Le présent protocole décrit une méthode pour induire la dispersion des juvéniles du troisième stade (juvéniles pré-dauer, JIII.) de Bursaphelenchus xylophilus dans la cryptobiose par régulation osmotique des ions chlorure de potassium (KCl). Cette méthode peut fournir un soutien technique à la recherche sur les mécanismes de résistance au stress de B. xylophilus.
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Article de méthode
Induction de l’entrée des juvéniles de dispersion du troisième stade de Bursaphelenchus xylophilus dans la cryptobiose par régulation osmotique
Dans cet article
Résumé
Résumé
La cryptobiose est un état où les organismes perdent presque toute leur eau interne et entrent dans l’anhydrobiose sous un stress environnemental extrême. Les juvéniles du troisième stade de dispersion (juvéniles pré-dauer, 
) de Bursaphelenchus xylophilus peuvent entrer dans la cryptobiose par déshydratation et revivre lors de la réhydratation lorsque les conditions environnementales s’améliorent. La régulation osmotique est cruciale pour leur survie dans ce processus. Dans cette étude, des spécimens de B. xylophilus ont été prélevés sur des Pinus massoniana morts en raison de la maladie du flétrissement du pin à Ningbo, dans la province du Zhejiang, en Chine. Après immersion dans une solution de chlorure de potassium à 8 % (KCl), B. xylophilus est entré dans un état cryptobiotique après une déshydratation progressive due à l’augmentation de la pression osmotique externe par évaporation naturelle de l’eau. B. xylophilus pourrait résister à un stress à basse température à -20 °C. B. xylophilus pourrait revivre lors de la réhydratation, avec un taux de survie de 92,1 %. Ce processus peut réguler l’entrée de B. xylophilus dans la cryptobiose, ce qui leur permet de résister à des environnements extrêmes. Cette méthode décrite dans notre étude est simple et fiable, fournissant un soutien technique pour l’étude des mécanismes de résistance au stress de B. xylophilus.
Introduction
La maladie du flétrissement du pin est l’une des maladies forestières les plus graves en Chine1. Le nématode du pin Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) représente une menace importante pour les espèces de pin telles que Pinus massoniana (P. massoniana) en se reproduisant à l’intérieur de l’hôte, entraînant un flétrissement rapide et la mort. Dans des conditions environnementales défavorables après la mort de l’hôte, les juvéniles reproducteurs de B. xylophilus peuvent entrer dans les juvéniles pré-dauer (). Ces juvéniles recherchent des insectes vecteurs pour poursuivre leur transfert et se propager, provoquant une mortalité massive dans les forêts de pins2.
La cryptobiose est un état dans lequel les organismes perdent presque toute leur eau interne et entrent dans l’anhydrobiose sous un stress environnemental extrême3. Au cours de ce processus, les organismes se déshydratent progressivement, ce qui entraîne un arrêt des mouvements, une réduction du métabolisme et une suspension du cycle de vie4. Dans des conditions appropriées, ils peuvent récupérer lors de la réhydratation. La cryptobiose permet aux organismes de résister à des environnements extrêmes, tels que les basses températures, et de prolonger leur durée de vie5. Des nématodes qui ont survécu en cryptobiose pendant 30 000 ans ont été trouvés dans le pergélisol de l’Antarctique6.
Des études antérieures ont montré que les nématodes peuvent s’adapter à divers facteurs de stress abiotiques - tels que la basse température, la sécheresse et la pression osmotique élevée - pendant la déshydratation enajustant leur perméabilité de surface. De plus, les nématodes peuvent courber leur corps pour réduire la surface et minimiser le taux de perte d’eau. Par exemple, Caenorhabditis elegans régule l’équilibre osmotique, permettant aux ions et aux petites molécules de passer librement à travers sa cuticule, tandis que les molécules plus grosses ne peuvent pas8. B. xylophilus présente également une cryptobiose. Au cours des stades de déshydratation et de réhydratation de la cryptobiose, la régulation osmotique est essentielle pour contrôler l’échange de substances à travers la cuticule, ce qui la rend essentielle pour entrer ou récupérer de la cryptobiose9.
La présente étude présente une méthode pour induire la cryptobiose chez B. xylophilus par régulation osmotique. Cette méthode est simple, efficace et très fiable, fournissant un soutien technique pour la recherche sur les mécanismes de résistance au stress de B. xylophilus.
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Protocole
1. Collection de 
B. xylophilus
- Collection de disques infectés de P. massoniana
REMARQUE : Toutes les procédures ont été conformes aux Mesures administratives relatives à la zone épidémique de flétrissement du pin et au bois infecté ainsi qu’aux autres règlements applicables. Une forêt de P. massoniana infectée par B. xylophilus dans le comté de Xiangshan, dans la ville de Ningbo, dans la province du Zhejiang, a été choisie comme site d’échantillonnage. P. massoniana, qui est mort de la maladie du flétrissement du pin, a été abattu à l’intérieur du site d’échantillonnage.- Ramassez des rondins ronds (5 cm d’épaisseur) dans les parties supérieure, centrale et inférieure du tronc principal des arbres abattus.
- Coupez les bûches rondes de P. massoniana en tranches de 0,5 à 1 cm d’épaisseur, puis coupez-les en petites lanières de 2 à 3 cm de long.
- Placez les petites bandes de bois dans des sacs scellés et rangez-les dans un laboratoire pour une utilisation ultérieure.
- Extraction de B. xylophilus
- Fixez un tube en caoutchouc à l’extrémité étroite d’un entonnoir en verre à long col d’un diamètre approximatif de 15 cm. Fixez le tube en caoutchouc avec un robinet de serrage. Placez l’entonnoir assemblé sur un support d’entonnoir.
- Enveloppez complètement les petites bandes de bois dans une seule couche de papier de soie, puis placez-les dans l’entonnoir. Ajoutez de l’eau distillée dans l’entonnoir jusqu’à ce que toutes les bandes de bois soient immergées.
REMARQUE : Après être restés debout pendant 12 à 24 h, les nématodes ont migré hors des bandes de bois et se sont installés au fond de l’entonnoir10. Le papier de soie empêchait les débris de bois de se déposer tout en laissant passer les nématodes. - Relâchez lentement le robinet au fond de l’entonnoir et laissez couler 2000 à 5000 μL du mélange dans une boîte de Pétri (5 cm de diamètre) pour l’examen microscopique et l’identification morphologique.
- Identifier B. xylophilus en observant des caractéristiques telles que les stylets, les bulbes médians de l’œsophage, les gouttelettes lipidiques et les formes de queue « en forme de doigts »11.
- Au microscope, transférez B. xylophilus sur une lame en aspirant 10 μL de liquide avec un nématode à l’aide d’une pipette de 10 μL à chaque fois. Répétez ce processus 30 fois pour recueillir environ 300 μL du mélange contenant des nématodes.
- Après l’extraction de B. xylophilus, stérilisez les bandes de bois restantes et les matériaux en bois infectés pour éviter toute contamination supplémentaire.
2. Contrôle du processus de régulation osmotique
- Préparation du mélange de régulation osmotique
- Préparez une solution aqueuse à 8 % de KCl.
- À l’aide d’une pipette, ajouter 10 μL de la solution aqueuse de KCl à 8 % à la lame contenant le mélange de B. xylophilus, ce qui donne environ 310 μL d’un mélange de nématodes et de solution de KCl.
- Régulation de l’augmentation de la pression osmotique et de la déshydratation de B. xylophilus
- Placez la lame sur la platine du microscope, en laissant l’eau s’évaporer naturellement. Il augmenterait progressivement la pression osmotique de l’environnement environnant, provoquant la déshydratation des nématodes sur environ 30 à 60 minutes.
REMARQUE : L’opérateur n’a qu’à attendre que l’eau s’évapore naturellement jusqu’à ce que les cristaux de KCL précipitent et observer l’état des nématodes au microscope. Il faut environ 30 à 60 minutes pour que 310 μL du mélange s’évaporent naturellement jusqu’à ce que les cristaux de KCL précipitent. - Observez au microscope le processus de déshydratation (p. ex., enroulement du corps, agrégation, etc.) de B. xylophilus . Lorsque l’eau s’évapore complètement et que les cristaux de KCl précipitent, B. xylophilus cesse de bouger et entre en cryptobiose.
- Placez la lame sur la platine du microscope, en laissant l’eau s’évaporer naturellement. Il augmenterait progressivement la pression osmotique de l’environnement environnant, provoquant la déshydratation des nématodes sur environ 30 à 60 minutes.
- Traitement de stress à basse température du cryptobiotique B. xylophilus
- Placez le cryptobiotique B. xylophilus dans un environnement à température constante de -20 °C pendant 24 h.
- Placez le cryptobiotique
- Régulation de la diminution de la pression osmotique et réhydratation de B. xylophilus
- Ajouter environ 300 μL d’eau distillée autour des juvéniles qui ont subi un traitement à basse température à la pipette. Le processus de réhydratation, qui dure environ 30 à 60 minutes, diminue progressivement la pression osmotique de l’environnement.
- Observez au microscope le processus de réhydratation de B. xylophilus (ex. : étirement du corps, reprise du mouvement, etc.). Calculez le taux de survie après 24 h.
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Résultats
Dans la solution de KCl à 8 %, lorsque l’eau s’évaporait, B. xylophilus présentait initialement une « courbure » notable tout en restant mobile (figure 1A). Une fois l’eau complètement évaporée, les nématodes ont cessé de bouger et se sont recourbés, avec des surfaces déprimées et des gouttelettes lipidiques accumulées (Figure 1B), indiquant leur entrée dans l’état ...
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Discussion
Dans cette étude, B. xylophilus a été collecté sur des P. massoniana morts à Ningbo, dans la province du Zhejiang. Il convient de noter que B. xylophilus a été sélectionné à partir d’une population mixte avec différents stades larvaires. Plus précisément, des grumes rondes à forte densité de B. xylophilus ont é...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette recherche a été financée par le Fonds de recherche fondamentale de l’Institut scientifique central d’intérêt public du Laboratoire clé d’État de génétique et de sélection des arbres (numéro de subvention CAFYBB2020ZY001-2), les projets de recherche d’entreprise (202404016-4320) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC 32271896).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Toboggan en verre | Bioland | Réf. GS7101-7525 | 75 mm & temps ; 25 mm & temps ; 1 millimètre |
| Entonnoir en verre à long col | Technologie expérimentale Kangluoda de Nanjing | N/A | 150 millimètre |
| Microscope | Phenix | XSP-35-1600X | PH100-2B41L-IPL |
| Pétri | Technologie expérimentale Kangluoda de Nanjing | ; Référence : TB-624935792745 | 50 mm & temps ; 50 millimètre |
| Pinchcock | Technologie expérimentale Kangluoda de Nanjing | ; Référence : TB-624973311743 | 36 mm & temps ; 11 millimètres ; & fois ; 55 millimètre |
| Pipette | Eppendorf | 3123000012 | 10&ndash ; 100 et micro ; L |
| Chlorure de potassium (KCL) | Solarbio Sciences de la vie | Réf. P9921 | 500 grammes |
| Tube en caoutchouc | Technologie expérimentale Kangluoda de Nanjing | Réf. TB-624923457094 | 7 mm & temps ; 5 millimètres |
| Stérilisateur | BinJiang ; | https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm= a2615.7691456.co_0_0_wangpu _score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0 | 75L |
| Papier de soie ; | Empreinte cœur à cœur | M3 | 22,5 cm & temps ; 21,5 cm |
Références
- Li, Y., Zhang, X. Analysis on the trend of invasion and expansion of Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pest and Disease. 37 (5), 1-4 (2018).
- Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annu Rev Phytopathol. 51 (51), ?61(2013).
- Crowe, J. H., Cooper, A. F. Cryptobiosis. Sci Am. 225, 30-36 (1971).
- Wharton, D. A. Anhydrobiosis. Curr Biol. 25, 1107-1125 (2015).
- Browne, J., Tunnacliffe, A., Burnell, A. Anhydrobiosis: plant desiccation gene found in a nematode. Nature. 416 (6876), 38(2002).
- Shatilovich, A. V., et al. Viable nematodes from late Pleistocene permafrost of the Kolyma river lowland. Dokl Biol Sci. 480 (1), 100-102 (2018).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Osmotic regulation of seamless tube growth. Nat Cell Biol. 15 (2), 137-139 (2013).
- Erkut, C., et al. Trehalose renders the dauer larva of Caenorhabditis elegans resistant to extreme desiccation. Curr Biol. 21 (1), 1331-1336 (2012).
- Pan, L., et al. Third-stage dispersal juveniles of Bursaphelenchus xylophilus can resist low-temperature stress by entering cryptobiosis. Biology. 10 (8), 785(2021).
- Mao, X. F., Li, H. X., Chen, X. Y., Hu, F. Extraction efficiency of soil nematodes by different methods. Chinese J Ecol. 23 (3), 149-151 (2004).
- Pan, L., et al. Isolation and identification of pine wood nematode in Pinus koraiensis in Fengcheng, Liaoning province. Forest Pest and Disease. 38 (1), 4(2019).
- Pan, L., Cui, R., Li, Y., Feng, Y., Zhang, X. Investigation of pinewood nematodes in Pinus tabuliformis Carr. under low-temperature conditions in Fushun, China. Forests. 11 (9), 993(2020).
- Madin, K. A. C., Crowe, J. H. Anhydrobiosis in nematodes: Carbohydrate and lipid metabolism during dehydration. J Exp Zool. 3, 193(2010).
- Wharton, D. A. Anhydrobiosis: The model worm as a model. Curr Biol. 21 (15), 578-579 (2011).
- Li, Y., Zhang, X. High risk of invasion and expansion of pine wood nematode in the middle temperate zone of China. J Temperate Res. 1 (1), 4(2018).
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Réimpressions et autorisations
