Analyse comparative du caryotype des populations d’herbes de Lycoris aurea à l’aide de bandes de fluorochrome et d’ADNr-FISH 45S et 5S

Résumé

Ce protocole étudie la distribution de l’hétérochromatine dans huit populations de Lycoris aurea (L′Her), en utilisant la coloration combinée des chromosomes PI et DAPI, l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) avec les régions du gène de l’ARNr 18S-5.8-26S (régions d’ADNr 45S) et les sondes d’ADN ribosomique 5S.

Résumé

Pour comprendre la variation du caryotype dans huit populations, des caryotypes détaillés ont été méticuleusement établis à l’aide de mesures chromosomiques, de bandes de fluorescence et de signaux FISH d’ADNr. Le nombre de sites d’ADNr 45S varie de une à cinq paires par population, le nombre le plus courant par caryotype étant de quatre paires. Le locus de l’ADNr 45S est principalement situé dans les bras courts et les régions terminales des chromosomes, tandis que le locus de l’ADNr 5S se trouve principalement dans le bras court et les régions terminales ou proximales. Les populations HBWF, HNXN, HBBD et HNZX ont montré une distribution similaire des sites d’ADNr 45S, tout comme GXTL, HBFC et SCLS, indiquant une relation étroite entre les populations ayant des distributions similaires des sites d’ADNr 45S. Les caryotypes de toutes les populations étudiées sont symétriques, comprenant des centromères stables et métastables ou des centromères exclusivement stables. Les diagrammes de dispersion de MCA et CVCL distinguent efficacement leurs structures caryotypiques. L’analyse comprend six paramètres quantitatifs (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). De plus, les résultats indiquent que la PCoA basée sur ces six paramètres est une méthode robuste pour déterminer les relations de caryotype biologique entre les huit populations. Le nombre de chromosomes dans les populations de Lycoris est x = 6-8. Sur la base de l’étude et de la littérature actuelles, la différenciation génomique de ces populations est discutée en termes de taille du génome, d’hétérochromatine, de sites d’ADNr 45S et 5S et d’asymétrie du caryotype.

Introduction

Lycoris est une famille qui comprend plusieurs plantes horticoles importantes¹. Lycoris aurea (L’Hér.) Herbe. est une plante médicinale traditionnelle chinoise avec une longue histoire. L’analyse phytochimique a montré que Lycoris aurea (L′Her.) L’herbe contient de la galantamine et d’autres alcaloïdes, qui peuvent améliorer la sensibilité à l’acétylcholine et ont le potentiel de traiter la maladie d’Alzheimer en tant qu’inhibiteurs de la cholinestérase².

Chez les plantes supérieures, l’analyse du caryotype est cruciale pour l’intégration des cartes génétiques et physiques, avec des implications pratiques importantes pour la biologie végétale. Cette analyse permet de caractériser le génome au niveau chromosomique, de clarifier les relations taxonomiques cellulaires entre les populations, d’identifier les aberrations génétiques et de comprendre les tendances de l’évolution chromosomique ^3,4,5. En règle générale, la description d’un caryotype comprend le nombre de chromosomes, les longueurs absolues et relatives des chromosomes, les emplacements de constriction primaire et secondaire, la distribution des fragments hétérochromatiques, le nombre et l’emplacement des sites d’ADNr et d’autres caractéristiques de séquence d’ADN, ainsi que l’asymétrie du caryotype ^6,7,8. Parmi les paramètres du caryotype, l’asymétrie est déterminée par des variations de la longueur des chromosomes (asymétrie interchromosomique) et de la position du centromère (asymétrie intrachromosomique). L’asymétrie du caryotype est une caractéristique significative reflétant la morphologie des chromosomes et est largement utilisée dans la taxonomie^des cellules végétales 9,10,11,12.

Souvent, l’absence de marqueurs chromosomiques limite l’analyse du caryotype et entrave l’identification des chromosomes individuels. Ces dernières années, la coloration Giemsa, le rubanage de fluorescence et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) sont devenus populaires dans l’analyse des chromosomes végétaux. Les méthodes de coloration par fluorescence double, telles que la coloration CMA (chromomycine A3) / DAPI (4, 6-diamino-2-phénylindole) et la coloration PI (iodure de propyle) / DAPI (connue sous le nom de coloration CPD), révèlent des régions hétérochromatiques riches en GC et en AT sur les chromosomes ^4,13. Au cours de la métaphase ou du pachytène de la mitose végétale, des séquences d’ADN répétées ou de longs segments d’ADN peuvent générer des signaux spécifiques dans les populations végétales par hybridation FISH 14,15,16.

Les bandes fluorescentes et les signaux FISH fournissent des marqueurs utiles pour l’identification des chromosomes. En mesurant la longueur des chromosomes, en analysant les caractéristiques des bandes de fluorescence et en comparant les différences de signal FISH, il est possible de construire des caryotypes cytogénétiques moléculaires détaillés de différents germoplasmes ou populations de plantes. Ces caryotypes présentent efficacement la morphologie des chromosomes dans divers germoplasmes ou populations, ce qui permet de comparer la distribution de l’hétérochromatine et la localisation des séquences d’ADN et d’encourager d’autres recherches ^4,8,17. Les comparaisons de caryotypes cytogénétiques moléculaires peuvent offrir des informations précieuses sur les relations phylogénétiques et l’évolution chromosomique de populations apparentées 8,14,18,19.

Le genre Lycoris , un groupe diversifié et intrigant au sein de la famille des Amaryllis, est connu pour ses bulbes vivaces. Composé d’environ 20 espèces, dont 15 sont endémiques de Chine, il présente une riche biodiversité. Ce genre se trouve exclusivement dans les régions tempérées chaudes et subtropicales de l’Asie de l’Est, y compris le sud-ouest de la Chine, le sud de la Corée et le Japon, avec quelques populations s’étendant au nord de l’Inde et au Népal²⁰. Les premières études cytogénétiques impliquaient principalement le comptage des chromosomes pour établir le nombre de chromosomes de base du genre et pour décrire la morphologie des chromosomes dans des populations spécifiques, en se concentrant principalement sur Lycoris radiata²¹. Le nombre total de chromosomes observé dans ce genre varie de 12 à 33 ou 44, représentant respectivement les niveaux diploïde, diploïde anormal, triploïde, tétraploïde et aneuploïde. Les numéros de chromosome de base, x, sont 6, 7, 8 et 11.

Lycoris aurea (L’Hér.) Herb, une espèce notable du genre Lycoris , est largement répandu dans toute la Chine²². Il prospère dans des environnements détendus et humides et se reproduit à travers de petits bulbes. Ces bulbes, contenant de la lycorine et de la galantamine, deux composés médicinaux clés, sont utilisés dans la médecine traditionnelle chinoise depuis des siècles. Lycoris aurea captive également les horticulteurs avec ses fleurs rouges frappantes à l’automne et ses feuilles persistantes en hiver. Cependant, la similitude morphologique entre tous les Lycoris aurea étudiés (L’Hér.) Les populations de plantes présentent un défi important pour l’identification chromosomique à l’aide de méthodes cytologiques conventionnelles.

Le clonage de FISH, de fosmides ou de BAC (chromosomes artificiels bactériens) avec des séquences d’ADN répétitives et des sondes oligonucléotidiques sur des chromosomes métaphasiques ou pachydermiques a été utilisé pour l’analyse du caryotype ^23,24,25, l’analyse cytogénétique comparative^26,27, la construction de cartes cytogénétiques ^28,29 et les tests spécifiques aux chromosomes³⁰. Récemment, la technique FISH a été appliquée à l’analyse chromosomique des populations de Lycoris ³¹. Bien que le nombre de chromosomes et le caryotype varient dans les populations de Lycoris, le nombre total de chromosomes reste constant, avec trois types de base observés : le chromosome centromère central (M-), le chromosome centromère distal (T-) et le chromosome centromère proximal (A-). De plus, diverses formes et tailles de chromosomes sont observées dans les populations naturelles³².

L’hybridation in situ par fluorescence d’ARN (FISH) est utile pour détecter les modifications chromosomiques, telles que la fusion des centromères, l’inversion, l’amplification de gènes et la délétion de fragments. La technologie d’hybridation in situ en fluorescence (RNA-FISH) permet une analyse visuelle à haute résolution des chromosomes afin de détecter et d’identifier de multiples changements complexes, notamment la fusion de régions centrales chromosomiques, la formation de nouvelles structures chromosomiques, l’inversion de régions chromosomiques, l’amplification de gènes ou de fragments de gènes et la perte de séquences génétiques sur des régions chromosomiques spécifiques³³. Cinq des 500 clones ont montré de forts signaux FISH sur la région du centromère du chromosome central (M-), mais pas sur le chromosome distal du centromère (T-)³⁴. Le modèle unique de distribution du signal FISH sur chaque chromosome a permis d’identifier des chromosomes individuels, ce qui était auparavant difficile dans les populations de Lycoris à l’aide de méthodes de coloration traditionnelles³¹. À l’heure actuelle, il existe peu d’études sur la cytogénétique moléculaire de Lycoris aurea (L’Hér.) Herb, soulignant le besoin urgent de poursuivre les recherches dans ce domaine.

Dans cette étude, huit chromosomes de métaphase bien différenciés de Lycoris aurea (L’Hér.) Les populations d’herbes ont été préparées à l’aide de méthodes d’immersion enzymatique et de séchage à la flamme (CEM). La coloration CPD et les sondes d’ADNr 45S et 5S ont été utilisées pour l’identification des FISH. Des caryotypes cytogénétiques moléculaires détaillés de ces populations ont été construits à l’aide de données combinées provenant de mesures chromosomiques, de bandes fluorescentes et de signaux FISH d’ADNr 45S et 5S. Six indices d’asymétrie caryotypique différents ont été calculés pour chaque population afin d’identifier les relations caryotypiques entre elles. L’évaluation des données du caryotype cytogénétique moléculaire a fourni des informations significatives sur la différenciation génomique et les relations évolutives des huit populations, ce qui pourrait remodeler la compréhension des chromosomes de Lycoris .

Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont détaillés dans la table des matériaux, tandis que les sondes utilisées sont fournies dans le dossier supplémentaire 1.

1. Préparation des chromosomes apicaux

1. Prenez racine grâce à la culture hydroponique. Après avoir retiré la partie aérienne de l’ampoule, placez-la dans une bouteille effilée remplie d’eau, en remplaçant l’eau tous les 3 jours, en suivant la méthode décrite par Song et ^al.35.
2. Appliquer l’accise sur les extrémités des racines en croissance active lorsqu’elles atteignent environ 1,0 à 2,0 cm de longueur et les traiter avec du α-bromonaphtalène saturé à 28 °C pendant 1,0 h.
3. Coupez les extrémités des racines à environ 1 cm et placez-les dans un mélange fraîchement préparé de méthanol et d’acide acétique glacial dans un rapport de volume de 3:1 à température ambiante (environ 20-25 °C) pendant 2-3 h. Ensuite, conservez-les au réfrigérateur à 4 °C, comme décrit par She et ^al.36.
4. Lavez soigneusement les extrémités fixes des racines (2-3 mm) dans de l’eau bi-distillée.
5. Préparez un mélange de cellulase et de pectine hydrolase dans un tampon d’acide citrique-citrate de sodium de 0,01 mM à pH 4,5, avec de la cellulase et de la pectine hydrolase à 1 % chacun. Placez les pointes de racines prétraitées dans le mélange et digérez à 28 °C pendant 1,0 à 1,5 h.
6. Lavez les pointes des racines digérées avec de l’eau doublement distillée, transférez-les sur une lame de verre et écrasez-les soigneusement avec le fixateur à l’aide d’une pince à pointes fines.
7. Faites sécher les lames sur la flamme d’une lampe à alcool jusqu’à ce que le brouillard d’eau disparaisse. À l’aide d’un microscope à contraste de phase, sélectionnez des lames avec plus de cinq phases divisées et sans chromosomes qui se chevauchent. Stockez les lames à -20 °C pour une utilisation future.

2. Coloration CPD

1. Préparez une solution de CPD en ajoutant du PI et du DAPI à un atténuateur anti-fluorescence à 30 % (v/v), où la concentration de PI est de 0,6 μg·^mL-1 et la concentration de DAPI est de 3 μg·^mL-1.
2. Sécher la lame chromosomique à 65 °C pendant 30 min.
3. Ajouter 100 μL de diluant de la RNase A (la solution de stockage de la RNase A diluée 100 fois avec 2x SSC (citrate de sodium salin), ce qui donne une concentration finale de 100 μg/mL) par lame de chromosome. Couvrez la lame et réchauffez-la dans une chambre humide à 37 °C pendant 30 à 60 min.
4. Lavez la lame chromosomique avec 2x SSC à température ambiante pendant trois intervalles de 5 minutes chacun.
5. Lavez la lame chromosomique à température ambiante pendant 1 à 2 min.
6. Ajouter 200 μL de diluant de pepsine (la solution de stockage de pepsine diluée 100 fois avec 0,01 N HCl pour obtenir une concentration finale de 5 μg/mL) par lame de chromosome. Couvrez la lame et incubez-la dans une chambre humide à 37 °C pendant 5 à 20 min.
7. Lavez les sections chromosomiques avec de l’eau ultra-pure à température ambiante pendant 2 min, puis lavez-les avec 2 xSSC à température ambiante pendant deux intervalles de 5 minutes chacun.
8. Fixez les lames avec une solution de méthanol : acide acétique glacial (3:1) pendant 10 min.
9. Laver avec 2x SSC à température ambiante pendant trois intervalles de 5 minutes chacun.
10. Traiter avec de l’éthanol à 70 %, 95 % et 100 % à -20 °C pendant 5 min chacun, puis sécher à température ambiante.
11. Prenez les lames chromosomiques traitées et séchées, ajoutez 30 μL de solution de coloration CPD à chaque lame, recouvrez d’une lamelle de 24 mm x 50 mm et colorez dans l’obscurité pendant plus de 30 minutes. Une grande quantité de chromosomes doit être colorée pendant la nuit.
12. Observez les lames de chromosomes au microscope à fluorescence, à l’aide d’un filtre d’excitation vert (WG) pour la coloration PI et d’un filtre ultraviolet (UV) pour la coloration DAPI. Capturez des images avec le logiciel compatible.
    1. Ajustez le temps d’exposition à travers les deux filtres pour obtenir des intensités de fluorescence rouge et bleue similaires lors de la capture d’image. L’image CPD est obtenue à partir des images en niveaux de gris colorées avec PI et DAPI. Les mesures chromosomiques et le traitement des images ont été effectués à l’aide du logiciel Adobe Photoshop.

3. Hybridation in situ en fluorescence

1. Préparez la solution hybride : DAP (10 μL), ADNss (2 μL), 20× SSC (2 μL), ADNr 5S (1 μL), ADNr 45S (1 μL) et sulfate de glucane à 50 % (4 μL). Après préparation, centrifugez la solution hybride (2500 x g, 5-10 min, à température ambiante) et placez-la sur de la glace.
2. Placez les lames numérisées dans le four à 65 °C pendant 30 à 60 min.
3. Retirer les lames cuites, ajouter 100 μL de solution de dénaturation de la DCP à 70 %, couvrir avec un verre de protection et dénaturer dans un four d’hybridation moléculaire à 85 °C pendant 2,5 min.
4. Retirez le verre de protection et plongez immédiatement les lames dans de l’éthanol froid à 70 %, 90 % et 100 %, en déshydratant successivement pendant 5 min chacune.
5. Retirez les lames et laissez-les sécher à température ambiante pendant plus de 30 min.
6. Ajoutez 20 μL de solution hybride à la lame, placez délicatement le verre de couverture sur le dessus jusqu’à ce que le liquide soit complètement diffusé, et laissez-le à température ambiante pendant 10 min pour humidifier la zone couverte de la lame.
7. Placez les lames dans une parabole hybride imbibée de 2× de SSC (la parabole hybride doit être une grande boîte de Pétri avec un couvercle enveloppé dans du papier d’aluminium pour faciliter l’utilisation à l’abri de la lumière) et incubez à 37 °C pendant la nuit (pendant au moins 6 h).
8. Contre-coloration des chromosomes en les enrobant de 3 μg·^mL-1 DAPI dans une solution à 30 % (v/v) de Vectashield H-100. Capturez l’image à l’aide d’un logiciel compatible, avec la fluorescence bleue du DAPI excitée par la lumière violette du filtre et la fluorescence rouge de l’IP excitée par la lumière verte, respectivement.
   REMARQUE : L’hybridation FISH a été réalisée à l’aide de sondes d’ADNr 45S et 5S sur des lames préalablement colorées par CPD, selon la méthode décrite par She et ^al.36.

4. Analyse du caryotype

1. Sélectionner cinq cellules mitotiques en métaphase pour chaque population dans laquelle les chromosomes sont bien dispersés (sans chevauchement) et modérément condensés (les chromosomes ne doivent pas être agrégés au maximum, mais les extrémités ne doivent pas être agglomérées), en suivant la méthodologie décrite par She et ^al.4.
2. Déterminez la longueur absolue de chaque chromosome en sélectionnant cinq chromosomes ayant la plus forte concentration lors de la division cellulaire.
3. Mesurez méticuleusement et précisément la longueur du bras long (L) et du bras court (S) de chaque chromosome, ainsi que la taille de chaque bande de pigment fluorescent sur le chromosome.
4. Calculer les paramètres suivants : (1) longueur relative des chromosomes (RL, pourcentage haploïde) ; (2) rapport de bras (AR = L/S, bras long/bras court) ; (3) longueur totale du chromosome haploïde (TCL ; longueur du caryotype) ; (4) longueur moyenne des chromosomes (C) ; (5) la taille de la bande de fluorescence (le pourcentage de la bande de fluorescence par rapport à la longueur du chromosome) ; (6) la distance entre le centromère et le site de l’ADNr ; (7) l’indice centromérique moyen (IC, calculé comme la longueur du bras court de chaque chromosome divisée par la longueur totale de ce chromosome, puis en faisant la moyenne de ces valeurs) ; (8) quatre indicateurs différents de l’asymétrie du caryotype, y compris l’indice de centromère (CVCI), le coefficient de variation (CV), le coefficient de variation de la longueur des chromosomes (CVCL), le coefficient d’asymétrie moyen du centromère (MCA) et la catégorie d’asymétrie de Stebbins.
   REMARQUE : Se référer aux méthodes de Paszko¹⁰ et Peruzzi et ^al.11 pour calculer l’indice d’asymétrie. Classez les chromosomes avec différents rapports de bras selon les cinq méthodes de classification de Levan. Disposer les chromosomes de Lycoris aurea (L’Hér.) Herbe par ordre décroissant de longueur, comme décrit dans le protocole³⁷ de Han et al.
5. Assurer la précision et l’exactitude de la méthodologie en dessinant des modèles de caryotype chromosomique basés sur les données de mesure des chromosomes combinées aux informations de bande de fluorescence et à la position et à la taille de l’ADNr-FISH.
6. La visualisation des relations asymétriques du caryotype des huit populations est une étape clé qui fournit des informations claires. Ceci est réalisé grâce à des diagrammes de dispersion bidimensionnels, qui sont utilisés pour obtenir leur MCA et CVCL.
7. Effectuer une analyse des coordonnées principales (PCoA) à l’aide du coefficient de similarité de Gower, une composante cruciale, selon les méthodes de She et ^al.38.
8. Calculer six paramètres quantitatifs (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) pour déterminer les caryotypes cytogénétiques des huit populations.
9. Effectuez des analyses statistiques à l’aide d’un programme d’analyse et de visualisation des données pour générer le dendrogramme basé sur UPGMA et le nuage de points PCoA.

Résultats

En utilisant la méthode méticuleuse d’immersion enzymatique et de séchage à la flamme (EMF), les chromosomes métaphasiques dispersés et bien différenciés de Lycoris aurea (L’Hér.) Des herbes ont été obtenues, et le caryotype chromosomique cytogénétique de Lycoris aurea a été construit (Figure 1). Les chromosomes métaphasiques présentant le degré de condensation le plus élevé ne conviennent pas à l’analyse du caryotype en raison des différences morphologiques réduites. Cependant, comme la longueur totale des chromosomes haploïdes (TCL) est comparable entre les populations, il est possible de distinguer les caryotypes des différentes populations de Lycoris aurea en comparant les différences de valeurs TCL. Les caractéristiques du caryotype et le contenu en ADN nucléaire de huit populations de Lycoris aurea sont présentés dans le tableau 1. La distribution des bandes de fluorescence et l’emplacement des sites d’ADNr 45S et 5S sont présentés dans le tableau 2. La figure 2 montre les mesures des chromosomes ainsi que les caractéristiques de bande de fluorescence ainsi que l’emplacement et la taille des signaux FISH de l’ADNr 45S et 5S.

Le nombre de chromosomes diploïdes est le suivant : 2n = 16 = 8m + 8t pour GXTL, 2n = 14 = 8m + 6t pour HBFC, 2n = 14 = 8m + 6t pour GZDS, 2n = 16 = 6m + 10t pour HNZX, 2n = 14 = 8m + 6t pour HBBD, 2n = 14 = 8m + 6t pour HNXN, 2n = 16 = 6m + 10t pour HBWF, et 2n + 1 = 15 = 7m + 8t pour SCLS (tableau 1). Comme décrit dans le protocole par She et ^al.4, les chromosomes en métaphase des huit populations de L. aurea sont petits, avec des longueurs chromosomiques moyennes allant de 1,01 μm (HNZX) à 2,08 μm (GZDS) et un TCL allant de 16,14 μm (HNZX) à 29,13 μm (GZDS). Les TCL des huit populations sont en corrélation avec les teneurs en ADN nucléaire déclarées (tableau 1). La plus petite plage de longueurs relatives (RRL) est observée dans HNXN (1,52-3,81), tandis que la plus grande est observée dans GZDS (2,73-5,86). Les populations HNXN et GZDS présentaient respectivement la plus petite et la plus grande variation de longueur des chromosomes. L’indice centromère (IC) moyen du génome variait entre 61,02 ± 5,63 (HBFC de population) et 70,70 ± 4,63 (HBWF de population). La population HBFC a montré le changement le plus faible de l’indice centromère, tandis que la population HBWF a montré les changements les plus importants.

Les caryotypes sont composés de chromosomes métacentriques (m) et télocentriques (t) (tableau 1 ; Figure 2), représentant les formes chromosomiques les plus courantes parmi les huit populations étudiées. Les huit différents indices d’asymétrie du caryotype sont présentés dans le tableau 1. Parmi ces indices, l’indice de coefficient de variation du centromère (CVCI) et l’asymétrie moyenne du centromère (MCA) caractérisent l’asymétrie intrachromosomique, tandis que le coefficient de variation de la longueur du chromosome (CVCL) mesure l’asymétrie interchromosomique. Les fourchettes pour les ICVC et les ACM sont les suivantes : ICVC = 10,97 (HBBD) à 18,25 (HBWF), et ACM = 28,85 (HNZX) à 39,30 (HBWF). Ces valeurs indiquent systématiquement que l’HBBD a l’asymétrie intrachromosomique la plus faible et que l’HBWF a la plus élevée. La fourchette pour CVCL est de 14,98 (GZDS) à 23,32 (HBWF), ce qui suggère que GZDS présente le caryotype le moins asymétrique, tandis que HBWF présente le caryotype le plus asymétrique parmi les huit populations. Selon les principes de classification de Stebbins⁹, ces caryotypes appartiennent à la classe 1B, ce qui indique que toutes les populations étudiées ont des caryotypes relativement symétriques.

Les relations d’asymétrie du caryotype chez les huit Lycoris aurea (L’Hérit.) Les populations de plantes sont illustrées à l’aide de diagrammes de dispersion bidimensionnels de CVCI par rapport à CVCL et de MCA par rapport à CVCL (figure 3). La structure du caryotype de ces populations, telle que révélée par les trois paires de paramètres - CVCI, CVCL et MCA - a des implications significatives. Ces paramètres présentent des asymétries de caryotype similaires. Les résultats des diagrammes de dispersion mettent en évidence l’impact potentiel de la recherche, montrant que la population HNXN a le caryotype le plus symétrique, tandis que les populations HBFC et HBWF présentent le plus grand nombre d’asymétries intrachromosomiques et interchromosomiques, respectivement (Figure 3).

Cette étude a méticuleusement classé les huit populations de Lycoris aurea en trois grands groupes sur la base du diagramme de l’arbre UPGMA avec cinq paramètres de caryotype (Figure 4). Le premier groupe, représenté par la population SCLS, forme un clade indépendant. Le deuxième groupe est constitué de HNXN et de HBWF. Le troisième groupe est divisé en deux sous-groupes : l’un ne comprend que les populations HBWF, GZDS et GXTL, tandis que les populations HBBD et GZDS sont regroupées dans une branche plus petite. Les relations caryologiques entre les populations étudiées, telles que révélées par l’analyse des coordonnées principales (PCoA), sont illustrées à la figure 5. Le graphique de dispersion PCoA indique que les huit populations peuvent être divisées en deux groupes avec un niveau de confiance de 68,36 %. Le premier groupe comprend HBWF, HBBD et GXTL, les trois premières populations étant étroitement regroupées. Le deuxième groupe comprend les HFFC, les HNXN, les HNZX et les SCLS, où les HBFC occupent la position intermédiaire entre les deux groupes, et les SCLS sont les plus isolés (figure 5).

La coloration inverse CPD (combinaison d’iodure de propidium et de DAPI) et de DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) sont des techniques standard utilisées pour observer la structure nucléaire et la distribution de la chromatine. Les résultats de cette étude ont révélé des phénomènes apparents d’hétérochromatine parmi huit populations de Lycoris aurea (L’Héritage). Herbe (Figure 1 et Figure 2 ; Tableau 2). Les résultats de l’hybridation FISH pour chaque population ont indiqué que toutes les régions chromosomiques correspondent aux loci de l’ADNr 45S et 5S. Les caractéristiques des bandes CPD sont illustrées à la figure 1A, C, E, G, I, K, M, O.

Dans les populations HBFC et HBBD, des bandes CPD ont été observées dans les régions centromériques et péricentromériques (figures 1G, K ; Figures 2D, F). Cependant, certains chromosomes ne présentaient pas de bandes CPD : les 3e et 8e chromosomes dans SCLS, le 1er chromosome dans HNXN, le 1er chromosome dans HNZX, le 1er chromosome dans HBWF, le 2e chromosome dans GZDS et le 2e chromosome dans GXTL (Figure 1A, C, E, I, J, M, O ; Figures 2A-C,E,G,H). Notamment, des bandes CPD ont également été trouvées sur les extrémités des bras courts des paires de chromosomes 5, 6 et 7 dans SCLS et HNXN, sur les paires 4, 5, 6, 7 et 8 chez HNZX, et sur les paires 5, 6 et 7 chez HBFC. De plus, des bandes CPD étaient présentes sur les extrémités des bras courts des chromosomes 4, 5, 6, 7 et 8 chez HBWF, sur les extrémités des bras courts des chromosomes 5, 6 et 7 chez HBBD et sur les extrémités des bras courts des chromosomes 5, 6, 7 et 8 chez GXTL (Figure 1A et Figure 2A).

Après hybridation FISH, la coloration inverse DAPI a formé des bandes fluorescentes brillantes autour des particules centrales des chromosomes 5, 6 et 7 dans les GZDS. Ces bandes, appelées bandes DAPI+ post-FISH, indiquent que ces régions d’hétérochromatine contiennent un nombre élevé de paires de bases A-T (Figure 2G). La fourchette des bandes de DPC (péri)centromériques observées dans les huit populations était de 25,00 % à 57,14 % (tableau 2), tandis que le nombre total de bandes de DPC terminales variait de 40,00 % à 71,43 % (tableau 2). Dans la population GZDS, les bandes DAPI+ post-FISH étaient corrélées avec la longueur du caryotype, représentant 42,86 % du total. Les tailles des bandes CPD d’ADNr, des bandes CPD non-ADNr et des bandes DAPI+ après FISH différaient significativement entre les différentes paires de chromosomes de Lycoris aurea (L’Hérit). Herbe (Figure 2 ; Tableau 2).

La technique FISH a été utilisée pour insérer des sondes d’ADNr 45S et 5S dans des chromosomes colorés au CPD, comme illustré à la figure 1. Le résumé du nombre et de la localisation des sites d’ADNr 45S et 5S dans les huit populations de Lycoris aurea (L’Hérit.) L’herbe est présentée dans le tableau 2 et illustrée à la figure 2. Notamment, des différences significatives dans le nombre, la taille et l’emplacement des loci d’ADNr parmi les huit populations soulignent l’importance de ces résultats. Au total, il y avait 30 loci d’ADNr 45S dans les huit populations. Parmi ceux-ci, 4 loci (13,33 %) étaient situés dans la région du centromère central, 9 (30,00 %) dans la région du centromère proche du centre et 17 (56,67 %) dans les régions terminales de leurs bras chromosomiques respectifs (Figure 2 ; Tableau 2).

Dans la population GXTL, un signal du locus de l’ADNr 45S a été trouvé dans la région du centromère du bras court du chromosome 4, tandis que quatre signaux supplémentaires ont été localisés dans la région du centromère des bras longs des chromosomes 5, 6, 7 et 8 (figure 1P ; Figure 2G). Dans la population HBFC, un locus d’ADNr 45S était positionné dans la région du centromère sur le bras court du chromosome 4, avec trois loci trouvés dans les régions d’hétérochromatine péricentromérique sur les bras courts des chromosomes 5, 6 et 8 (Figure 1H ; Figure 2D). Dans la population GZDS, un locus 45S était situé dans la région du centromère du bras court du chromosome 4 métacentrique (Figure 1N ; Figure 2G). Dans HNZX, cinq loci d’ADNr 45S ont été observés dans les zones terminales des bras courts des paires de chromosomes 4, 5, 6, 7 et 8 (Figure 1H ; Figure 2D). La répartition des sites 45S dans HBBD (figure 1J ; Graphique 2E) et HNXN (figure 1L ; Graphique 2F) était similaire, avec un locus dans la région du centromère du bras court du chromosome 4 et trois locus dans la région du centromère des bras courts des chromosomes 5, 6 et 7.

Dans HBWF, cinq signaux de loci d’ADNr 45S sont apparus dans les régions centromères du bras court des paires de chromosomes 4, 5, 6, 7 et 8 (Figure 1N ; Figure 2G). Dans SCLS, un signal de locus d’ADNr 45S a été trouvé dans les régions centromères des bras courts des paires de chromosomes 1 et 2, ainsi que dans les régions péricentromériques des bras courts des paires de chromosomes 5 et 6 (Figure 1P ; Figure 2H). Pour les loci d’ADNr 5S, un total de neuf ont été identifiés dans les huit taxons, dont 3 (33,33 %) situés dans les régions proximales, 3 (33,33 %) dans les régions péricentromériques et 3 (33,33 %) dans les régions terminales des bras chromosomiques respectifs (Figure 2 ; Tableau 2). Dans GXTL, un signal du locus de l’ADNr 5S est apparu près de l’extrémité terminale du bras long de la paire de chromosomes 6 (Figure 1P ; Figure 2G). La répartition des sites 5S était similaire dans les HBFC (figure 1H ; Graphique 2D) et GZDS (figure 1N ; Figure 2G), les deux contenant un locus d’ADNr 5S dans la région proximale du bras court du chromosome 7. Dans HNZX, un locus d’ADNr 5S a été trouvé près de l’extrémité terminale du bras long du chromosome 8 (Figure 1H ; Figure 2D), tandis que dans l’HBBD, un locus d’ADNr 5S a été identifié dans le chromosome 7 (Figure 1J ; Figure 2E). Dans HBWF, deux loci d’ADNr 5S sont apparus près de l’extrémité terminale des bras longs des chromosomes 4 et 8, deux autres dans le bras long du chromosome 7, un dans la région du centromère et un près de la fin (Figure 1N ; Figure 2G).

La combinaison des signaux FISH de l’ADNr 45S et 5S, ainsi que des caractéristiques du segment CPD terminal, a permis de distinguer efficacement tous les chromosomes mitotiques des différentes populations de Lycoris aurea (L’Hérit). Herbe. Dans les populations SCLS, HBFC, HBBD, GZDS et GXTL, le chromosome 1 présentait de forts signaux CPD dans la région centromérique. Le chromosome 2 présentait de forts signaux CPD dans la région centromérique, à l’exception de GZDS et GXTL. Le chromosome 3 a montré un fort signal CPD dans la région centromérique, à l’exception du SCLS. Le chromosome 4 présentait constamment de forts signaux CPD dans la région centromérique. Pour les chromosomes 5, 6 et 7, de forts signaux CPD ont été observés aux extrémités des bras courts. Le chromosome 4 a également montré de forts signaux d’ADNr 45S à l’extrémité du bras court, tandis que les chromosomes 5 et 6 avaient de forts signaux 45S dans leurs régions terminales, sauf dans GZDS. Notamment, un fort signal DAPI était présent dans la population GZDS. De plus, un faible signal d’ADNr 5S est apparu dans la région proximale du chromosome 7 chez les populations HBFC, HBWF, HBBD et GZDS.

Figure 1 : Chromosomes mitotiques de huit Lycoris aurea (L’Hér.) Populations d’herbes. Examen des chromosomes de métaphase mitotique de huit Lycoris aurea différents (L’Herit.) Les populations d’herbes sont indiquées, y compris la population SCLS (A,B), la population HNXN (C,D), la population HNZX (E,F), la population HBFC (G,H), la population HBWF (I,J) et la population HBBD (K,L). L’hybridation de GZDS (M,N) et GXTL (O,P) a été réalisée à l’aide de FISH avec des sondes d’ADNr 45S marquées à la biotine et 5S marquées à la digoxine après coloration CPD. Les images résultantes des chromosomes après coloration CPD affichent des signaux d’ADNr 45S (vert) et 5S (rouge). L’ADN total a été teint à l’envers avec un colorant DAPI, ce qui a donné une couleur bleue. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Diagrammes de caryotypes chromosomiques de huit Lycoris aurea (L’Hér.) Populations d’herbes. Le diagramme de la configuration chromosomique de huit populations de Lycoris aurea (L’Herit.) Herb révèle les caractéristiques de la bande de fluorescence, ainsi que l’emplacement et la taille des signaux FISH d’ADNr 45S et 5S. Les populations SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS et GXTL sont représentées par (A-H), respectivement. L’échelle ordonnée indique la longueur relative du chromosome (le pourcentage de ce chromosome dans le génome haploïde), et le nombre en haut indique le numéro de série du chromosome. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Nuages de points pour huit Lycoris aurea (L’Hér.) Populations d’herbes basées sur trois paramètres de caryotype. (A) L’indice CVCI est comparé à l’indice CVCL. (B) L’indice MCA est comparé à l’indice CVCL. Les populations SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS et GXTL sont indiquées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Le dendrogramme UPGMA de huit Lycoris aurea (L’Hér.) Populations d’herbes. Le dendrogramme UPGMA est basé sur les paramètres x, 2n, TCL, MCA, CVCL et CVCI pour les huit Lycoris aurea (L’Hér.) Populations d’herbes : SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS et GXTL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : PCoA des huit Lycoris aurea (L’Hér.) Variétés d’herbes basées sur six paramètres de caryotype. Le PCoA est basé sur les paramètres x, 2n, TCL, MCA, CVCL et CVCI, représentant SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS et GXTL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Noms de huit Lycoris aurea (L’Hér.) Populations d’herbes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Distribution des bandes fluorochromes et des sites d’ADNr chez les huit Lycoris aurea (L’Hér.) Populations d’herbes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Les sondes utilisées dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La préparation de Lycoris aurea (L’Hér.) Les chromosomes racinaires des herbes impliquent plusieurs étapes critiques : (1) cultiver les racines par hydroponie, (2) traiter les extrémités des racines avec du α-bromonaphtalène saturé, (3) fixer les racines à l’aide d’une solution d’acide alcool-acétique, (4) effectuer une hydrolyse enzymatique sur les extrémités des racines avec une solution enzymatique, et (5) écraser soigneusement les racines digérées et sécher les lames sur une flamme de lampe à alcool.

Une mesure précise des chromosomes est essentielle pour l’analyse du caryotype dans les études cytogénétiques. Les chromosomes doivent présenter une condensation notable et des limites clairement définies ; Sinon, le calcul précis des paramètres chromosomiques devient difficile⁵. Des recherches cytogénétiques antérieures ont montré que la différenciation morphologique des chromosomes mitotiques dépend du degré de condensation ^4,36. Lorsque la condensation est insuffisante, les extrémités des bras chromosomiques peuvent encore être désagglutinées, ce qui entraîne des limites chromosomiques peu claires. Cependant, lorsque les chromosomes atteignent leur condensation maximale, les différences morphologiques entre les chromosomes diminuent. Par conséquent, la sélection de chromosomes à condensation modérée est cruciale pour l’identification et la mesure des chromosomes, en particulier dans les populations avec moins de chromosomes.

Le marquage par sonde est crucial pour la réussite de l’hybridation in situ des FISH, en particulier pour la solution de sonde d’ADNr 5S. En raison de la courte séquence d’ADNr 5S, la concentration des séquences cibles marquées par PCR est généralement faible, ce qui entraîne de faibles signaux d’hybridation. Cependant, la synthèse directe de sondes marquées à la fluorescéine produit des signaux d’hybridation plus forts et simplifie le processus. Pour la solution de sonde d’ADNr 45S, des séquences partielles des régions codant pour l’ARNr 5.8S, 18S et 25S d’Arabidopsis thaliana ont été marquées aux extrémités 5' et 3' avec de la 6-carboxyl-tétraméthyl rhodamine (TAMRA), puis mélangées. La solution de sonde d’ADNr de fluorescéine 5S a été obtenue à l’aide de séquences nucléotidiques 1-59 et 60-118 de la région codant du gène de l’ARNr 5S d’Arabidopsis , chaque séquence étant marquée à l’extrémité 5' avec de la fluorescéine 6-carboxyle (6-FAM), puis mélangée.

Dans cette étude, nous avons exploité les différences entre les colorants DAPI et PI dans la liaison à l’ADN et les avons combinées pour obtenir des bandes fluorescentes claires. Les colorants à l’iodure de propidium (PI) peuvent pénétrer les membranes cellulaires et se lier aux molécules d’ADN à l’intérieur des cellules. En revanche, le DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) se lie préférentiellement aux régions d’ADN riches en AT, fournissant une coloration claire et à contraste élevé. En raison de ces propriétés complémentaires, le DAPI et le PI sont souvent utilisés ensemble, ce que l’on appelle la coloration CPD, pour recueillir simultanément des informations sur le noyau et le cytoplasme. Les différences dans la présence, l’emplacement et la taille des bandes CPD et DAPI+ ont révélé une différenciation significative de l’hétérochromatine dans les huit populations de Lycoris aurea. La coloration CPD a montré des régions d’hétérochromatine riches en contenu GC à la fois dans les régions centromériques et péricentromériques et dans les chromosomes télocentriques.

L’étude de l’asymétrie du caryotype est une approche taxonomique cytogénétique populaire, abordable et largement utilisée qui intègre une gamme de paramètres et d’indicateurs, y compris des mesures qualitatives et quantitatives, des paramètres de classification de Stebbins et divers indices quantitatifs (par exemple, Paszko¹⁰ ; Peruzzi et ^al.11). Parmi ceux-ci, le rapport R et le CVCL sont utilisés pour mesurer l’asymétrie chromosomique, tandis que le CVCI et le MCA représentent des indicateurs clés de l’asymétrie chromosomique. Notamment, CVCL est considéré comme un paramètre statistique robuste pour estimer l’asymétrie interchromosomique¹⁰, et la métrique de l’asymétrie chromosomique (MCA) est reconnue comme une mesure efficace pour évaluer l’asymétrie intrachromosomique¹¹. Pour représenter au mieux les asymétries de caryotype entre les populations, il est recommandé d’utiliser un nuage de points bidimensionnel, avec deux estimateurs d’asymétrie placés sur les axes x et y, respectivement, où chaque échantillon est représenté par un point^11,12. Les résultats ont montré que les diagrammes de dispersion bidimensionnels de CVCL vs. CVCI, ainsi que MCA vs. CVCL, illustrent efficacement les relations d’asymétrie du caryotype entre les huit populations distinctes de Lycoris aurea (L′Herit.) Herb, soutenant la fiabilité de ces indices dans l’évaluation de l’asymétrie chromosomique.

Pour comparer les caryotypes et reconstruire les relations caryologiques entre les huit populations, cette étude a appliqué la méthodologie proposée par Peruzzi et ^al.11, en utilisant les paramètres x, 2n, TCL, MCA, CVCL et CVCI. Les résultats ont révélé que les populations de HBWF, de GZDS, de HBBD et de GXTL étaient étroitement liées, les HBFC se situant entre ces groupes. Par conséquent, la PCoA basée sur ces six paramètres s’est avérée être une méthode très efficace pour différencier les relations entre les huit populations. Cependant, certains modèles complexes ont également émergé de l’arbre évolutif moléculaire construit. Par exemple, alors que HNZX semblait étroitement lié à HBWF dans l’arbre phylogénétique moléculaire, il était plus éloigné dans le graphique de dispersion PCoA. Cette complexité souligne l’importance d’utiliser plusieurs approches quantitatives pour prédire les tendances de l’évolution du caryotype chez Lycoris, en complétant les caractéristiques de classification moléculaire.

Les plantes de cette étude ont été échantillonnées dans le centre et l’ouest de la Chine, y compris le comté de Tianlin, la province du Guangxi (GXTL), le comté de Fang, la province du Hubei (HBFC), le comté de Dushan, la province du Guizhou (GZDS), le comté de Zixing, la province du Hunan (HNZX), le comté de Badong, la province du Hubei (HBBD), le comté de Xinning, la province du Hunan (HNXN), le comté de Wufeng, la province du Hubei (HBWF) et le comté de Lushan, province du Sichuan (SCLS). Un spécimen de référence a été conservé à l’herbier de l’Université de Huaihua. Cette étude a révélé que la combinaison des signaux FISH de l’ADNr 45S et 5S et des caractéristiques du segment terminal CPD distinguait efficacement tous les chromosomes mitotiques des différentes populations de Lycoris aurea (L’Herit). Herbe. Le protocole présenté ici vise à étudier la distribution de l’hétérochromatine parmi différentes populations de Lycoris aurea (L′Herit.) Herbe. La coloration inverse CPD (une combinaison de PI et de DAPI) et DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) sont des techniques établies pour observer la structure nucléaire et la distribution de la chromatine. Le marquage fluorescent direct des régions du gène de l’ARNr 18S-5.8-26S (régions de l’ADNr 45S) et de l’ADN ribosomique 5S pour l’hybridation du chromosome FISH est simple et fournit des signaux d’hybridation robustes. Cette distinction qualitative sera de plus en plus précieuse dans l’analyse de diverses populations.

Cette méthode est la mieux adaptée aux espèces végétales capables de cultiver rapidement l’extrémité des racines, car la culture de l’extrémité des racines est nécessaire pendant la mitose active. En raison de la courte séquence 5S, l’étude a utilisé la séquence nucléotidique 1-118bp de la région codant du gène de l’ARNr 5S d’Arabidopsis thaliana comme sonde d’ADNr 5S. En raison de sa séquence courte et de son signal faible, cette méthode n’est efficace que pour identifier les espèces dont les bases sont relativement conservées dans la région 1-118bp du gène de l’ARNr 5S. La sélection de chromosomes en métaphase avec une condensation modérée est cruciale pour le succès de la méthode. La condensation des chromosomes est étroitement liée au moment de la récolte des racines, à la durée du prétraitement et à la cuisson à la flamme. Par conséquent, la technique nécessite un contrôle précis de chaque étape pour garantir le succès de l’expérience.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alcool	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A500737-0005	(70 %,  ; 90 %,  ; 100 %)
1& fois ; TNT	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B548108	1&fois ;, 10&fois ;
2&fois ; SSC	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B548109	2&fois ;, 20&fois ;
45S  ; rDNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		TAMRA est ajouté aux deux extrémités (5 ' et 3' extrémités)
4'6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E607303	20ml
5S  ; rDNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		5 'end plus 6-FAM(FITC)
Logiciel Adobe Photoshop	Adobe Systems Incorporated	CS6
Alpha bromo-naphtalène	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A602718
Saturation Agent anti-épuisement	professionnel Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	Vectashield H-1000	10 mL
Incubateur biochimique	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD	LRH-70
Cellulase	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A426068	10 g
d’acide citrique	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A501702	10 g
de formamide désionisé (FAD)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600211-0500	0.7
Sulfate de dextran	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A428229	10 mL
Instrument d’hybridation in situ par fluorescence	USA/Abbott ThermoBrite	S500-24
Microscope à fluorescence	Olympus  ; Chine  ; Co.ltd	BX60
Acide acétique glacial	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A501931	500 mL
HCl	Aladdin Reagent  ;Co.  ;Ltd. (Shanghai)	H399657	500 mL
Machine à glace	Dan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.	ST-70
Microscope biologique Leica	Allemagne Leica Instrument Co., LTD	DM6000B
Alcool méthylique	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A601617	500 mL
Logiciel MetMorph	Molecular Devices	Version 7.35
Four	Thermo Scientific&trade ; Heratherm&trade ;	THM#51028152
Pectinase	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A004297	10 g
de Pepsin	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	1.07185	100 g Iodure
de propidium(PI)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A425259	1 g
RNaseA	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	R4642	10 mg
spermatozoïde de saumon(ssDNA)	Réactif Aladdin  ;Co.  ;Ltd. (Shanghai)	D119871	1 g
Citrate de sodium	Réactif Aladdin  ;Co.  ;Ltd. (Shanghai)	S189183	10 g
Statistica pour Windows 10.0  ;			pour l’analyse statistique