Mesure de l’activité enzymatique d’enzymes désubiquitylantes associées à des troubles neurodéveloppementaux au moyen d’un test de clivage de la chaîne d’ubiquitine in vitro

Résumé

Ce protocole explique comment mesurer l’effet de la variation génétique associée aux troubles neurodéveloppementaux sur l’activité de l’enzyme de désubiquitylation en combinant la purification des protéines recombinantes avec des tests de clivage de la chaîne d’ubiquitine.

Résumé

Les troubles neurodéveloppementaux (TND) sont associés à des altérations de la fonction du système nerveux, mais restent souvent mal compris au niveau moléculaire. Les troubles discrets causés par des gènes uniques fournissent des modèles pour étudier les mécanismes à l’origine du neurodéveloppement atypique. Des variants de gènes codant pour des protéines de la famille des enzymes deubiquitylantes (DUB) sont associés à plusieurs NDD, mais il est nécessaire de déterminer les mécanismes pathogènes des troubles induits par ces variants génétiques. L’impact des variantes génétiques sur l’activité de DUB peut être déterminé expérimentalement à l’aide d’un test de clivage de l’ubiquitine in vitro indépendant du substrat. Ce test ne nécessite pas de connaissance des substrats en aval pour mesurer directement l’activité catalytique. Ici, le protocole permettant de déterminer l’impact des variantes génétiques sur l’activité enzymatique est modélisé à l’aide de la protéase spécifique de l’ubiquitine DUB 27, liée à l’X (USP27X), qui est mutée dans la déficience intellectuelle liée à l’X 105 (XLID105). Ce pipeline expérimental peut être utilisé pour clarifier les mécanismes sous-jacents aux troubles neurodéveloppementaux induits par des variantes des gènes DUB.

Introduction

Les troubles neurodéveloppementaux (TND) résultent de diverses étiologies avec des déterminants environnementaux ou génétiques qui entraînent le développement atypique du système nerveux¹. Les tests génétiques de séquençage de nouvelle génération ont permis d’établir un lien entre un nombre croissant de variantes des gènes liés au système ubiquitine et les NDD génétiques². Le système ubiquitine catalyse la ligature de l’ubiquitine, un petit modificateur protéique, principalement aux résidus de lysine dans les substrats protéiques pour entraîner des changements dans le comportement cellulaire, y compris la localisation, la stabilité, les interactions protéine-protéine ou l’activité³. L’ubiquitylation est médiée par les enzymes E1 activatrices, E2 conjuguées et E3 ligases⁴ et est réversible par l’activité des enzymes désubiquitylantes (DUBs) qui catalysent le clivage et l’élimination de l’ubiquitine des substrats protéiques⁵. L’ubiquitine peut être ligaturée au substrat sous forme de monomère (monoubiquitylation) ou de chaînes polymères (polyubiquitylation) qui se forment sur l’un des sept résidus de lysine (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) ou le résidu M1 de l’ubiquitine. Ces différentes topologies de chaîne d’ubiquitine et leurs combinaisons créent un code cellulaire clé pour la transduction^{du signal 6}.

Les DUB tels que USP27X, USP7, USP9X, USP48, STAMBP, OTUD4, OTUD6B et OTUD5 ont été associés aux NDD^{2, 7, 8, 9, 10, 11}. Pour la plupart des NDD, les mécanismes moléculaires à l’origine de la pathogenèse restent expérimentalement indéfinis. Certains des DUB à l’origine de troubles récemment décrits sont mal compris et ne disposent pas de données cellulaires connues pouvant être utilisées pour évaluer l’impact de la variation génétique sur la fonction des protéines. In vitro, les tests de clivage de la chaîne d’ubiquitine surmontent cette limitation en tant que lectures de l’activité DUB indépendantes du substrat qui peuvent mesurer l’impact des variantes génétiques sur l’activité enzymatique¹².

Les tests de clivage in vitro de l’ubiquitine sont utilisés depuis les années 1980. Ces analyses utilisant des substrats radiomarqués ont permis de découvrir les premiers DUBs, y compris l’isopeptidase, identifiée pour sa capacité à désubiquityler l’histone H2A¹³, et l’ubiquitine carboxyl-terminale hydrolase (UCH), identifiée par sa capacité à hydrolyser l’ubiquitine à partir d’une variété de conjugués chimiques 14,15,16. De plus, des protéines ou des peptides polyubiquitylés radiomarqués ont été utilisés pour identifier l’isopeptidase T et plusieurs UCH et protéases spécifiques à l’ubiquitine (UBP) des érythrocytes et des muscles squelettiques, respectivement 17,18,19,20. Des chaînes d’ubiquitine d’une longueur définie et d’un type de liaison (tétra-ubiquitine liée à K48) ont d’abord été utilisées pour mesurer l’activité DUB de l’isopeptidase T²¹. Depuis lors, ce test est devenu l’étalon-or pour mesurer l’activité de DUB dans les analyses mutationnelles^22,23. Le raffinement de ce test permet actuellement de visualiser le clivage de l’ubiquitine par électrophorèse et des colorants sur gel conventionnels tels que le bleu de Coomassie, l’orange SYPRO, le rubis et la coloration argentée ou la détection fluorescente ou basée sur l’immunobuvardage^12,24. Les aspects moléculaires de l’activité de la DUB, tels que la longueur minimale de la chaîne et la spécificité de liaison 25,26,27,28, peuvent être clarifiés en utilisant des chaînes d’ubiquitine de différentes longueurs (par exemple, di-, tri-, tétra-ubiquitine) et de liaisons (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, linéaire) dans les essais fonctionnels. Les variantes associées à la NDD peuvent entraîner des défauts d’activité DUB spécifiques au type de liaison de la chaîne d’ubiquitine¹¹.

Un test de clivage de la di-ubiquitine utilisant des protéines DUB recombinantes purifiées peut mesurer directement l’impact des variants de la NDD sur l’activité de la DUB. USP27X, qui est muté dans le trouble de déficience intellectuelle lié à l’X NDD 105 (XLID105)^7,28, modélise le processus présenté ici. Cette approche permet de déterminer comment l’activité des DUB est perturbée par des variantes génétiques dans les NDD associés aux DUB existants et inconnus.

Protocole

Le protocole suivant peut être adapté aux protéines recombinantes en utilisant divers marqueurs d’affinité exprimés dans différentes souches de cellules compétentes. Selon la protéine exprimée, les conditions de culture et d’expression pendant la nuit peuvent nécessiter l’optimisation de la DO₆₀₀ au niveau de l’induction de l’expression, du temps d’expression, de la température d’expression et de la concentration IPTG. La figure 1 illustre une vue d’ensemble du protocole. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Transformation de cellules E. coli Rosetta 2 compétentes avec le plasmide d’expression recombinant GST-USP27X

REMARQUE : Pour maintenir la stérilité de la culture bactérienne, effectuez des étapes où les récipients de milieu sont ouverts sous une flamme de bec Bunsen. Pour permettre un transfert optimal de l’oxygène, effectuez l’agitation de la culture bactérienne dans un agitateur de paillasse à température contrôlée avec une orbite de 19 mm à 50 mm et une vitesse de 200 tr/min²⁹.

1. Décongeler 20 μL de cellules E. coli Rosetta 2 chimiquement compétentes sur de la glace immédiatement avant utilisation. Ajoutez 1 à 10 ng du plasmide d’expression pGEX6P1-USP27X (codant pour la glutathion-S-transférase N-terminale (GST)³⁰ marquée USP27X et contenant une résistance à l’ampicilline) et incubez 5 min sur de la glace.
2. Choc thermique pendant 30 s à 42 °C dans un bain sec. Incuber sur glace pendant 2 min.
3. Ajouter 80 μL de fluide SOC à température ambiante (RT). Incuber pendant 60 min à 37 °C avec une rotation de 200 tr/min dans un agitateur de paillasse à température contrôlée de 19 mm.
4. Plaque de 50 μL de culture sur une plaque de gélose LB complétée par 25 μg/L de chloramphénicol et 50 μg/L d’ampicilline. Incuber pendant 20 h à 37 °C, couvercle vers le bas, dans un incubateur à température contrôlée.

2. Expression bactérienne nocturne de la protéine recombinante à partir du plasmide d’expression

REMARQUES : Pour maintenir la stérilité de la culture bactérienne, effectuez des étapes où les récipients de milieu sont ouverts sous une flamme de bec Bunsen. Pour permettre un transfert optimal de l’oxygène, effectuez l’agitation de la culture bactérienne dans un agitateur de paillasse à température contrôlée avec une orbite de 19 mm à 50 mm et une vitesse de 200 tr/min²⁹. Mesurez la culture OD₆₀₀ à l’aide d’un spectrophotomètre.

1. Préparez 1 L de milieu Terrific Broth (TB) en ajoutant 47,6 g de poudre de TB à 1 L d’eau ultrapure avec 0,4 % de glycérol dans une fiole de culture à chicanes de 2 L. Autoclave moyen pendant 30 min et refroidir à RT.
2. Prélever une seule colonie de bactéries transformées et l’ajouter à 10 ml de milieu LB stérile complété par 25 μg/L de chloramphénicol et 50 μg/L d’ampicilline. Incuber pendant 20 h à 37 °C avec une rotation de 200 tr/min dans un agitateur de paillasse à température contrôlée de 19 mm.
3. Ajouter 10 mL de culture de nuit à 1 L de milieu TB complété par 25 μg/L de chloramphénicol et 50 μg/L d’ampicilline (rapport de 1:100 entre la culture initiale et la culture d’expression). Incuber à 37 °C avec une rotation de 200 tr/min dans un agitateur de paillasse à température contrôlée de 19 mm jusqu’à ce que la quantité de culture OD₆₀₀ soit comprise entre 0,5 et 0,6.
4. Ajouter 50 μM d’IPTG à la culture pour induire l’expression, refroidir à 16 °C et incuber pendant 20 h à 16 °C avec une rotation de 200 tr/min.
5. Cellules en granulés issues de la culture d’expression par centrifugation pendant 20 min à ≥3 000 x g et 4 °C. Conservez le granulé à -80 °C pendant au moins 1 h.
   REMARQUE : À ce stade, l’expérience peut être interrompue et recommencée plus tard (de préférence la même semaine). Le granulé peut être stocké à long terme à -80 °C.

3. Purification des protéines par colonne d’affinité gravité-flux

REMARQUE : Les tampons de résine, de liaison, de lavage, d’élution et de stockage appropriés pour chaque purification dépendront de la protéine recombinante purifiée. Prélevez des échantillons de la pastille cellulaire, du surnageant, de l’écoulement, des fractions de lavage et des fractions d’élution dans le tampon SDS-PAGE. Effectuer la coloration SDS-PAGE et Coomassie des échantillons afin d’évaluer le succès de la purification. Effectuer la purification à 4 °C et manipuler les fractions sur glace. Le clivage des marqueurs protéiques peut être effectué sur ou hors de la colonne à l’aide de la protéase appropriée pour cibler le site de clivage spécifique à la protéase pertinent.

1. Fixez la colonne d’écoulement par gravité vide dans le support de l’autoclave et remplissez-la de résine de glutathion et d’agarose. Utilisez 2 à 3 ml de résine pour purifier une pastille cellulaire recueillie à partir de 1 L de culture d’expression.
2. Lavez la colonne avec un volume de lit de résine à 20 % d’éthanol. Laver la colonne 3 fois avec un volume de lit de résine de tampon MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP). Arrêtez la colonne pour que la résine reste recouverte d’un tampon pour éviter le dessèchement lors de la préparation de la pastille de cellule.
3. Décongeler la pastille cellulaire à 4 °C. Ajouter 30 mL de tampon MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP, 60 mg de lysozyme et un comprimé d’inhibiteur de protéase) à la pastille décongelée. Laisser reposer pendant 30 min à 4 °C avec une rotation douce d’un bout à l’autre.
4. Sonicate lyse les cellules dans un tube à centrifuger de 50 mL ou un bécher métallique sur de la glace jusqu’à ce que le lysat s’écoule librement lorsqu’il est distribué à partir d’une pointe de pipette. Centrifuger pendant 30 min à 4 °C et ≥20 000 x g pour éliminer le surnageant.
   REMARQUE : Déterminez les paramètres du sonicateur de manière empirique. Réglez le sonicateur de telle sorte qu’un temps total de 120 s soit suffisant pour réduire le lysat visqueux en un liquide fluide et transparent.
5. Décantez le surnageant dans un bécher et chargez le lysat dégagé sur la colonne. Faites passer le lysat à travers la colonne par écoulement par gravité tout en recueillant le flux. Chargez la colonne avec le flux collecté et faites-le passer à travers la colonne.
6. Laver la colonne avec au moins deux volumes de tampon de lavage MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP) 5 fois. Recueillir le flux de lavage en fractions de 5 ml. Ajoutez 1 μL de chaque fraction à 100 μL de réactif Bradford pour vérifier visuellement la présence de protéines. Lavez jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de protéines non liées lors du dernier lavage, en ajoutant des étapes de lavage supplémentaires si nécessaire.
7. Récupérez la protéine en faisant passer le tampon d’élution MS500 (tampon MS500 complété par 10 mM de glutathion et 10 mM de NaOH) à travers la colonne, en collectant 5 mL de fractions d’élution. Vérifiez la présence de protéines en ajoutant 1 μL d’éluat à 100 μL de réactif Bradford. Arrêtez de collecter des fractions lorsque le réactif de Bradford n’indique plus la présence de protéines.
8. Effectuer l’échange de tampon par précipitation et centrifugation. Précipiter la protéine en ajoutant 2 volumes de 4 M de sulfate d’ammonium à l’éluat, en l’inversant doucement jusqu’à ce qu’il soit trouble, puis en centrifugeant pendant 30 minutes à 4 °C et ≥20 000 x g , puis à nouveau pendant 5 minutes supplémentaires. Retirer le surnageant après chaque centrifugation sans perturber la pastille de protéine.
9. Redissolvez et stockez les protéines dans MS500 complété par 25% de glycérol. Conservez les granulés de protéines ou les protéines dans un tampon de stockage à -80 °C.

4. Essai in vitro de clivage de la chaîne d’ubiquitine

REMARQUE : Sélectionner la longueur de la chaîne d’ubiquitine et les types de liaison en fonction de la spécificité DUB décrite dans les rapports précédents³¹ ou déterminée empiriquement. Si nécessaire, ce protocole pourrait être utilisé pour tester l’activité de la DUB de type sauvage d’intérêt sur un panel de chaînes d’ubiquitine disponibles dans le commerce de longueur et de type de liaison définis. Une quantité de chaîne de di-ubiquitine de 375-750 ng et une concentration de DUB de 1-2 μM peuvent être utilisées comme points de départ pour le test²⁷.

1. Préparez 10 tampons d’activation DUB (500 mM de Tris-HCl pH 7,5, 500 mM de NaCl et 100 mM de TCEP).
2. Pour chaque point temporel de chaque DUB, préparez un total de 10 μL de 2 μM de GST-USP27X purifié dans 1 tampon d’activation DUB (mélange DUB). Préparez des mixages maîtres et divisez-les en points temporels.
3. Incuber le mélange DUB pendant 10 min à RT.
4. Ajoutez 7 μL de tampon de chargement SDS-PAGE au temps 0 avant d’ajouter des chaînes d’ubiquitine pour empêcher la réaction de désubiquitylation de démarrer.
5. À chaque point temporel de chaque DUB, ajoutez 375 ng de chaînes de di-ubiquitine K-63 diluées dans 10 μL 1x tampon d’activation DUB. Le volume total est de 20 μL par réaction.
6. Incuber les tubes à 30 °C, en arrêtant chaque point temporel avec 7 μL de tampon de chargement SDS-PAGE.
7. Effectuer SDS-PAGE avec un gel à gradient de 4 % à 12 % et l’immunoblot ^7,32 pour l’ubiquitine et l’USP27X afin d’analyser le changement de la présence de mono-ubiquitine à des points temporels sélectionnés.

Figure 1 : Schéma du plan d’étude. (A) Transformation de cellules E. coli compétentes avec un plasmide d’expression de protéines recombinantes. (B) Expression bactérienne nocturne de la protéine deubiquitylase recombinante. (C) Purification protéique de la deubiquitylase recombinante à l’aide d’une colonne d’affinité gravité-flux. (D) Essai in vitro de clivage de la chaîne d’ubiquitine pour évaluer l’activité de désubiquitylation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Pour déterminer l’impact des variants associés à la XLID105 sur l’activité catalytique de l’USP27X, les protéines USP27X de type sauvage marquées GST et les protéines USP27X des variants F313V, Y381H et S404N associées à la XLID105 ont été purifiées à partir de bactéries. Ces variantes sont situées dans le domaine catalytique USP de l’USP27X (Figure 2A). Étant donné qu’USP27X avait déjà été signalé pour cliver les chaînes d’ubiquitine^{K63 31}, l’USP27X de type sauvage et les variantes associées à la XLID105 les protéines USP27V F313V, Y381H et S404N ont été incubées avec des chaînes de di-ubiquitine liées à K63 pendant 1 h. Ces échantillons ont été séparés par SDS-PAGE³², et les protéines ubiquitine et USP27X ont été analysées par immunoblot. L’USP27X de type sauvage induit le clivage de la di-ubiquitine, générant de la mono-ubiquitine (Figure 2B et Figure supplémentaire 1). Les protéines variantes F313V, Y381H et S404N USP27X associées à XLID105 n’ont pas clivé ces chaînes. Étant donné que les variants F313V, Y381H et S404N perturbent l’activité catalytique de l’USP27X, la perturbation fonctionnelle de l’USP27X semble être le principal mécanisme sous-jacent à l’XLID105⁷. Des quantifications supplémentaires et des expériences complémentaires ont déjà été signalées⁷.

Figure 2 : Impact des variants XLID105 sur l’activité de désubiquitylation de l’USP27X. (A) Schéma de la structure de la protéine USP27X humaine, montrant le nombre de résidus et l’emplacement des variants XLID105 évalués dans le domaine USP (violet). (B) Les variantes USP27X et XLID105 de type sauvage marquées GST (F313V, Y381H et S404N) ont été incubées avec des chaînes de di-ubiquitine K63 pendant les temps indiqués. L’analyse immunoblot a été effectuée à l’aide d’anticorps anti-GST (USP27X) et d’ubiquitine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Taches non rognées de la figure 2B. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cet article présente un protocole pour l’expression et la purification de DUBs recombinants USP27X et un test de clivage de la chaîne d’ubiquitine in vitro pour comparer l’activité de désubiquitylation de l’USP27X de type sauvage et des protéines variantes associées à la NDD. Ce test a déterminé que les variants associés à XLID105 perturbent l’activité catalytique de l’USP27X⁷. Cette compréhension mécaniste nous a aidés à définir XLID105 comme un trouble de perturbation fonctionnelle USP27X.

Ce protocole peut être adapté à d’autres DUBs associés à des maladies génétiques dont les mécanismes moléculaires sont mal compris. L’optimisation du protocole d’expression et de purification d’un DUB d’intérêt spécifique est cruciale. Si aucun protocole spécifique n’a été décrit pour un DUB d’intérêt donné, la méthode décrite ici peut servir de point de départ. Lors de l’optimisation d’un protocole d’expression et de purification d’une protéine, les étapes critiques comprennent la sélection des paramètres appropriés pour (1) le système d’expression (par exemple, des souches bactériennes, des cellules d’insectes ou des cellules de mammifères), (2) les vecteurs d’expression, (3) l’étiquette et la résine d’affinité à utiliser, (4) les conditions de croissance, (5) les quantités de culture et (6) la nécessité d’une purification supplémentaire (par exemple, par exclusion stérique ou chromatographie d’échange d’ions). Des recommandations spécifiques pour ces aspects et d’autres de la méthode ont été^{discutées 33}.

Le test de clivage de la chaîne d’ubiquitine in vitro est un moyen simple de mesurer l’activité de désubiquitylation des DUB de type sauvage ou mutants. Une analyse temporelle du clivage de l’ubiquitine peut fournir des informations sur les effets de la variation génétique sur la cinétique enzymatique DUB en permettant de déterminer des paramètres tels que le K_{, m} et V_max. Cela permettrait de distinguer les défauts du site actif DUB qui nuisent à la catalyse (réduction de V_max) et ceux qui nuisent à la reconnaissance du substrat (augmentation de K_m). La polyvalence de ce test provient de la variété de chaînes d’ubiquitine qui peuvent être utilisées pour fournir des informations mécanistes distinctes sur un DUB d’intérêt. Des chaînes d’ubiquitine de différentes longueurs et topologies de liaison sont disponibles dans le commerce, ce qui rend ce test accessible aux non-experts. Des DUB spécifiques ont des propriétés uniques pour la cinétique enzymatique, la reconnaissance de liaison et le clivage. Les étapes critiques de ce test comprennent (1) la définition d’une concentration de travail du DUB, (2) la détermination du temps de réaction optimal, (3) le choix du type et de la longueur de la liaison de la chaîne d’ubiquitine et (4) la sélection d’une méthode de détection.

Les tests de clivage de la chaîne d’ubiquitine mesurent l’impact des variants NDD sur l’activité de DUB ^7,11, aidant à identifier les variants qui perturbent l’activité de DUB et entraînent un développement atypique. Ce test peut être utilisé dans une gamme de situations où la variation génétique entraîne une pathologie, y compris le cancer et la neurodégénérescence. Dans le cadre d’un test indépendant du substrat, il n’est pas nécessaire d’identifier au préalable un substrat protéique ubiquitylé spécifique. Cependant, le test se limite à mesurer les changements dans l’activité du clivage de la chaîne d’ubiquitine et ne peut pas évaluer les effets des variants sur les fonctions DUB telles que les interactions protéine-protéine, la localisation subcellulaire et les modifications post-traductionnelles. L’identification des grandes voies de signalisation où fonctionne un DUB d’intérêt est nécessaire pour développer des tests spécifiques afin de déterminer comment ces variantes pilotent des NDD discrets.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Amersham Protran 0.45 NC 200 mm × ; 200 mm 25/PK	Cytiva	10600041
Sulfate d’ammonium	Fisher Scientific	AC205872500
Ampicilline	Fisher Scientific	BP1760 25
Anti-Ubiquitine (Souris monoclonale)	Biolegend	Cat# 646302, RRID :AB_1659269	(WB : 1:1000)
Anti-GST (Mouton polyclonal)	MRC-PPU Réactifs et services	Cat# S902A Troisième purge	(WB : 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
Fioles de culture à chicanes 2 L	Fisher Scientific	10-042-5N
Bradford Reagent	Millipore Sigma	B6916-500ML
Chloramphénicol	Gold Biotechnology	C-105-25
Complete, Inhibiteur de protéase	Comprimés Millipore Sigma
Econo-Column 1.5 × ; 5 cm	Bio-Rad	7371507
Eppendorf ThermoMixer F1.5  ;	Eppendorf	5384000020
Excel	Microsoft		https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Glycérol	Genesee Scientific	18-205
Illustrator	Adobe		https://www.adobe.com/products/illustrator.html
Image Studio	LI-COR Biosciences		https://www.licor.com/bio/image-studio/
Inkscape	Inkscape		https://inkscape.org/
Invitrogen 4-12 % NuPAGE 1mm 12 well gel	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX
IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside)	Genesee Scientific	20-109
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG Anticorps secondaire	LI-COR Biosciences	Cat# 926-32214	(WB : 1:10000)
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG Anticorps secondaire	LI-COR Biosciences	Cat# 926-32212	(WB : 1:10000)
Isotemp Digital Dry Bath	Fisher Scientific	88860022
K63 Di-Ubiquitin	South Bay Bio LLC	SBB-UP0072
LB Agar	Genesee Scientific	11-119
LB Broth	Genesee Scientific	11-118
Lysozyme	Gold Biotechnology	L-040-100
MaxQ 4000 Agitateur orbital de paillasse	Thermo Fisher Scientific	SHKE4000-7 MES-SDS
Tampon courant	Boston Bioproducts Inc	BP-177
Mini Tube	Rotator Fisher Scientific	88-861-051
NuPage LDS Tampon d’échantillon 4x	Thermo Fisher Scientific	NP0007
Odyssée  ; Fc Imager	LI-COR Biosciences	43214
PageRuler Plus Ladder	Thermo Fisher Scientific	26620
pGEX6P1 humain USP27X	MRC-PPU Réactifs et services	DU21193	https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
pGEX6P1 humain USP27X F313V	Addgene	225715	Koch et at 2024 (PMID : 38182161)
pGEX6P1 humain USP27X S404N	Addgene	225717	Koch et at 2024 (PMID : 38182161)
pGEX6P1 human USP27X Y381H	Addgene	225716	Koch et at 2024 (PMID : 38182161)
Pierce Glutathione Agarose	Thermo Fisher Scientific	16100
PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluorure)	Gold Biotechnology	P-470-10
Polysorbate 20 (Tween 20)	Fisher Scientific	AC233360010
Rosetta 2 Cellules Compétentes	Millipore Sigma	71402-M
SimplyBlue SafeStain	Thermo Fisher Scientific	LC6060
SmartSpec 3000	Bio-Rad	170-2501
SOC medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
sodium	Genesee Scientific	18-216
Sonifier 250	Branson	100-132-135
Centrifugeuse Sorvall RC 6 Plus	Thermo Fisher Scientific	46910
TCEP (chlorhydrate de tris-(carboxyéthyl)phosphine)	Gold Biotechnology	TCEP10
Formidable bouillon en poudre	Genesee Scientific	18-225
Tris Base	Genesee Scientific	18-146
Mini-cellule XCell SureLock et module de transfert XCell II  ;	Thermo Fisher Scientific	EI0002