Analyse par cytométrie en flux de l’expression des facteurs tissulaires dans les plaquettes humaines

Résumé

Cet article présente le protocole pour quantifier le pourcentage de plaquettes positives au facteur tissulaire (TF) à l’aide de la cytométrie du flux sanguin total, en évaluant la protéine : (1) intracellulairement en conditions de repos, et (2) à la surface cellulaire, tant au repos qu’activée. Des indications sont également fournies pour évaluer les plaquettes TF-positives dans le plasma riche en plaquettes.

Résumé

Un sous-ensemble de plaquettes humaines circulantes stocke le facteur tissulaire (TF) intracellulaire, l’activateur clé de la cascade de coagulation sanguine et de la formation du thrombus. Lors de l’activation des plaquettes, la TF est exposée sur la membrane cellulaire, où elle se lie à la FVII, menant finalement à la génération de thrombine. Étant donné que (1) les niveaux de plaquettes TF-positives augmentent dans divers contextes cliniques, contribuant au phénotype prothrombotique du patient, et (2) que différents médicaments peuvent moduler l'expression de la TF associée aux plaquettes, une méthode standardisée pour évaluer les plaquettes TF-positives est précieuse, car son évaluation a été controversée par le passé. Ici, nous présentons un protocole pour mesurer le pourcentage de plaquettes TF-positives à l’aide de la cytométrie de flux dans le sang total et le plasma riche en plaquettes (PRP)/plaquettes lavées. Ce protocole vise à fournir des instructions détaillées pour quantifier le pourcentage de plaquettes TF-positives en évaluant la protéine (1) intracellulairement dans des conditions de repos, et (2) à la surface cellulaire, tant au repos qu’activé. La première section fournit des informations essentielles pour effectuer correctement le prélèvement sanguin afin de garantir que les procédures pré-analytiques n’affectent pas les résultats. Ensuite, le protocole se concentre sur la préparation et les procédures de marquage des échantillons pour l’analyse de cytométrie en flux. Les étapes détaillées pour la stimulation cellulaire, le marquage, la fixation et la perméabilisation — lorsque nécessaire — sont détaillées. Enfin, des instructions pour les réglages de cytométrie en flux afin d’identifier correctement la population de plaquettes et d’analyser les événements TF-positifs sont décrites. Enfin, la méthode inclut la procédure de préparation du PRP si les plaquettes TF-positives doivent être mesurées dans des plaquettes isolées. Puisque seul un sous-ensemble de plaquettes contient de la TF, il est important de s’assurer que ces plaquettes ne soient pas perdues lors des étapes de centrifugation nécessaires à l’obtention du PRP.

Introduction

Le facteur tissulaire (TF), une glycoprotéine transmembranaire et activateur clé de la cascade de coagulation sanguine, est exprimé par un sous-ensemble, ~20 % à 30 %, de plaquettes humaines^{circulantes 1}, en particulier celles de taille² plus grande. Lors de l’activation par des agonistes plaquettaires classiques tels que l’adénosine diphosphate (ADP) et la thrombine, les plaquettes exposent la TF fonctionnellement active à leur surface de manière dépendante de la concentration, ce qui lui permet de se lier au facteur VII/VIIa, menant finalement à la génération^{de thrombine} 1,3,4,5,6. Notamment, dans des pathologies telles que la maladie coronarienne (CAD⁾⁷, l’infection par syndrome respiratoire aigu sévère-coronavirus-2 (SARS-CoV-2^{) 8}, la migraine avec aura associée au foramen ovale breveté (MHA-PFO⁾⁹, le cancer¹⁰ et la septicémie¹¹, le nombre de plaquettes TF-positives augmente significativement, contribuant ainsi au risque thrombotique accru observé dans ces contextes cliniques.

Malgré ces preuves convaincantes, la détection des plaquettes TF-positives reste un sujet de débat au sein de la communauté scientifique ^6,12,13. Des défis méthodologiques, notamment les variables pré-analytiques, la préparation de l’échantillon et la spécificité des anticorps, ont été avancés comme raisons possibles des résultats contradictoires rapportés dans la^littérature 2,4,12,14. Il est donc crucial d’établir un test standardisé basé sur un protocole bien défini pour mesurer la TF dans les plaquettes humaines.

Dans ce contexte, la cytométrie du flux sanguin total est la seule technologie permettant l’analyse des plaquettes TF-positives avec une manipulation minimale des échantillons, ce qui est crucial pour éviter la perte de ce sous-ensemble de plaquettes.

Dans cet article, nous proposons un protocole pour mesurer la TF associée aux plaquettes à l’aide de la cytométrie du flux sanguin total, évaluant la protéine (1) intracellulairement en conditions de repos et (2) à la surface cellulaire en conditions de repos et activées. Des instructions sont également fournies si l’évaluation des plaquettes TF-positives dans le plasma riche en plaquettes (PRP) est nécessaire.

Protocole

Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique de l’institution (n° 70/24, CE 18.06.24), et un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les donneurs de sang. Le protocole guidera l’utilisateur à travers sept étapes principales (Figure 1). La première étape concerne la procédure de prélèvement sanguin. Les étapes 2 et 3 décrivent le protocole de titration des anticorps et la préparation de l’échantillon pour l’analyse de l’expression intracellulaire de la TF à l’aide d’un anticorps monoclonal (mAb) marqué par la phycoérythrine (PE) αCD142/HTF1. L’étape 4 décrit le protocole d’évaluation de la protéine exposée à la surface des plaquettes à l’aide d’une méthode de coloration indirecte avec αCD142/HTF1 mAb. En raison de l’obstacle stérique du fluorochrome, le mAb marqué par PE utilisé pour la coloration intracellulaire ne se lie pas au domaine catalytique de la protéine exposée à la surface. Par conséquent, un protocole de coloration indirecte avec un mAb secondaire marqué Alexa Fluor 633 est proposé. Les étapes 5 et 6 détaillent les phases de l’analyse de cytométrie en écoulement. La dernière étape décrit la procédure de préparation du plasma riche en plaquettes (PRP) afin d’éviter la perte de la sous-population de plaquettes de grande taille. Les détails des réactifs et équipements utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Retrait sanguin

REMARQUE : La prélève de sang humain ne doit être effectuée qu’après l’approbation du Comité d’éthique.

1. Prélever des échantillons sanguins par prélèvement veineux ou par canule à aiguilles sur un bras non affecté par des perfusions veineuses périphériques, de préférence dans la veine antécubitale.
   1. Pour l’échantillonnage veineux périphérique, appliquez le garrot et, après avoir inséré une aiguille papillon G19 dans la veine, retirez-la pour empêcher l’activation des plaquettes (Figure 2).
      REMARQUE : N’utilisez pas une aiguille papillon plus petite que G21 pour éviter l’activation des plaquettes.
   2. Pour le prélèvement veineux avec une aiguille-canule, n’appliquez jamais le garrot lors de l’échantillonnage. Si nécessaire, lavez l’échantillon avec une solution saline à 0,9 % avant de le prendre. Jetez toujours les premiers 5 mL de sang avant de commencer à remplir les tubes.
2. Prélève 2 mL de sang dans un aspirateur EDTA (à utiliser pour le nombre de globules sanguins). Mélangez doucement le tube trois fois pour assurer un mélange complet du sang et de l’anticoagulant.
3. Prélever du sang dans un vacutainer de citrate de sodium à 0,129 M pour l’analyse de l’expression de TF associée aux plaquettes. Remplissez soigneusement le vacuum au niveau indiqué pour maintenir le bon ratio sang/anticoagulant. Inversez doucement les tubes cinq fois pour assurer un mélange complet du sang avec l’anticoagulant, évitant la formation de caillots et l’hémolyse des échantillons.
   REMARQUE : L’utilisation d’un anticoagulant à 0,129 M citrate est recommandée afin d’optimiser la détection de la TF associée aux plaquettes avec le clone HTF1 de l’αCD142 mAb. S’il est nécessaire d’isoler les plaquettes du sang entier, prélève un second vacuum de citrate de sodium 0,129 M pour la préparation du plasma riche en plaquettes (PRP).
4. Gardez les aspirateurs droits dans un support pour tube. Ne les secouez pas sur des plaques rotatives ou inclinables, et évitez les systèmes de transport pneumatiques. Ne réfrigérez pas les échantillons sanguins pour empêcher l’activation des plaquettes.
   REMARQUE : Les échantillons de sang doivent de préférence être traités dans les 15 minutes suivant le retrait si un autre marqueur d’activation plaquettaire associé aux granules doit être mesuré en même temps que la TF. Sinon, les échantillons doivent être traités au plus tard 3 h après la collecte (Figure 3).

2. Titration de l’anticorps anti-TF (pour l’évaluation intracellulaire de la TF)

REMARQUE : La détermination de la TF stockée intracellulairement est réalisée à l’aide du PE-αCD142/HTF1 mAb.

1. Titration par anticorps à l’aide de billes
   REMARQUE : L’utilisation des billes permet de définir la quantité correcte d’anticorps à utiliser (c’est-à-dire la concentration d’anticorps produisant la plus grande séparation des pics de fluorescence entre les échantillons positifs et négatifs). Cette analyse est réalisée à partir de deux échantillons, l’un véritablement positif et l’autre véritablement négatif. La concentration d’anticorps n’est pas rapportée par le fabricant (voir Tableau des matériaux), donc la titration par anticorps est réalisée à l’aide de cinq points de dilution.
   1. Centrifugez l’anticorps à 17 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Pour préparer les cinq points de dilution des anticorps, pipettez 40 μL d’anticorps dans le tube 1 et 20 μL de PBS dans les tubes 2 à 5. Effectuez quatre dilutions sériales consécutives de 1:2 en transférant 20 μL du tube 1 au tube 2, puis à partir de là.
   2. Préparez un tube à essai pour chaque volume d’anticorps à tester. Ajoutez une goutte de billes négatives et une goutte de billes positives dans chaque tube à essai. Ajoutez immédiatement 20 μL de chaque dilution d’anticorps dans le tube à essai et formez immédiatement le vortex. Incubez dans le noir à température ambiante pendant 20 minutes.
   3. Ajoutez 1 mL de 1x PBS sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺, pH 7,4, à chaque tube et à chaque vortex.
   4. Acquérir les échantillons sur le cytomètre de flux selon les instructions du fabricant et enregistrer un fichier de données de 10 000 événements dans la grille « billes ». La concentration optimale d’anticorps est celle qui assure la plus grande séparation entre les pics positifs et négatifs.
2. Titration par anticorps sur les plaquettes
   REMARQUE : En règle générale, la concentration optimale d’anticorps identifiée à l’aide des billes doit être vérifiée sur les cellules à colorer — dans ce cas, les plaquettes dans le sang total.
   1. Fixation
      1. Inversez doucement le vacutainer de citrate de sodium cinq fois pour bien mélanger le sang et l’anticoagulant. Transférez 50 μL de sang dans un tube de 1,5 mL, ajoutez 950 μL de paraformoldéhyde (PFA) à 1 %, mélangez doucement et faites couver l’échantillon pendant 90 minutes à température ambiante.
      2. Centrifugez l’échantillon à 1 500 x g pendant 5 minutes, avec frein, à température ambiante.
      3. Retirez le surnageant et resuspendez la pellete en pipotant doucement 1 mL de PBS 1x sans Ca⁺⁺ et Mg^{++, pH} 7,4.
   2. Perméabilisation
      1. Préparez un tube pour chaque volume d’anticorps à tester (testez le volume identifié avec la titration des billes ainsi qu’une dilution plus élevée et une plus faible, par exemple 10 μL, 5 μL, 2,5 μL si le volume identifié est de 5 μL) et un tube pour le contrôle de fluorescence moins un (FMO).
      2. Injectez 100 μL de sang fixe dans chaque tube et centrifugez-les à 1 500 x g pendant 5 minutes, avec frein, à température ambiante.
      3. Retirez le surnageant, resuspendez la pellete dans 100 μL de 0,1 % de Triton-PBS pour perméabiliser les échantillons, puis incubez pendant 10 minutes à température ambiante.
   3. Coloration
      1. Centrifugez l’anticorps à 17 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Ajoutez les volumes d’anticorps requis à chaque tube à essai comme déterminé dans 2.2.2.1 et mélangez.
      2. Faites éclore les échantillons pendant 15 minutes dans le noir à température ambiante.
      3. Ajoutez 300 μL de 1x PBS sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺, pH 7,4, à chaque tube et mélangez. Prélever les échantillons sur le cytomètre en flux (voir étape 5).
      4. Calculez l’indice de coloration selon la formule^{suivante 15} :
                                
         où,_{MFI pos} est l’intensité moyenne de fluorescence des événements positifs, MFI_négatif celui des événements négatifs, et SD est l’écart-type de la population négative.
      5. Choisissez la concentration d’anticorps la plus basse qui offre le plus d’indice de coloration.
         REMARQUE : Dans les conditions expérimentales actuelles, l’indice de coloration le plus élevé pour le mAb PE-αCD142/HTF1 est obtenu à l’aide de 5 μL d’anticorps.

3. Préparation de l’échantillon pour l’analyse par cytométrie en flux de l’expression intracellulaire de TF

1. Fixation du sang total et perméabilisation
   1. Pour l’analyse intracellulaire de la TF, fixez et perméabilisez le sang total selon la procédure décrite à l’étape 2.
2. Procédure de coloration
   REMARQUE : Dans le protocole suivant, la population de plaquettes est identifiée par coloration αCD61-PerCP. D'autres marqueurs de population peuvent être utilisés à la discrétion de l'opérateur.
   1. Préparez un tube pour le contrôle Fluorescence Minus Un (FMO) et un tube pour la coloration TF. Ajoutez 100 μL de sang total fixé et perméabilisé à chaque tube ainsi que les anticorps listés dans le tableau 1.
   2. Faites éclore les échantillons pendant 15 minutes dans le noir à température ambiante.
   3. Ajoutez 300 μL de 1x PBS sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺, pH 7,4, à chaque tube et mélangez. Conserver les échantillons colorés dans l’obscurité jusqu’à l’analyse de cytométrie en flux (voir étape 5).
      REMARQUE : Pour calculer la matrice de compensation, préparez les échantillons comme décrit dans le tableau 2.

4. Préparation d’échantillon pour l’analyse de cytométrie en flux de l’expression de TF associée à la surface cellulaire dans les plaquettes au repos et activées

REMARQUE : Pour la détection de la TF associée à la surface cellulaire, utilisez des αCD142/HTF1 mAb non marqués (1 mg/mL) et Alexa Fluor 633 anti-IgG de chèvre (2 mg/ml) comme anticorps secondaire pour la détection du signal. L'adénosine 5'-diphosphate (ADP) est utilisée comme agoniste des plaquettes pour induire l'exposition de la TF à la surface cellulaire. Un anticorps marqué par PE est utilisé comme marqueur de population plaquettaire pour minimiser le débordement, qui sera vérifié par compensation du signal.

1. Coloration TF
   1. Diluez αCD142/HTF1 mAb 1:100 dans 1x PBS sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺, pH 7,4, pour obtenir une concentration de travail de 10 μg/mL. Diluez Alexa Fluor 633 anti-souris anti-souris IgG 1:10 dans 1x PBS sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺, pH 7,4, pour obtenir une concentration de travail de 200 μg/mL.
   2. Préparez les trois tubes d’échantillon et dispensez 1x PBS sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺, pH 7,4, comme indiqué dans le tableau 3.
   3. Administrez 7,5 μL de αCD142/HTF1 mAb dilué et ajoutez 5 μL d’ADP (200 μM) pour obtenir une concentration finale de 10 μM d’ADP. Inversez doucement le vacuum de citrate 5 fois pour mélanger soigneusement le sang et l’anticoagulant, puis injectez 5 μL de sang total dans chaque tube. Mélangez doucement les échantillons.
   4. Incubez les échantillons pendant 20 minutes à température ambiante.
2. Fixation par exemple
   1. Fixez chaque échantillon en ajoutant 300 μL de paraformodéhyde (PFA) à 1 % et faites éclore les échantillons pendant 1 heure à température ambiante.
      REMARQUE : Les échantillons marqués fixés avec 1 % de PFA et stockés à 4 °C restent stables jusqu’à 4 jours.
   2. Ajoutez 300 μL de 1x PBS sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺, pH 7,4, à chaque tube et centrifugez à 1500 x g pendant 5 minutes avec le frein à température ambiante.
   3. Retirez le surnageant et resuspendez la pellete à 95 μL de 1x PBS sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺, pH 7,4, en pipettant doucement.
3. Coloration avec l’anticorps secondaire
   1. Distribuez 5 μL d’Alexa Fluor 633 IgG dilué et incubez les échantillons pendant 15 minutes dans le noir à température ambiante.
   2. Ajoutez 300 μL de 1x PBS sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺, pH 7,4, à chaque tube et centrifugez à 1500 x g pendant 5 minutes avec le frein à température ambiante. Retirez le surnageant et resuspendez la pellete à 95 μL de 1x PBS sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺, pH 7,4.
   3. Injectez 5 μL de αCD41-PE dans chaque tube (voir Tableau 4). Faites éclore les échantillons pendant 15 minutes dans le noir à température ambiante.
   4. Ajoutez 300 μL de 1x PBS sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺, pH 7,4, à chaque tube et mélangez.
   5. Conserver les échantillons colorés dans l’obscurité jusqu’à l’analyse de cytométrie en flux (voir étape 6).
      REMARQUE : Pour calculer la matrice de compensation, préparez les échantillons selon les étapes 4.1 à 4.3 et comme indiqué dans les Tables 5 et 6.

5. Analyse par cytométrie en flux de l’expression intracellulaire de TF

REMARQUE : La procédure suivante fait référence aux acquisitions sur un cytomètre de référence ; Ainsi, les décors et les graphiques rapportés doivent être considérés comme représentatifs. Le protocole peut être appliqué à tout cytomètre en flux de nouvelle génération à haute sensibilité. Allumez le cytomètre en flux bien avant l’acquisition de l’échantillon pour assurer la stabilité du laser. Lavez soigneusement la fluidique et la cellule de flux, car les plaquettes sont petites, et tout débris cellulaire peut interférer avec la visualisation de la population de plaquettes dans le diagramme de points de la zone de diffusion avant / de la zone de dispersion latérale (FSC-A/SSC-A). Effectuez un contrôle qualité avec des billes QC selon les instructions du fabricant et lavez à nouveau les liquidiques pour éliminer les billes résiduelles.

1. Configuration de l’acquisition
   1. Créez un diagramme de points FSC-A/SSC-A sur une échelle logarithmique affichant tous les événements (Figure 4A). Créez un diagramme de points CD61-A/SSC-A sur une échelle logarithmique affichant tous les événements (Figure 4B).
   2. Ajustez le gain de PE (Y-585) et de PerCP (B690) selon le contrôle qualité quotidien. Fixer le seuil approximatif à 2000 sur SSC-H et à 1000 sur PerCP (B690-H) afin de visualiser la population de plaquettes. Réglez le débit sur BAS.
   3. Dessinez une région entre 10³ et 10⁵ appelée « CD61⁺ » pour identifier la population de plaquettes.
   4. Acquérir des contrôles à une seule teinture pour calculer la matrice de compensation puis prélever les échantillons. Enregistrez un fichier de données de 10 000 événements à l’intérieur de la porte « CD61⁺ » (Figure 4D,E). Commencez à enregistrer 5 à 10 secondes après le début de l’extraction de l’échantillon.

6. Analyse par cytométrie en flux de l’expression TF de surface

1. Réalisez un diagramme de points FSC-A/SSC-A sur une échelle logarithmique affichant Tous les Événements (Figure 5A), et un diagramme de points CD41-A/SSC-A sur une échelle logarithmique affichant Tous les Événements (Figure 5B).
2. Ajustez le gain d’Alexa Fluor 633 et le gain de PE (Y-585) selon le contrôle qualité quotidien, fixez le seuil approximatif à 1000 sur SSC-H et à 2500 sur PE (Y585-H) pour visualiser la population de plaquettes comme montré à la Figure 5B. Réglez le débit sur BAS.
3. Dessinez une région entre 10⁴ et 10⁵ appelée « CD41⁺ » pour identifier la population de plaquettes.
4. Acquérir des contrôles à une seule teinture pour calculer la matrice de compensation puis prélever les échantillons. Enregistrez un fichier de données de 10 000 événements à l’intérieur de la porte « CD41⁺ » (Figure 5D,E). Commencez à enregistrer 5 à 10 secondes après le début de l’extraction de l’échantillon.

7. Analyse des plaquettes TF-positives dans un plasma riche en plaquettes

1. Préparation du plasma riche en plaquettes (PRP)
   REMARQUE : L’isolation des plaquettes doit être effectuée à température ambiante pour empêcher l’activation cellulaire. Assurez-vous que la température des réactifs et des instruments se situe entre 18 °C et 22 °C. Évitez les pipettes rapides et les secousses vigoureuses tout au long de la procédure.
   1. Mélangez doucement le vacutainer de citrate de sodium à 0,129 M 5 fois et mesurez deux fois le nombre de plaquettes sur un compteur de globules sanguins pour calculer le pourcentage de plaquettes récupérées.
      REMARQUE : Utilisez la valeur moyenne des deux déterminations comme concentration plaquettaire.
   2. Centrifugez le vacuum de citrate de sodium à 0,129 M à 100 x g pendant 10 minutes, sans frein, à température ambiante (Figure 6). Collectez le PRP obtenu, transférez-le dans un tube en polypropylène de 10 mL, et enregistrez le volume collecté.
      REMARQUE : N’utilisez pas de tubes en polystyrène pour éviter l’activation des plaquettes.
   3. Comptez deux fois les plaquettes en PRP à l’aide d’un compteur de globules sanguins et calculez le pourcentage de récupération des plaquettes comme suit :
      
      REMARQUE : Si la récupération est inférieure à 65 %, la population de plaquettes n’est pas entièrement représentative de celle du sang total. Envisagez d’abandonner la préparation.
2. Préparation de l’échantillon pour l’analyse par cytométrie en flux de l’expression intracellulaire et associée à la surface de la TF dans le PRP
   1. Pour analyser l’expression intracellulaire et associée à la surface de la TF dans le PRP, utilisez le même protocole décrit pour l’analyse du sang total (voir étapes 3 à 6).

Résultats

Un résumé de l’analyse de l’expression TF associée aux plaquettes est décrit dans le diagramme de flux illustré à la Figure 1. Les étapes comprennent : (1) Prélèvement sanguin : prélever le sang de la veine périphérique humaine, de préférence de la veine antécubitale, à l’aide d’une aiguille papillon G19 ou d’une canule à aiguilles sans garrot et avec des vacutainers contenant des anticoagulants. (2) Traitement des échantillons : Traiter les échantillons selon le type d’évaluation TF à réaliser. (3) Marquement des échantillons : Étiquetter les échantillons avec des anticorps spécifiques. (4) Analyse de cytométrie en flux : Analyser les échantillons pour détecter la TF de surface et intracellulaire.

Lors du prélèvement sanguin, il faut faire attention particulière à l’évitement de l’activation des plaquettes. À cette fin, deux précautions sont prises : retirer le garrot peu après l’insertion de l’aiguille dans la veine, et jeter le sang dans le premier aspirateur prélevé. Sans l’utilisation du garrot, la population de plaquettes, affichée dans un graphique FSC-A/SSC-A, a une forme typique, comme montré à la Figure 2A. Inversement, avec l’utilisation du garrot, les propriétés physiques de la population de plaquettes donnent une forme allongée ressemblant à la morphologie observée après stimulation avec un agoniste plaquettaire classique, tel que l’ADP (Figure 2B,C).

Des expériences menées pour évaluer la stabilité de l’expression de la TF associée aux plaquettes au fil du temps ont montré qu’elle restait stable pendant 3 heures après la prise de sang (Figure 3). Lorsqu’on combine la mesure de l’expression de la TF avec celle d’un marqueur d’activation des plaquettes, tel que la P-sélectine, il est conseillé de traiter l’échantillon sanguin le plus rapidement possible afin d’éviter la dégranulation des plaquettes.

Pour l’analyse de la TF stockée intracellulairement, le sang total est fixé à 1 % de PFA, perméabilisé avec PBS-Triton, puis coloré avec un anticorps marqué par EP. La population de plaquettes est identifiée sur un graphique logarithmique FSC-A/SSC-A (figure 4 A,D) et par coloration αCD61 mAb (figure 4 B,E). Les résultats de l’analyse de la TF intracellulaire chez des sujets sains (n = 377) ont indiqué que la TF est présente dans 26,8 % ± 4,8 % des plaquettes circulantes (Figure 4F).

L’analyse par cytométrie en flux de l’expression de la TF associée à la surface a été réalisée en conditions de repos et après stimulation cellulaire avec ADP 10 μM. La population totale de plaquettes sanguines, marquée avec αCD41 mAb, a été identifiée sur un graphique logarithmique FSC-A/SSC-A (figure 5A,B). Les résultats ont montré que chez les sujets sains (n = 377), la TF est exprimée par 2,8 % ± 1,4 % des plaquettes au repos (Figure 5D-F) et augmente jusqu’à 24,5 % ± 5,8 % lors de l’activation (Figure 5G-I). TF est exprimée par le sous-ensemble de plaquettes ayant la plus grande taille (Figure 5D,G, points verts). De plus, l’analyse par cytométrie d’imagerie en flux met en lumière que le signal TF n’est associé qu’aux événements αCD61 positifs et non à ceux αCD45 positifs (Figure 7).

Comme mentionné précédemment, la TF est stockée dans un sous-ensemble de plaquettes caractérisé par la plus grande taille au sein de toute la population. Il est donc important de ne pas perdre cette fraction plaquettaire lors de la préparation du PRP. En suivant les indications fournies dans la section méthode (étape 7), il est possible d’isoler une population de plaquettes au sein du PRP qui soit représentative de celle présente dans le sang total. Comme montré à la Figure 6, le graphique en points de cytométrie de flux de la population de plaquettes obtenu par centrifugation de 100 x g de sang total est très similaire à celui du sang total en termes de distribution des FSC (Figure 6 A,B). En revanche, en utilisant une force plus élevée et un temps de centrifugation plus long, comme souvent rapporté dans la^{littérature 12, 14,16}, la population de plaquettes récupérées présente une FSC plus faible que celle du sang total (Figure 6C), ce qui suggère la perte des plaquettes de taille plus grande, qui sont celles très TF-positives.

Figure 1 : Schéma pour l’analyse de l’expression TF associée aux plaquettes et l’isolement des plaquettes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Graphiques de densité représentatifs de la population de plaquettes analysés par cytométrie du flux sanguin total. (A) Population de plaquettes analysée dans un échantillon sanguin prélevé sans garrot ou (B) avec le garrot. (C) La population de plaquettes stimulée par l’ADP est rapportée pour comparaison. WBC : globules blancs ; RBC : globules rouges. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Stabilité de l’expression de TF associée à la surface cellulaire au fil du temps. L’expression de la TF associée aux plaquettes au repos a été analysée à 4 moments différents après le retrait sanguin, rapportée sur l’axe des x comme suit : T0 = immédiatement après la prise de sang ; T1 = 1 h après la prise de sang ; T2 = 2 h après la prise de sang ; T3 = 3 h après la prise de sang. Les données sont rapportées en moyenne ± DS, n = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Analyse représentative de cytométrie en flux de la TF stockée intracellulairement. La population de plaquettes (rouge) dans le sang total est identifiée dans le diagramme de points FSC/SSC-A (A,D) et par coloration αCD61 mAb (B,E). L’expression de la TF est analysée à l’aide d’un mAb PE- αCD142/HTF1 (points verts). Les graphiques histogrammes sont utilisés pour identifier les événements négatifs (C) et positifs (F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Analyse représentative par cytométrie en flux des plaquettes TF-positives associées à la surface. Le sang total frais est marqué avec αCD142/HTF1 mAb, puis fixé avec 1 % de PFA et marqué avec le mAb secondaire et le αCD41 mAb. La population de plaquettes (rouge) dans le sang total est identifiée dans le diagramme de points FSC/SSC-A (A, D, G) et par coloration αCD41 mAb (B,E,H). L’expression de la TF en condition de repos (D-F) et après stimulation ADP (G-I) est quantifiée par marquage avec αCD142/HTF1 mAb (points verts). Des graphiques histogrammes représentatifs d’échantillons négatifs (C) et positifs (F,I) sont rapportés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Effet des différentes forces de centrifugation sur la préparation du PRP. (A-C) Cytométrie en flux de la population de plaquettes dans le sang entier, PRP préparé à 100 x g et à 350 x g. La plage de référence de la population de plaquettes sur FSC-H/SSC-H est indiquée par des lignes pointillées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Évaluation de l’expression de la TF dans les plaquettes et les leucocytes par cytométrie en flux d’imagerie. Des images représentatives en canal du champ clair (BF, gris), du facteur tissulaire (TF, vert), αCD61 (rouge), αCD45 (gris), de la coloration des noyaux avec Hoechst (magenta), et de l’image composite (fusion), acquise à un grossissement de 60x, sont montrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

ID de tube d’échantillon	Fix/permanente du sang total (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
FMO	100	-	15
TF	100	5	15

Tableau 1 : Protocole de coloration pour l’analyse de cytométrie en flux de l’expression intracellulaire de TF.

ID de tube d’échantillon	Fix/permanente du sang total (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
Sans tache	100	-	-
αCD142-PE	95	5	-
αCD61-PerCP	85	-	15

Tableau 2 : Contrôle par une seule coloration pour la matrice de compensation de l’expression intracellulaire de la TF.

ID de tube d’échantillon	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Sang entier frais (μL)	PFA 1 % (μL)
FMO	95	-	-	5	300
Repos	87.5	7.5	-	5	300
ADP activé	82.5	7.5	5	5	300

Tableau 3 : Protocole de coloration pour l’analyse de cytométrie en flux de l’expression TF de surface.

ID de tube d’échantillon	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
FMO	90	5	5
Repos	90	5	5
ADP activé	90	5	5

Tableau 4 : Protocole secondaire de coloration des anticorps pour l’analyse TF associée à la surface.

ID de tube d’échantillon	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Sang entier frais (μL)	PFA 1 % (μL)
Sans tache	90	-	5	5	300
TF + Alexa Fluor 633 IgG	82.5	7.5	5	5	300
αCD41-PE	90	-	5	5	300

Tableau 5 : Préparation de la matrice de compensation pour l’analyse intracellulaire des TF.

ID de tube d’échantillon	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
Sans tache	100	-	-
TF + Alexa Fluor 633 IgG	95	5	-
αCD41-PE	95	-	5

Tableau 6 : Préparation de la matrice de compensation pour l’analyse TF associée à la surface.

Discussion

Ce manuscrit rapporte des protocoles détaillés pour l’évaluation des plaquettes TF-positives par cytométrie du flux sanguin total, en tenant compte de l’analyse de la protéine exprimée à la fois à l’intérieur et à la surface des plaquettes.

Au cours des 20 dernières années, la présence de TF dans les plaquettes humaines a été bien^établie 1,2,3,4,5,17,18. Un sous-ensemble de plaquettes, représentant 20 % à 30 % de la population totale de plaquettes^{circulantes 2}, exprime la protéine, renforçant le concept d’hétérogénéité plaquettaire qui devient de plus en plus pertinent dans le domaine^19,20. Il convient de mentionner que les plaquettes TF-positives ont un volume plaquettaire moyen élevé, comme l’a précédemment montré la cytométrie de flux d’imagerie^{très sensible 2}. Il est crucial de prendre en compte cette caractéristique, surtout lorsque l’expression de la TF doit être analysée dans des plaquettes isolées des autres composants des cellules sanguines. Il est en effet possible que l’étape de centrifugation utilisée pour l’isolement des plaquettes entraîne la perte de plaquettes de grande^{taille 2}. Cette question pré-analytique est probablement l’un des principaux moteurs de la controverse – qui a duré jusqu’à il y a quelques années – concernant la présence de TF dans les^{plaquettes 7, 12, 13}. La cytométrie du flux sanguin total est une approche extrêmement utile à cet égard, permettant d’analyser tous les sous-ensembles de plaquettes sans avoir besoin de les isoler.

Une seconde raison qui a favorisé la discussion sur la présence de TF dans les plaquettes est le choix de l’anticorps anti-TF humain utilisé pour l’analyse. De nombreux anticorps disponibles dans le commerce ont été utilisés pour l’évaluation de la TF associée aux plaquettes et qui reconnaissent différents épitopes de la protéine. Certains anticorps, tels que les clones TF9-10H10 3,21,22 et ^{VIC7 1,3}, se lient à une région non fonctionnelle de TF sans affecter la liaison FVII/FVIIa. D’autres anticorps, dont les clones^{VD8 1,2,3} et^{HTF11 18} – ces derniers utilisés dans les protocoles actuels – reconnaissent le site catalytique de la protéine, en compétition avec FVII/FVIIa pour se lier à TF, bloquant ainsi sa fonction procoagulante. Il est important de noter que, selon l’état de glycosylation du domaine extracellulaire et la conformation du site catalytique de TF²³, qui pourrait être modifié dans des conditions particulières (telles que l’activation cellulaire ou la maladie), certains de ces anticorps pourraient être capables de reconnaître différenciément, par cytométrie en flux, l’expression de surface de TF associée aux plaquettes. De plus, les conditions de coloration, c’est-à-dire si l’échantillon à analyser est frais, fixé et/ou perméabilisé, pourraient affecter la conformation de l’épitope et, par conséquent, la liaison^{antigène-anticorps 14}.

Un autre aspect qui mérite d’être pris en compte est le choix du fluorochrome lié à l’anticorps. Puisque la TF n’est exprimée que par 20 % à 30 % de la population plaquettaire, les fluorochromes à faible émission, associés à l’utilisation de cytomètres à faible sensibilité, peuvent ne pas être adaptés pour discriminer les signaux faibles positifs. Pour cette raison, les anticorps marqués par des fluorochromes vifs, tels que le PE ou le APC, sont à privilégier. Il est cependant important de noter que la grande taille d’un fluorochrome tel que le PE peut entraver la liaison de l’anticorps marqué à la protéine²⁴. Pour surmonter ce problème, dans le protocole actuel, la coloration TF de surface a été réalisée sous forme de marquage indirect avec un αCD142/HTF1 mAb non conjugué, puis révélée par l’utilisation d’un anticorps secondaire. L’obstacle à la PE n’affecte pas la liaison αCD142/HTF1 mAb à la TF stockée intracellulairement, là où le site catalytique est plus accessible à la liaison des anticorps. Il est clair que l’évaluation de l’expression de surface de la TF associée aux plaquettes par marquage direct, comparée à l’indication indirecte, serait préférable – si possible – afin de raccourcir le temps de traitement de l’échantillon. Cette approche doit cependant prendre en compte les questions critiques mentionnées ci-dessus et liées à la capacité de liaison des plusieurs anticorps commerciaux disponibles contre la TF plaquettaire, en raison de la conformation de la protéine elle-même, ou des conditions de coloration, ainsi que de l’entrave stérique des différents fluorochromes utilisés. Ainsi, afin d’éviter les résultats faux négatifs, le marquage direct des TF associées aux plaquettes exprimées en surface nécessite un processus d’optimisation obligatoire et minutieux. Ces aspects font l’objet d’une étude en cours visant à évaluer l’efficacité de la coloration directe avec les différents clones d’anticorps disponibles dans le commerce marqués avec des fluorochromes tout-utilisés.

Plusieurs études ont montré que l’expression de la TF est élevée dans diverses pathologies caractérisées par un risque thrombotique^élevé 8,9,10,11,17. Récemment, des preuves ont été fournies montrant que les niveaux de plaquettes TF-positives, quantifiés avec précision par cytométrie en flux, peuvent identifier des patients cardiovasculaires qui, malgré une réponse optimale au traitement médicamenteux par aspirine et antagonistes P2Y₁₂, maintiennent un risque thrombotique^{élevé 25}. En effet, la TF associée aux plaquettes est fonctionnellement active et donc potentiellement capable de soutenir la génération^{de thrombine 1,3,4}. Dans ce contexte, la capacité à réaliser une analyse de cytométrie en flux sur quelques microlitres de sang constitue un avantage significatif qui permet d’étendre l’analyse TF associée aux plaquettes au contexte clinique. À cette fin, il convient de mentionner que la validation de la mesure des TF associées aux plaquettes par cytométrie en flux a été l’objectif d’un projet international que nous avons récemment coordonné, avec le soutien de la Société internationale d’hémostase et de thrombose, afin de fournir des orientations méthodologiques pour son évaluation.

Contrairement à d’autres marqueurs classiques d’activation des plaquettes, tels que la P-sélectine et les agrégats plaquettes-leucocytes, qui doivent être analysés immédiatement après un prélèvement sanguin pour éviter les artefacts, l’expression de la TF est beaucoup plus stable. En fait, l’échantillon de sang peut être analysé quelques heures après le prélèvement sanguin sans changement significatif de l’expression de la TF plaquettaire ; De plus, la possibilité de fixer l’échantillon et de l’étiqueter/traiter ensuite rend cette analyse adaptée à de nombreux hôpitaux/laboratoires. Il est à noter que, bien que le protocole décrit dans ce manuscrit soit relativement simple à exécuter, la technique de cytométrie en flux nécessite néanmoins une formation technique spécialisée. Pour cette raison, la technologie progresse vers le développement de cytomètres de plus en plus simples destinés aux tests au point de soins.

En conclusion, le protocole proposé propose des méthodes pour l’analyse correcte de la TF associée aux plaquettes, en soulignant les avantages d’une technique basée sur l’analyse de cytométrie en flux pour sa détermination. De plus, elle met en lumière les variables pré-analytiques pouvant influencer l’analyse de cette protéine, en insistant sur les mesures à prendre pour les éviter.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Adénosine 5'-diphosphate (ADP)	Sigma-Aldrich	A-2754	; Agoniste des plaquettes
Alexa Fluor 633 chèvre &alpha ;-mouse IgG	Invitrogen	A21052	Anticorps secondaire
Biotube 10 mL	Biosigma	BSP048	Pour la collecte PRP
Aiguille Papillon G19	Solution PIC	02044019030010	Pour le prélèvement sanguin
CytExpert Software	Beckman Coulter		Analyse des données de cytométrie en flux
Cytoflex S	Beckman Coulter		Cytomètre en débit
Tubes Eppendorf 1,5 mL	Eppendorf	1,20,086	; Fixation sanguine
ImageStreamX Mk II	Cytek Biosciences		Cytomètre à débit d’imagerie
Kaluza Software	Beckman Coulter		Analyse des données de cytométrie en écoulement   ;
Paraformeldéhyde  ;	Antibiotiques & ndash ; Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Pour réparer le sang et les plaquettes
PerCP-& alpha ; CD45	BD	345809	Marqueur de population leucocytaire
PerCP-& alpha ; CD61	BD	347408	Marqueur de poulation plaquettaire
PE-& alpha ; CD142	BD	550312	Anticorps anti-facteur tissulaire humain
PE-& alpha ; CD41	Beckman Coulter	A07781	Marqueur de poulation plaquettaire
Solution tampon phosphate (PBS) 1x sans calcium et magnésium	Gibco	10010-015	Pour les anticorps et la dilution de l’échantillon
Pointes de pipet 10 & micro ; L  ;   ;	Gilson & nbsp ;	F161630	Préparer des échantillons
Pointes de pipet 1000 & micro ; L	Gilson	F161670	Préparer des échantillons
Pointes de pipet 200 & micro ; L	Gilson	F161930	Préparer des échantillons
Tube à fond rond 5 mL	Corning	352052	Pour l’acquisition du cytomètre en flux
Chlorure de sodium 0,9 %	BD	306575	Pour laver la canule à aiguilles-canules après un prélèvement sanguin
Sysmex XN-450	Dasit		Analyseur de globules sanguins
Triton X-100	Carlo Erba Reagenti	9002-93-1	Perméabiliser la membrane des cellules sanguines
Tubes de citrate de vacutainer 0,129M	BD	363079	Pour la collecte de sang
Tubes Vacutainer K2 EDTA	BD	368857	Pour la collecte de sang
Adaptateur Luer à échantillons multiples Vacutainer	BD	367300	; Pour le prélèvement sanguin
Porte-aspirateur à usage unique	BD	364815	; Pour le prélèvement sanguin
Kit de billes de capture d’anticorps Versacomp	Beckman Coulter	B22804	Titration par anticorps
&alpha ; CD142 (clone HTF-1)	Invitrogen	16-1429-82	Anticorps anti-facteur tissulaire humain