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Article de méthode

Étude de l’exposition chronique des souris aux rayons ultraviolets B

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DOI :

10.3791/67368

⸱

19 août 2025

 ,  ,  , 

Dans cet article

Résumé

Le protocole décrit une étude des effets systémiques et locaux sur la peau de l’exposition aux ultraviolets B chez la souris.

Résumé

Le rayonnement ultraviolet B (UVB) (280-320 nm) est reconnu comme cancérigène depuis 1928, ce qui permet de minimiser l’exposition au soleil. Cependant, des études épidémiologiques suggèrent que l’exposition au soleil est corrélée à une augmentation de l’espérance de vie et à une réduction de l’incidence des maladies cardiovasculaires et de certains cancers tels que le cancer du côlon et de l’endomètre. L’exposition aux UVB influence également le métabolisme du foie, protège contre la lipotoxicité hépatocellulaire et affecte la santé métabolique. Ces effets sont en partie dus à la synthèse de la vitamine D, bien que certains soient indépendants de la vitamine D. De plus, la photothérapie par UVB a des propriétés immunomodulatrices et est utilisée pour traiter des affections cutanées telles que le vitiligo et le psoriasis tout en affectant le système immunitaire systémique. Étant donné les effets physiologiques étendus des UVB, il existe des lacunes dans la compréhension du mécanisme derrière la plupart de ces effets. Nous avons montré que l’exposition quotidienne aux UVB de faible niveau améliore le comportement de recherche de nourriture chez les souris mâles, mais pas chez les femelles, en raison de l’augmentation de la sécrétion de ghréline par les adipocytes cutanés. Chez les femelles, l’œstrogène inhibe l’activité p53 des adipocytes, bloquant l’élévation de la ghréline et démontrant une réponse dépendante du sexe aux rayons UVB. De plus, l’activation de p53 induite par les UVB dans les kératinocytes épidermiques active l’axe hypothalamus-hypophyse-gonadique, induisant le comportement sexuel et la pro-fertilité ovarienne. Cet article décrit un protocole pour étudier les effets locaux et systémiques du rayonnement UVB faible à l’aide d’un modèle murin C57BL/6J. Les éléments clés comprennent un calibrage précis des doses d’UVB, les conditions de logement et une épilation minutieuse pour assurer une exposition constante. Les souris sont soumises à un régime d’exposition aux UVB gradué sur plusieurs semaines, avec surveillance de la santé et des changements de comportement. Les méthodes de validation de l’efficacité du rayonnement par des mesures de pigmentation sont également détaillées. En mettant l’accent sur l’étalonnage des doses d’UVB, les soins rigoureux aux animaux et les contrôles méthodologiques, ce protocole facilitera l’étude des effets complets de l’exposition aux UVB, contribuant ainsi à une compréhension nuancée de ses avantages et risques thérapeutiques.

Introduction

Les fréquences du rayonnement solaire qui atteignent la surface de la Terre comprennent les rayons ultraviolets (UV), UVA (320-400 nm) et UVB (280-320 nm). Les UVB sont un inducteur de mutation. Les UV ont été reconnus comme cancérogènes en 19281, et à partir du milieu des années 1900, la réduction de l’exposition au soleil a été recommandée par mesure de précaution pour éviter le cancer de la peau2. Bien que les UVB soient clairement un déclencheur environnemental du cancer de la peau, les recherches menées au cours de la dernière décennie3 avec des études récentes de notre groupe 4,5,6 ont montré que les UVB ont de vastes effets sur les systèmes physiologiques. Une étude portant sur une cohorte de femmes suivies pendant 20 ans a révélé que l’espérance de vie était plus élevée de 2 ans chez les femmes qui n’évitaient pas le soleil par rapport aux femmes qui en évitaient7. Des études supplémentaires ont démontré que l’exposition au soleil était corrélée à une diminution des maladies cardiovasculaires et de la mortalité globale 8,9,10. Des corrélations inverses ont également été signalées entre la lumière du soleil et le cancer du côlon et le cancer de l’endomètre8. L’exposition aux UVB induit également le métabolisme hépatique11, protège contre la lipotoxicité hépatocellulaire et les maladies métaboliques, et a des effets positifs sur les endorphines et les comportements sexuels 3,6. Ces éléments de preuve indiquent les effets néfastes de l’évitement de l’exposition au soleil sur la santé humaine. Les effets bénéfiques de l’exposition au soleil ont été principalement attribués à l’induction de la production de vitamine D, cependant, au moins certains des avantages pour la santé de la lumière du soleil sont indépendants des niveaux de vitamine D 4,6,12

La peau est le plus grand organe du corps et la première ligne de défense contre les facteurs de stress environnementaux. Les couches épidermiques et dermiques de la peau sont séparées par une couche épidermique basale composée de kératinocytes et de mélanocytes10 indifférenciés et auto-renouvelables. Les kératinocytes à des stades croissants de différenciation terminale se trouvent dans la couche supérieure de l’épiderme. Le derme comprend des fibroblastes et des vaisseaux sanguins, et l’hypoderme est principalement constitué d’adipocytes. La peau est un organe dermato-endocrinien puisque plusieurs récepteurs d’hormones, tels que le récepteur des androgènes et le récepteur de l’hormone de libération de la corticotrophine, sont exprimés dans la peau, ce qui suggère que les hormones influencent les processus de la peau par des voies paracrines et autocrines 13,14,15. La peau est également productrice d’hormones. À quelques exceptions près, cependant, la production d’hormones dans la peau et la libération dans le sang n’ont pas été documentées, et les déclencheurs de l’expression ne sont pas connus (revue dans16).

Il a été démontré que les UVB ont un potentiel thérapeutique dans les maladies de la peau. La photothérapie, y compris le psoralène-UVA et la thérapie UVB à bande étroite, est la principale modalité de traitement du vitiligogénéralisé 17. La réponse à la photothérapie est survenue chez 74 % des patients à 6 mois et chez 75 % des patients à 12 mois après le début du traitement18. Le mécanisme d’action de la photothérapie dans le vitiligo n’est pas bien compris. Son action thérapeutique implique une combinaison d’effets sur la cinétique du cycle cellulaire, d’altérations de l’expression des cytokines, d’effets sur les mélanocytes et d’immunomodulation. De nombreuses études ont examiné les effets de la photothérapie sur l’immunité cutanée 19,20,21 ; Cependant, les effets systémiques sont mal compris, en particulier dans le contexte du vitiligo. Contrairement au psoriasis, où une étude a montré une diminution des cytokines pro-inflammatoires et une augmentation des lymphocytes T régulateurs après un traitement de photothérapie, dans le vitiligo, le nombre de lymphocytes T régulateurs a diminué avec la photothérapie UV21.

Bien que les UVB aient des effets sur le cerveau14,15, les glandes surrénales22, les ovaires 5,6, les testicules6, le foie11 et les ganglions lymphatiques23, les mécanismes par lesquels les UVB modulent les systèmes systémiques ne sont généralement pas connus. Ce protocole de recherche décrit un modèle murin pour l’étude des effets systémiques et locaux (peau) de l’exposition aux UVB qui facilitera l’étude des effets globaux de l’exposition aux UVB. Le modèle murin UVB présente un grand intérêt pour la physiologie de la peau, la dermatologie et le cancer de la peau, en particulier le mélanome. L’objectif global de cette méthode est de fournir un protocole simple mais robuste et efficace pour développer le modèle murin UVB pour des questions de recherche scientifique liées à la peau. Le protocole décrit comment surmonter les défis de l’érythème cutané associés à l’épilation et à l’exposition aux UVB dans des conditions physiologiques et est efficace pour étudier les effets locaux et systémiques des UVB sur la peau.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales décrites ont été réalisées conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Tel Aviv (permis IACUC : 01-20-043).

1. Habituation des souris à l’expérience

  1. Obtenez des souris C57BL/6J âgées de 7 à 8 semaines en les achetant auprès d’un vendeur commercial ou en les élevant à l’interne, selon le protocole IACUC de l’expérimentateur. Ce protocole teste les souris âgées de 15 semaines dans le fond C57BL/6J, mais le protocole doit être calibré sur d’autres souches de souris et pour des âges plus jeunes (< 7 semaines).
    REMARQUE : Le protocole d’utilisation des souris des différents groupes d’âge doit être approuvé par l’IACUC de l’institution où l’expérience aura lieu. Des détails sur l’état de santé des animaux sont fournis (tableau supplémentaire 1).
  2. Habituez les souris pendant au moins 7 jours avant le début de l’expérience. L’accoutumance est essentielle pour les souris après le transport et la logistique.

2. Héberger les souris

  1. Hébergez les animaux dans des cages domestiques avec litière standard accès à volonté à la nourriture standard et à l’eau dans un cycle standard sombre/lumière de 12h00 (heures de lumière : 07h00 - 19h00 et heures d’obscurité : 19h00-07h00) à une température standard de 22 ± 1°C et 32 % à 35 % d’humidité.
    REMARQUE : Nous avons testé ce protocole sur un accès alimentaire restreint, et il fonctionne également bien dans ces conditions expérimentales.
  2. Assurez-vous que le nombre de souris par cage est conforme à leur poids corporel, à la taille de leur portée et à l’hypothèse expérimentale.

3. Rasage et épilation

  1. Avant le rasage, placez les souris dans la chambre d’isoflurane reliée à un vaporisateur d’anesthésie réglé sur 5 % d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène.
    REMARQUE : Les expérimentatrices doivent être prudentes lors de l’utilisation de l’isoflurane, car l’exposition peut entraîner de graves risques pour la santé, et les femmes enceintes doivent l’éviter sous quelque forme que ce soit.
  2. Assurez-vous que les souris sont immobiles et qu’elles respirent constamment. Utilisez une pommade oculaire pour prévenir la sécheresse.
  3. Allumez le rasoir (dimensions de la lame LxlxH : 204 x 50 x 41 mm) et tenez-le parallèlement à la peau de la souris. Déplacez doucement le rasoir dans le sens de l’avant. Ne poussez pas la machine dans la peau de la souris ; Quelques cycles de rasage devraient suffire à raser les souris du côté dorsal. Rasez les souris dorsalement de manière à ce que 50 à 60 % de la région dorsale soit rasée (figure 1) avant le début de l’exposition aux rayonnements. Rasez à nouveau les souris chaque fois qu’il y a des plaques de repousse de la fourrure, qui est généralement d’environ 0,5 cm.
    REMARQUE : Utilisez soigneusement le rasoir afin de ne pas blesser ou déchirer la peau des animaux ; L’expérimentateur doit garder le rasoir aussi parallèle que possible avec la peau. La fréquence du rasage des poils dépend de la souche et du type de traitement expérimental administré aux souris.
  4. Anesthésie les souris d’une cage à la fois, puis rase-les. Après le rasage, appliquez une crème dépilatoire (suffisamment pour couvrir l’applicateur de coton) sur la zone rasée à l’aide de cotons. Attention à ne pas exposer la crème dépilatoire plus près des yeux des animaux. Le contraire peut entraîner de graves complications et des démangeaisons.
  5. Après 1 à 2 min, lavez doucement la zone avec des mouchoirs trempés dans une solution saline tampon phosphate stérile (PBS) pour éliminer les traces de la crème dépilatoire du corps de la souris afin d’éliminer les traces de poils coincés.
    REMARQUE : Prolonger le temps (> 5 min) avec la crème dépilatoire peut endommager la peau des souris et doit être évité. Veuillez vous assurer que la température du PBS est à température ambiante et pas trop froide.
  6. Séchez la zone rasée avec des tissus mous, puis placez les souris dans la cage de récupération propre et sèche avec litière de cage. Surveillez de près les souris jusqu’à ce qu’elles reprennent conscience.
    REMARQUE : La lampe à lumière infrarouge peut garantir que la température corporelle des souris ne chute pas considérablement après les étapes de lavage.
  7. Laissez les souris se reposer dans leur cage domestique avec de la nourriture et de l’eau à volonté et récupérez de la procédure de rasage pendant au moins 10 jours avant la première exposition aux UVB.
    REMARQUE : Si les souris sont exposées aux UVB avant 10 jours après le rasage, cela peut entraîner un érythème cutané.

4. Configuration de l’exposition aux UVB

  1. Portez un vêtement à manches longues, un pantalon, une blouse de laboratoire, des chaussures fermées, des gants doubles et un écran facial. Effectuez l’irradiation à l’intérieur d’une hotte biologique avec le couvercle en plexiglas de 10 mm vers le bas pour éviter l’exposition aux UVB de l’expérimentateur.
  2. Placez la lampe UVB sur la chambre en verre plexi transparent sans l’allumer, comme illustré à la Figure 2.
  3. Allumez la lampe UVB et laissez-la fonctionner jusqu’à ce que l’intensité soit constante. Placez le radiomètre UVX en l’allumant comme surveillé à l’aide d’un radiomètre UVX équipé d’une tête de mesure UVB. Assurez-vous d’allumer le radiomètre UVX à 20 mW/cm2 et de lire les paramètres sur le radiomètre. Laissez la lampe UVB se réchauffer et se stabiliser pendant au moins 2 min. Lorsque la lampe est prête à l’emploi, sortez le radiomètre UVX.
  4. Utilisez une cage propre autre que la cage domestique pour l’irradiation et placez-la dans le capot biologique sous la lampe UV. Transférez les souris dans la cage d’irradiation avant le traitement avec la lampe UV allumée ou éteinte pour les expositions UV ou simulées respectives. Traitez seulement 2 souris à la fois pour fournir suffisamment d’espace.
    REMARQUE : La chambre avait une surface au sol de 500 cm2 et une hauteur interne de 14 cm pour permettre aux souris de se déplacer librement sans grimper les unes sur les autres pendant l’irradiation. La raison de l’utilisation de la chambre d’exposition est d’éviter que les souris ne se chevauchent pendant l’exposition et de s’assurer que toutes les souris reçoivent la même quantité d’exposition aux UVB. L’introduction de plus de deux souris dans la chambre conduira à un scénario où les souris grimpent les unes sur les autres, ce qui créera une incohérence dans la dose d’UVB administrée à chaque souris.
  5. Calculez le temps nécessaire pour exposer les souris à l’intensité UVB souhaitée à l’aide du calculateur. Par exemple, si le radiomètre UVX affiche 2 mW/cm2 sur l’écran d’affichage et que l’exposition souhaitée est de 50 mJ/cm2 à donner aux souris, exposez les souris pendant 25 s dans la chambre d’irradiation UV pendant que la lampe UV est allumée.
    REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous de mettre l’équipement de protection approprié comme mentionné à l’étape 4.1. La durée d’exposition tout au long du traitement a varié entre 20 et 120 s. Cependant, la durée peut varier en fonction de l’intensité du rayonnement de la lampe UVB et doit donc être calculée pour chaque traitement. On ne s’attend pas à ce que les souris soient retirées de l’étude, car aucun signe de perte de poids, aucun signal de douleur, y compris de graves brûlures cutanées, des saignements, un érythème, une apathie ou une difficulté respiratoire ne sont normalement observés avec ce protocole.
  6. Exposez les souris mâles et femelles séparément et nettoyez la chambre avec un désinfectant entre chaque sexe pour éviter la contamination croisée des odeurs pour les études comportementales. En cas d’exposition de différents groupes de souris qui ont été traitées avec un traitement supplémentaire ou d’animaux génétiquement transgéniques ou témoins, nettoyez la chambre entre les expositions de chaque groupe pour éviter la contamination croisée de facteurs inconnus qui sont différents entre les deux groupes.

5. Exposition aux UVB

  1. Allumez la lampe UVB et configurez-la à partir de l’étape 4.1. à 4,5.
  2. Transférez les souris de la cage domestique à la chambre d’exposition pendant le temps souhaité. Exposez les souris aux UVB une fois par jour pendant les jours expérimentaux souhaités (ici, nous avons fait 5 jours/semaine) pendant 8 semaines avec un support XX-15 équipé d’ampoules UVB de 15 W, 302 nm.
    REMARQUE : La durée de l’exposition est subjective et dépend de la question scientifique. Les animaux ne doivent pas développer d’érythème cutané. En cas d’érythème, arrêtez immédiatement l’exposition et signalez-le au vétérinaire. Nous avons utilisé 5 jours par semaine d’exposition, à l’exclusion des week-ends. La fréquence de la dose d’UVB peut être réduite dans des conditions similaires à ce protocole, mais une exposition supplémentaire nécessitera un étalonnage de la part de l’expérimentateur.
  3. Exposez les souris à une dose d’UVB de 50 mJ/cm2, une dose sub-érythématique chez la souris C57BL/6J.
    REMARQUE : Une dose d’UVB de 50 mJ/cm2 est une dose sub-érythématique, et nous avons utilisé cette dose pendant 8 semaines chez les souris expérimentales. Dans d’autres expériences, nous avons utilisé une seule exposition UVB de 200 mJ/cm2 pour étudier les dommages à l’ADN4.
  4. Placez les souris rasées faussement irradiées (non exposées aux UVB) dans la chambre à rayonnement pendant une durée égale sans allumer la lampe UVB et utilisez-les comme contrôle de l’exposition aux UVB.
    REMARQUE : Comme les souris sont néophobes, les expériences impliquant des souris doivent toujours avoir le groupe témoin, qui subit le même pseudo-traitement que le groupe expérimental.

6. Analyse de l’exposition aux UVB

REMARQUE : Les souris ont été euthanasiées par asphyxie au CO2 conformément aux directives de l’AVMA.

  1. Pour valider l’efficacité du rayonnement, mesurer la pigmentation de l’oreille et de la queue (figure 2) à l’aide d’un spectrophotomètre dermique ou d’un instrument similaire ou par biopsies cutanées par immunocoloration suivie d’une coloration à Fontana Masson, comme décrit précédemment4.
  2. Validation à l’aide d’un spectrophotomètre dermique : Étalonnez le spectrophotomètre dermique pour définir la ligne de base à l’aide d’un papier blanc propre et ordinaire. Une fois l’étalonnage terminé, placez le capteur de mesure sur l’oreille ou la queue de la souris et notez les lectures d’intensité de mélanine. Les niveaux de mélanine sur les souris faussement rayonnées par UVB et par UVB sont illustrés à la figure 3.
  3. Validation par immunofluorescence : Fixer des biopsies de peau de souris (2 cm x 2 cm) dans du paraformaldéhyde à 4 % et les intégrer dans des blocs de paraffine. Coupes de tissu colorant de 10 μm d’épaisseur avec un anticorps anti-CPD (utilisé à une concentration de 1:100)24 pendant une nuit à 4 °C, suivi d’anticorps secondaires marqués par fluorescence (anticorps secondaire conjugué à Alexa-594 de chèvre à une concentration de 1:1000)24 pendant 1 h à température ambiante. Contre-colorez les tissus avec du DAPI et obtenez des images à l’aide de la microscopie à fluorescence.
  4. Validation par coloration Fontana Masson : Fixez les biopsies de peau de souris dans du paraformaldéhyde à 4 % et intégrez-les dans des blocs de paraffine. Colorer des tranches de tissu de 10 μm pour la mélanine en utilisant le protocole de colorationFontana Masson 4 avec une solution de nitrate d’argent et de chlorure d’or. Contre-coloration des biopsies tissulaires avec la solution Nuclear Fast Red et montez-les à l’aide d’un support tissulaire, suivi d’une capture d’image en fond clair au microscope.

7. Soins aux animaux

  1. Effectuer des expériences sur des animaux conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux.
  2. Pesez les souris chaque semaine pour évaluer leur état de santé de base. Retirez les animaux avec > diminution de poids de 15 % entre les mesures de l’expérience. Retirez les animaux qui présentent des signes de douleur, y compris de graves brûlures cutanées, des saignements, un érythème, de l’apathie ou des difficultés respiratoires dues à l’exposition aux UVB, et sacrifiez-les conformément aux directives du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux.

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Résultats

Cet article de méthode mentionne la procédure détaillée, étape par étape, de génération du modèle murin d’exposition aux UVB. La figure 1 montre clairement la zone rasée de la souris représentative C57BL/6J sur le côté dorsal avant l’exposition aux UVB, démontrant que 50 à 60 % de la zone dorsale était rasée. Le protocole de rasage ne montre aucun signe d’érythème cutané, ce qui est de la plus haute importance pour les études dermatologiques. La figure 2 montre ...

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Discussion

Les UVB sont reconnus depuis longtemps comme un facteur de risque environnemental pour les cancers de la peau ; cependant, des études récentes ont mis en lumière un spectre plus large d’effets UVB3. Il est nécessaire de mener des études qui permettent de mieux comprendre les effets systémiques des UVB. Les différentes doses utilisées en recherche fondamentale par rapport aux milieux cliniques compliquent notre compréhension des effets des UVB, ce qui souligne l’im...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

C.L. reconnaît le soutien financier du Conseil européen de la recherche dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (accord de subvention n° 726225), du I-CORE Gene Regulation in Complex Human Disease Center (n° 41/11) et de la Fondation israélienne pour la science (ISF ; subvention 129/13).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Désinfectant  ;Amity internationalSans objet
Chambre d’expositionFabriqué en interneSans objet
Crème dépilatoireVétérinaireSans objet
Rasoir à cheveuxHeiniger707-303 120 V États-Unis
L’isoflurane  ;Soins intensifs PiramalSans objet
Système isofluraneKent ScientificVetFlo-1210S
PBSSigma AldrichTMS-012
Chambre en plexiglasFabriqué en interneSans objet
Lampe UVBProduits ultra-violetsSérie XX - 15 watts
Radiomètre UVXProduits ultra-violets97-0015-02

Références

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Réimpressions et autorisations

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