudostratifiée avec des bordures membranaires cellulaires distinctes, tandis que les cellules de la thèque présentent une morphologie en forme de fêne avec de petits noyaux denses. De plus, la présence de cellules sanguines et de vaisseaux de petit calibre, ainsi que du stroma ovarien sous-jacent, est couramment observée dans l’échantillon de couche thécale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Rétention de la couche de granulosa après séparation des couches folliculaires des ovaires de volaille. Dans un petit nombre d’isolements, une rétention inégale des cellules de la granulosa (en haut) peut être observée partiellement attachée à la couche thécale (au milieu), recouvrant le stroma folliculaire (en bas), soulignant la nécessité d’une manipulation et d’une séparation précises pour les couches de cellules pures. L’image est à un grossissement de 200x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à signaler.