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Induction de l’entrée des juvéniles de dispersion du troisième stade de Bursaphelenchus xylophilus dans la cryptobiose par régulation osmotique

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DOI :

10.3791/67350

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27 décembre 2024

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11State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Tianjin Institute of Forestry Science, Chinese Academy of Forestry, 4Ningbo Yongsen Biotechnology Co. Ltd, 5Xiangshan Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode pour induire la dispersion des juvéniles du troisième stade (juvéniles pré-dauer, JIII.) de Bursaphelenchus xylophilus dans la cryptobiose par régulation osmotique des ions chlorure de potassium (KCl). Cette méthode peut fournir un soutien technique à la recherche sur les mécanismes de résistance au stress de B. xylophilus.

Résumé

La cryptobiose est un état où les organismes perdent presque toute leur eau interne et entrent dans l’anhydrobiose sous un stress environnemental extrême. Les juvéniles du troisième stade de dispersion (juvéniles pré-dauer, figure-abstract-1) de Bursaphelenchus xylophilus peuvent entrer dans la cryptobiose par déshydratation et revivre lors de la réhydratation lorsque les conditions environnementales s’améliorent. La régulation osmotique est cruciale pour leur survie dans ce processus. Dans cette étude, des spécimens de figure-abstract-2 B. xylophilus ont été prélevés sur des Pinus massoniana morts en raison de la maladie du flétrissement du pin à Ningbo, dans la province du Zhejiang, en Chine. Après immersion dans une solution figure-abstract-3 de chlorure de potassium à 8 % (KCl), B. xylophilus est entré dans un état cryptobiotique après une déshydratation progressive due à l’augmentation de la pression osmotique externe par évaporation naturelle de l’eau. figure-abstract-4 B. xylophilus pourrait résister à un stress à basse température à -20 °C. figure-abstract-5 B. xylophilus pourrait revivre lors de la réhydratation, avec un taux de survie de 92,1 %. Ce processus peut réguler l’entrée de figure-abstract-6 B. xylophilus dans la cryptobiose, ce qui leur permet de résister à des environnements extrêmes. Cette méthode décrite dans notre étude est simple et fiable, fournissant un soutien technique pour l’étude des mécanismes de résistance au stress de B. xylophilus.

Introduction

La maladie du flétrissement du pin est l’une des maladies forestières les plus graves en Chine1. Le nématode du pin Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) représente une menace importante pour les espèces de pin telles que Pinus massoniana (P. massoniana) en se reproduisant à l’intérieur de l’hôte, entraînant un flétrissement rapide et la mort. Dans des conditions environnementales défavorables après la mort de l’hôte, les juvéniles reproducteurs de B. xylophilus peuvent entrer dans les juvéniles pré-dauer (figure-introduction-1). Ces juvéniles recherchent des insectes vecteurs pour poursuivre leur transfert et se propager, provoquant une mortalité massive dans les forêts de pins2.

La cryptobiose est un état dans lequel les organismes perdent presque toute leur eau interne et entrent dans l’anhydrobiose sous un stress environnemental extrême3. Au cours de ce processus, les organismes se déshydratent progressivement, ce qui entraîne un arrêt des mouvements, une réduction du métabolisme et une suspension du cycle de vie4. Dans des conditions appropriées, ils peuvent récupérer lors de la réhydratation. La cryptobiose permet aux organismes de résister à des environnements extrêmes, tels que les basses températures, et de prolonger leur durée de vie5. Des nématodes qui ont survécu en cryptobiose pendant 30 000 ans ont été trouvés dans le pergélisol de l’Antarctique6.

Des études antérieures ont montré que les nématodes peuvent s’adapter à divers facteurs de stress abiotiques - tels que la basse température, la sécheresse et la pression osmotique élevée - pendant la déshydratation enajustant leur perméabilité de surface. De plus, les nématodes peuvent courber leur corps pour réduire la surface et minimiser le taux de perte d’eau. Par exemple, Caenorhabditis elegans régule l’équilibre osmotique, permettant aux ions et aux petites molécules de passer librement à travers sa cuticule, tandis que les molécules plus grosses ne peuvent pas8. figure-introduction-2 B. xylophilus présente également une cryptobiose. Au cours des stades de déshydratation et de réhydratation de la cryptobiose, la régulation osmotique est essentielle pour contrôler l’échange de substances à travers la cuticule, ce qui la rend essentielle pour entrer ou récupérer de la cryptobiose9.

La présente étude présente une méthode pour induire la cryptobiose chez figure-introduction-3 B. xylophilus par régulation osmotique. Cette méthode est simple, efficace et très fiable, fournissant un soutien technique pour la recherche sur les mécanismes de résistance au stress de figure-introduction-4 B. xylophilus.

Protocole

1. Collection de figure-protocol-1 B. xylophilus

  1. Collection de disques infectés de P. massoniana
    REMARQUE : Toutes les procédures ont été conformes aux Mesures administratives relatives à la zone épidémique de flétrissement du pin et au bois infecté ainsi qu’aux autres règlements applicables. Une forêt de P. massoniana infectée par B. xylophilus dans le comté de Xiangshan, dans la ville de Ningbo, dans la province du Zhejiang, a été choisie comme site d’échantillonnage. P. massoniana, qui est mort de la maladie du flétrissement du pin, a été abattu à l’intérieur du site d’échantillonnage.
    1. Ramassez des rondins ronds (5 cm d’épaisseur) dans les parties supérieure, centrale et inférieure du tronc principal des arbres abattus.
    2. Coupez les bûches rondes de P. massoniana en tranches de 0,5 à 1 cm d’épaisseur, puis coupez-les en petites lanières de 2 à 3 cm de long.
    3. Placez les petites bandes de bois dans des sacs scellés et rangez-les dans un laboratoire pour une utilisation ultérieure.
  2. Extraction de figure-protocol-2 B. xylophilus
    1. Fixez un tube en caoutchouc à l’extrémité étroite d’un entonnoir en verre à long col d’un diamètre approximatif de 15 cm. Fixez le tube en caoutchouc avec un robinet de serrage. Placez l’entonnoir assemblé sur un support d’entonnoir.
    2. Enveloppez complètement les petites bandes de bois dans une seule couche de papier de soie, puis placez-les dans l’entonnoir. Ajoutez de l’eau distillée dans l’entonnoir jusqu’à ce que toutes les bandes de bois soient immergées.
      REMARQUE : Après être restés debout pendant 12 à 24 h, les nématodes ont migré hors des bandes de bois et se sont installés au fond de l’entonnoir10. Le papier de soie empêchait les débris de bois de se déposer tout en laissant passer les nématodes.
    3. Relâchez lentement le robinet au fond de l’entonnoir et laissez couler 2000 à 5000 μL du mélange dans une boîte de Pétri (5 cm de diamètre) pour l’examen microscopique et l’identification morphologique.
    4. Identifier figure-protocol-3 B. xylophilus en observant des caractéristiques telles que les stylets, les bulbes médians de l’œsophage, les gouttelettes lipidiques et les formes de queue « en forme de doigts »11.
    5. Au microscope, transférez B. xylophilus sur figure-protocol-4 une lame en aspirant 10 μL de liquide avec un nématode à l’aide d’une pipette de 10 μL à chaque fois. Répétez ce processus 30 fois pour recueillir environ 300 μL du mélange contenant des nématodes.
    6. Après l’extraction de B. xylophilus, stérilisez les bandes de figure-protocol-5 bois restantes et les matériaux en bois infectés pour éviter toute contamination supplémentaire.

2. Contrôle du processus de régulation osmotique

  1. Préparation du mélange de régulation osmotique
    1. Préparez une solution aqueuse à 8 % de KCl.
    2. À l’aide d’une pipette, ajouter 10 μL de la solution aqueuse de KCl à 8 % à la lame contenant le mélange de figure-protocol-6 B. xylophilus, ce qui donne environ 310 μL d’un mélange de nématodes et de solution de KCl.
  2. Régulation de l’augmentation de la pression osmotique et de la déshydratation de figure-protocol-7 B. xylophilus
    1. Placez la lame sur la platine du microscope, en laissant l’eau s’évaporer naturellement. Il augmenterait progressivement la pression osmotique de l’environnement environnant, provoquant la déshydratation des nématodes sur environ 30 à 60 minutes.
      REMARQUE : L’opérateur n’a qu’à attendre que l’eau s’évapore naturellement jusqu’à ce que les cristaux de KCL précipitent et observer l’état des nématodes au microscope. Il faut environ 30 à 60 minutes pour que 310 μL du mélange s’évaporent naturellement jusqu’à ce que les cristaux de KCL précipitent.
    2. Observez au microscope le processus de déshydratation (p. ex., enroulement du corps, agrégation, etc.) de figure-protocol-8 B. xylophilus . Lorsque l’eau s’évapore complètement et que les cristaux de KCl précipitent, figure-protocol-9 B. xylophilus cesse de bouger et entre en cryptobiose.
  3. Traitement de stress à basse température du cryptobiotique figure-protocol-10 B. xylophilus
    1. Placez le cryptobiotique figure-protocol-11 B. xylophilus dans un environnement à température constante de -20 °C pendant 24 h.
  4. Régulation de la diminution de la pression osmotique et réhydratation de figure-protocol-12 B. xylophilus
    1. Ajouter environ 300 μL d’eau distillée autour des juvéniles qui ont subi un traitement à basse température à la pipette. Le processus de réhydratation, qui dure environ 30 à 60 minutes, diminue progressivement la pression osmotique de l’environnement.
    2. Observez au microscope le processus de réhydratation de figure-protocol-13 B. xylophilus (ex. : étirement du corps, reprise du mouvement, etc.). Calculez le taux de survie après 24 h.

Résultats

Dans la solution de KCl à 8 %, lorsque l’eau s’évaporait, figure-results-1 B. xylophilus présentait initialement une « courbure » notable tout en restant mobile (figure 1A). Une fois l’eau complètement évaporée, les nématodes ont cessé de bouger et se sont recourbés, avec des surfaces déprimées et des gouttelettes lipidiques accumulées (Figure 1B), indiquant leur entrée dans l’état cryptobiotique. Après avoir ajouté de l’eau distillée à leur environnement, les nématodes se sont réhydratés et se sont ranimés (figure 1C). Une fois l’eau évaporée, des cristaux de KCL apparaîtront (Figure 1D). La figure 1E montre les caractéristiques morphologiques de figure-results-2 B. xylophilus.

Une expérience de déshydratation a démontré que dans une solution initiale de KCl à 8 %, l’évaporation de l’eau faisait figure-results-3 perdre de l’eau à B. xylophilus. Après déshydratation, figure-results-4 B. xylophilus a été soumis à un stress à basse température à -20 °C pendant 24 h ; le taux de survie moyen était de 92,1 %11. Comparativement à un taux de survie de 0 % dans le groupe témoin qui n’était pas entré dans un état cryptobiotique, les données ci-dessus suggèrent que la déshydratation pourrait augmenter considérablement le taux de survie de B. xylophilus dans des conditions de figure-results-5 basse température.

Au cours de la phase de réhydratation suite à la cryptobiose de figure-results-6 B. xylophilus, nous avons observé que 100 % des nématodes présentaient des « bulles » in vivo lors du transfert d’une solution à 40 % de KCl à de l’eau distillée (Figure 2).

figure-results-7
Figure 1 : Le processus de déshydratation-cryptobiose-réhydratation de figure-results-8 B. xylophilus. Cette image illustre le processus de cryptobiose chez figure-results-9 B. xylophilus, y compris le stade (A) de déshydratation, (B) le stade de cryptobiose, (C) le stade de réhydratation, (D) le stade de cristallisation de KCL et (E) figure-results-10 B. xylophilus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-11
Figure 2 : Accumulation de granules de graisse chez B. xylophilus non ressuscitéfigure-results-12. Cette image montre l’état de figure-results-13 B. xylophilus après réhydratation, caractérisé par la présence de granules de graisse en forme de bulles in vivo. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans cette étude, figure-discussion-1 B. xylophilus a été collecté sur des P. massoniana morts à Ningbo, dans la province du Zhejiang. Il convient de noter que figure-discussion-2 B. xylophilus a été sélectionné à partir d’une population mixte avec différents stades larvaires. Plus précisément, des grumes rondes à forte densité de B. xylophilus ont été choisies, suivies du criblage de figure-discussion-3 B. xylophilus. En hiver, lorsque la température minimale quotidienne dans la province du Liaoning est d’environ -20 °C, un grand nombre de B. xylophilus à un seul stade figure-discussion-4 peut être obtenu à partir de Pinus tabuliformis mort, ce qui a simplifié le processus de sélection dans cette expérience12.

Au cours du processus cryptobiotique, le lent taux de déshydratation des nématodes favorise leur survie et prévient les dommages structurels à leurs protéines13. Le temps de déshydratation est essentiel pour déterminer le taux de survie de figure-discussion-5 B. xylophilus. Dans cette étude, une solution de KCl à une concentration initiale de 8 % a été utilisée, et sa concentration a été augmentée progressivement avec l’évaporation naturelle de l’eau, permettant figure-discussion-6 à B. xylophilus de se déshydrater lentement et d’entrer dans la cryptobiose. Si l’eau s’évapore trop rapidement ou si les nématodes sont placés directement dans une solution de KCl à haute concentration, leur taux de survie diminue considérablement.

La méthode décrite dans cette étude présente plusieurs avantages. Le matériel expérimental est facilement accessible, ne nécessitant qu’une solution de KCl et de l’eau distillée pour réguler la déshydratation et la réhydratation de figure-discussion-7 B. xylophilus. Les procédures sont simples : la déshydratation s’est produite par évaporation naturelle et la réhydratation a été obtenue en ajoutant de l’eau distillée. L’ensemble du processus peut être terminé en 2 heures. Cette méthode présente des taux de réussite et de survie élevés, la plupart des figure-discussion-8 B. xylophilus entrant dans la cryptobiose après la déshydratation et la majorité revivant après la réhydratation, respectivement11.

La méthode proposée est applicable pour réguler l’état cryptobiotique de B. xylophilus et des figure-discussion-9 juvéniles de dispersion du quatrième stade (figure-discussion-10)14. Cependant, il peut ne pas être efficace contre la multiplication B. xylophilus.

Ces dernières années, la maladie du flétrissement du pin causée par B. xylophilus s’est propagée du sud de la Chine aux régions du nord. figure-discussion-11 B. xylophilus, qui habite les pins dans ces régions nordiques plus froides, a tendance à présenter une plus grande résistance au froid15. La méthode proposée peut induire une cryptobiose chez figure-discussion-12 B. xylophilus, améliorant ainsi leur résistance au froid et à la sécheresse. Collectivement, cette méthode peut fournir un soutien technique pour l’étude des mécanismes de résistance au stress de B. xylophilus et du mécanisme de transmission de la maladie du flétrissement du pin.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le Fonds de recherche fondamentale de l’Institut scientifique central d’intérêt public du Laboratoire clé d’État de génétique et de sélection des arbres (numéro de subvention CAFYBB2020ZY001-2), les projets de recherche d’entreprise (202404016-4320) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC 32271896).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Toboggan en verreBiolandRéf. GS7101-752575 mm & temps ; 25 mm & temps ; 1 millimètre
Entonnoir en verre à long colTechnologie expérimentale Kangluoda de NanjingN/A150 millimètre
MicroscopePhenixXSP-35-1600XPH100-2B41L-IPL
PétriTechnologie expérimentale Kangluoda de Nanjing  ; Référence : TB-62493579274550 mm & temps ; 50 millimètre
PinchcockTechnologie expérimentale Kangluoda de Nanjing  ; Référence : TB-62497331174336 mm & temps ; 11 millimètres  ; & fois ; 55 millimètre
PipetteEppendorf312300001210&ndash ; 100 et micro ; L
Chlorure de potassium (KCL)Solarbio Sciences de la vieRéf. P9921500 grammes
Tube en caoutchoucTechnologie expérimentale Kangluoda de NanjingRéf. TB-6249234570947 mm & temps ; 5 millimètres
StérilisateurBinJiang  ;https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm=
a2615.7691456.co_0_0_wangpu
_score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0		75L
Papier de soie  ;Empreinte cœur à cœurM322,5 cm & temps ; 21,5 cm

Références

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Mots-clés

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