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Article de méthode

Un modèle murin de transformation hémorragique induite par une hyperglycémie aiguë combinée à une ischémie focale transitoire

1.3K vues

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DOI :

10.3791/67371

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15 novembre 2024

 ,  ,  , 
1Hubei Key Laboratory of Cognitive and Affective Disorder, Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

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Avis d’erratum

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Résumé

Cette étude présente un protocole pour l’établissement d’un modèle animal hautement reproductible de transformation hémorragique (HT) utilisant l’occlusion/reperfusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO/R) chez des souris C57BL/6 atteintes d’hyperglycémie aiguë.

Résumé

La transformation hémorragique (HT) est une complication grave qui peut survenir à la suite d’un traitement thrombolytique après un AVC ischémique (IS), et elle pose des limites importantes à l’application clinique de l’activateur tissulaire recombinant du plasminogène (rt-PA). Malheureusement, il n’existe actuellement aucune intervention efficace pour l’HT dans la pratique clinique. Par conséquent, il est urgent de disposer de modèles animaux expérimentaux stables et fiables pour élucider la pathogenèse de l’HT et développer des stratégies d’intervention efficaces. Cette étude a présenté un protocole permettant d’établir un modèle murin de HT induite par une hyperglycémie aiguë combinée à une ischémie focale transitoire (tMCAO). Des souris mâles C57BL/6J ont reçu une injection de glucose à 30 % pour induire une hyperglycémie, puis ont été soumises à 60 minutes de tMCAO avec reperfusion. Le volume de l’infarctus, l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et le degré d’hémorragie intracrânienne ont été évalués 24 h après l’AOCM. Les résultats ont montré que l’injection de glucose entraînait une hyperglycémie transitoire (14,3-20,3 mmol/L), ce qui augmentait significativement le volume de l’infarctus et l’incidence de l’HT. La coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E) indiquait des lésions hémorragiques significatives dans la zone d’infarctus chez les souris hyperglycémiques. De plus, les souris hyperglycémiques présentaient une perturbation aggravée de la BHE, comme le montre une fuite plus sévère de bleu d’Evans (EB) et de FITC-Dextran. En conclusion, l’hyperglycémie aiguë a entraîné de manière fiable et constante une HT macroscopique dans un modèle murin de tMCAO. Ce modèle reproductible offre un outil précieux pour étudier les mécanismes pathologiques de l’HT et développer des interventions thérapeutiques correspondantes.

Introduction

L’infarctus cérébral est la principale cause d’invalidité et la deuxième cause de décès chez les adultes dans le monde1. La phase aiguë joue un rôle crucial dans la progression de l’infarctus cérébral, servant de point pivot pour le traitement de la maladie. Le rétablissement précoce et opportun du flux sanguin dans la région de la pénombre est essentiel pour prévenir la mort des cellules cérébrales, la thrombolyse et le traitement interventionnel représentant les piliers du traitement de l’infarctus cérébral aigu (ACI). Cependant, la transformation hémorragique (HT) pose une complication importante après la thrombolyse et le traitement interventionnel, survenant chez 15 à 30 % des patients ayant subi un AVC ischémique, limitant ainsi leur application dans une certaine mesure 2,3. La survenue d’une HT augmente considérablement le risque de mortalité et d’invalidité, affectant le pronostic de l’ACI. Par conséquent, il est d’une grande importance clinique d’étudier les mécanismes pathologiques de l’HT et d’identifier des cibles thérapeutiques efficaces.

Actuellement, l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne induite par l’embolie filante (MCAO) est fréquemment utilisée comme modèle de HT chez les rongeurs4. Une obstruction prolongée peut entraîner un infarctus cérébral massif impliquant le cortex et le striatum, conduisant potentiellement à une HT secondaire. Thread MCAO ne nécessite pas de craniotomie, est hautement reproductible et produit des lésions cérébrales focales et une HT similaires à un accident vasculaire cérébral humain. Cependant, ce modèle mécanique présente certains inconvénients distincts, notamment des taux de mortalité précoce élevés et de faibles taux de survie à long terme5. Un autre modèle HT fréquemment utilisé est le modèle de thrombolyse, dans lequel la formation de caillots sanguins est induite d’abord dans le vaisseau cible, suivie de l’utilisation de médicaments thrombolytiques (par exemple, rt-PA, warfarine) pour dissoudre le caillot, imitant le processus clinique de l’HT dans l’AVC ischémique 6,7. Bien qu’ils reproduisent dans une large mesure le processus pathologique de la thérapie thrombolytique clinique, les modèles animaux HT induits par le rt-PA ou la warfarine sont complexes à mettre en œuvre et associés à une mortalité animale élevée ainsi qu’à une incidence et une localisation variables des saignements. Afin de faire progresser la recherche translationnelle fondamentale et clinique sur l’HT après un infarctus cérébral, il est essentiel d’établir un modèle animal reproductible de l’HT, facile à utiliser et offrant une grande stabilité.

L’hyperglycémie est un facteur important de l’HT après une ischémie/reperfusion cérébrale (I/R)8. Plusieurs études rétrospectives ont analysé les données cliniques de patients subissant une thrombectomie mécanique, révélant qu’une glycémie élevée à l’admission est liée à une incidence plus élevée de HT3 spontanée. Chez les patients diabétiques victimes d’un AVC, l’hyperglycémie augmente considérablement le risque d’HT et entraîne des déficits neurologiques plus graves 9,10. Les chercheurs ont développé des modèles HT en induisant l’I/R cérébrale dans des modèles animaux diabétiques par le biais de MCAO. Cependant, le modèle du diabète MCAO a une longue durée expérimentale, une procédure complexe et des coûts élevés11,12. Un modèle fiable de HT peut être établi en induisant une hyperglycémie aiguë par injection intrapéritonéale de glucose et en l’intégrant à un modèle cérébral I/R généré par la technique de suture. Cette méthode est facile à mettre en œuvre avec une position de saignement constante et imite efficacement les caractéristiques cliniques de l’hyperglycémie post-AVC. Cependant, il existe des différences significatives dans des conditions cruciales telles que le temps ischémique et la concentration de glucose ; de plus, la stabilité du modèle et l’incidence de l’HT sont incohérentes dans différentes littératures.

Notre groupe de recherche a largement utilisé la méthode de l’hyperglycémie aiguë-MCAO pour établir un modèle HT. De plus, nous avons mené une série complète d’expériences pour explorer la relation entre le temps ischémique, la concentration de glucose dans le sang, le taux d’incidence de l’HT et la mortalité animale. Ces expériences ont finalement permis d’identifier les conditions optimales pour la création d’un modèle HT post-infarctus cérébral. Cette étude présente un protocole détaillé pour l’établissement d’un modèle HT induit par l’hyperglycémie aiguë en utilisant l’injection intrapéritonéale de glucose à 30 % associée à un MCAO embolique.

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Protocole

Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Jianghan (JHDXLL2024-080) et mené conformément aux directives éthiques sur les animaux de laboratoire publiées par le Centre de contrôle des maladies de Chine. Des souris C57BL/6J mâles adultes pesant de 21 à 26 g ont été utilisées dans cette étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Groupement d’animaux et induction d’hyperglycémie aiguë

  1. Hébergez les souris dans le centre animalier de laboratoire de l’Université de Jianghan dans un environnement contrôlé à cycle lumière/obscurité de 12 heures (20-22 °C, 50 à 55 % d’humidité) avec de la nourriture et de l’eau à volonté.
  2. Divisez au hasard les souris en quatre groupes : Simulacre + solution saline (n = 12), Simulateur + glucose (n = 12), MCAO + solution saline (n = 12) et MCAO + glucose (n = 20).

2. Préparation préopératoire

REMARQUE : Toutes les souris expérimentales ont jeûné pendant 12 h avant la chirurgie.

  1. Administrer une analgésie systémique (méloxicam, 5 mg/kg par voie sous-cutanée) et une anesthésie locale au site d’incision (bupivacaïne, 2 mg/kg par voie sous-cutanée) en périopératoire.
  2. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux, les cotons-tiges et les sutures chirurgicales par autoclave à 121 °C et 15 psi pendant 30 min.
  3. Essuyez la plate-forme chirurgicale et la zone de travail environnante avec de l’éthanol à 75 % et allumez l’interrupteur de chauffage avec la température réglée sur 37 °C.
  4. Anesthésie la souris avec un mélange gazeux d’isoflurane à 20 % d’oxygène dans la chambre d’induction de l’anesthésie. Ensuite, évaluez le réflexe de pincement des orteils pour tester la profondeur de l’anesthésie.
  5. Déplacez la souris sur la plate-forme chirurgicale en position couchée et insérez rapidement le nez de la souris dans le cône nasal. Ouvrez le flux de gaz vers le cône nasal, en fermant le flux vers la chambre d’induction de l’anesthésie. Ajustez la proportion d’isoflurane à 2 % et réglez le débit du mélange gazeux à 0,4 mL/min pour le maintien de l’anesthésie.
  6. Appliquez du gel pour les yeux sur les yeux de la souris pour maintenir l’humidité pendant la chirurgie.
  7. Rasez les poils de la région du cou à l’aide de la tondeuse à animaux. Nettoyez et désinfectez la peau en alternant l’application avec de l’iode et de l’éthanol à 70 % à l’aide d’un bâtonnet de coton désinfectant.
  8. Couvrez une gaze stérile sur le cou et découpez une ouverture pour exposer la région opératoire.

3. Mesure de base du débit sanguin cérébral

  1. Rasez les cheveux de la région du cuir chevelu à l’aide de la tondeuse pour animaux. Nettoyez et désinfectez le cuir chevelu en alternant l’application avec de l’iode et de l’éthanol à 70 % à l’aide d’un bâtonnet de coton désinfectant.
  2. Faites une incision médiane de 1,0 cm de long dans la peau sur la région frontale pour exposer la fontanelle crânienne. Gardez le crâne humide avec une solution saline normale.
  3. Préparez l’instrument de flowmétrie laser Doppler (LDF) et tenez la pointe de la sonde LDF perpendiculairement à la surface du crâne pariétal gauche (1 mm en arrière et 5 mm latéralement au bregma) ; une fois que le FLUX est stable et enregistrez la valeur de référence.
    REMARQUE : L’unité de mesure de FLUX est les unités de perfusion (PU), avec une plage de mesure de 0 à 1000 PU. La base idéale CBF sur une flowmétrie laser Doppler est de >600 PU. Une période continue de 5 secondes avec une plage de fluctuation inférieure à 10 % est considérée comme une lecture FLUX valide.
  4. Suturez le muscle et la peau séparément à l’aide d’une suture résorbable 5.0 PGA. Appliquez du gel de diclofénac sodique et de la pommade à la mupirocine sur la plaie.

4. Procédure chirurgicale MCAO

REMARQUE : La MCAO est réalisée à l’aide d’une méthode d’occlusion de fil modifiée, telle que décrite précédemment par Chiang et al.13.

  1. Retournez doucement la souris en position couchée et administrez par voie intrapéritonéale 30 % de glucose (7,2 ml/kg) ou une solution saline normale aux souris 15 minutes avant l’intervention chirurgicale.
    REMARQUE : Les souris des groupes Sham + glucose et MCAO + glucose ont reçu des injections intrapéritonéales de glucose. Les souris des groupes Sham + solution saline et MCAO + solution saline ont reçu des injections intrapéritonéales de solution saline normale.
  2. Rasez les poils de la région du cou à l’aide de la tondeuse pour animaux. Nettoyez et désinfectez la peau en alternant l’application avec de l’iode et de l’éthanol à 70 % à l’aide d’un bâtonnet de coton désinfectant. Couvrez une gaze stérile sur le cou et découpez une ouverture pour exposer la région opératoire.
    REMARQUE : Assurez-vous que l’incision est maintenue droite pour obtenir une visualisation optimale de l’artère carotide.
  3. Faites une incision médiane de 1,5 cm sur la face ventrale du cou à l’aide d’un scalpel. Séparez le tissu sous-cutané et le fascia superficiel à l’aide d’une pince à épiler chirurgicale.
    REMARQUE : Assurez-vous que l’incision est maintenue droite pour obtenir une visualisation optimale de l’artère carotide.
  4. Sous le fascia superficiel, localisez la glande sous-mandibulaire et un triangle inversé formé de trois muscles : le sterno-hyroïde, positionné sur la ligne médiane au-dessus de la trachée ; le ventre postérieur du muscle digastral, reconnaissable à sa partie tendineuse blanche brillante ; et enfin, le muscle sterno-mastoïdien.
  5. Effectuez une dissection contondante à l’intérieur du triangle inversé pour identifier et séparer l’artère carotide commune (ACC) gauche.
  6. Disséquez le nerf vague adjacent à l’ACC et le tissu muqueux entourant les vaisseaux sanguins à l’aide d’une pince ophtalmique. Faites une sonnerie sur l’ACC à l’aide d’une suture absorbable à l’acide polyglycolique (PGA) 5,0, mais gardez la suture non tendue.
  7. Séparée vers le haut le long de l’ACC, une bifurcation en « Y » peut être observée pour diviser l’ACC en artère carotide externe (ECA) et artère carotide interne (ICA).
  8. Séparez la bifurcation pour exposer pleinement l’ECA et l’ICA. Enroulez et attachez fermement une suture résorbable 5.0 PGA autour de l’ECA distalement à partir de la bifurcation.
    REMARQUE : Assurez-vous d’une distance suffisante entre le site de ligature permanente et la bifurcation vasculaire pour éviter que le fil ne se déloge pendant la rotation de l’ECA.
  9. Clamper temporairement l’ACC et l’ICA à l’aide de deux pinces artérielles micro-serrafines légères de 8 mm x 2 mm pour bloquer le flux sanguin de l’ACC à l’ICA.
  10. Étirez l’attache de suture sur le segment distal ECA et CCA pour redresser le segment ECA.
  11. Utilisez des microciseaux pour faire une petite incision entre les deux attaches de suture sur l’ECA.
  12. Insérez une suture monofilament recouverte de silicium (30 mm de long, 3 à 4 mm de silicium enrobé) dans l’ECA. Enroulez et attachez légèrement une deuxième suture résorbable 5.0 PGA sur l’ECA près de la bifurcation pour empêcher la suture monofilament de reculer.
  13. Coupez complètement l’ECA distal à la ligature permanente et retirez la pince artérielle de l’ICA.
  14. Retirez la suture jusqu’à la bifurcation de l’ACC, puis rétractez et tournez doucement le moignon de l’ECA. Ajustez le sens d’insertion de la suture et insérez-la lentement, à environ 9,0 à 10,0 mm de la bifurcation de l’ACC dans l’ICA, pour obstruer l’ACM.
  15. Serrez la deuxième suture résorbable PGA autour de l’ECA et retirez la pince artérielle de l’ACC.
  16. Suturez le muscle et la peau séparément à l’aide d’une suture résorbable 5.0 PGA. Appliquez du gel de diclofénac sodique et de la pommade à la mupirocine sur la plaie.
  17. Retournez doucement la souris en position couchée et répétez l’étape 3.4. pour enregistrer le flux sanguin suite à l’occlusion du MCA.
    REMARQUE : Les souris présentant une réduction du débit sanguin inférieure à 40 % de la valeur de base après MCAO ont été exclues de l’étude14.
  18. Allumez l’interrupteur de chauffage de la cage de récupération avec la température réglée sur 37°C. Placez la souris dans la cage de récupération pendant la période post-occlusion (60 min).

5. Élimination et reperfusion des monofilaments

  1. Anesthésie à nouveau la souris comme décrit précédemment, juste avant la fin de la période d’occlusion.
  2. Clampez le CCA à l’aide d’un collier d’artère à microclip.
  3. Rétractez partiellement le monofilament de l’ICA jusqu’à ce que l’embout recouvert de silicone devienne visible à travers l’ICA.
  4. Placez une autre pince artérielle à microclip sur l’ICA au-dessus de l’extrémité recouverte de silicone.
  5. Retirez complètement le monofilament et ligaturez fermement le moignon ECA.
  6. Retirez le collier d’artère à microclip de l’ICA et du CCA, respectivement.
  7. Suturez le muscle et la peau couche par couche à l’aide d’une suture résorbable 5.0 PGA.
  8. Placez la souris dans la chambre de récupération et surveillez toutes les souris jusqu’à ce qu’elles soient complètement réveillées. Administrer du méloxicam (5 mg/kg, par voie sous-cutanée) pour soulager la douleur toutes les 12 h pendant un maximum de 24 h.

6. Mesure de la glycémie

REMARQUE : Les taux de glucose dans le sang ont été mesurés aux points temporels suivants : (1) juste avant la chirurgie MCAO (ligne de base), (2) immédiatement après l’insertion du monofilament (15 min après l’injection de glucose), (3) immédiatement après le retrait du monofilament immédiatement après l’insertion du monofilament (75 min après l’injection de glucose).

  1. Essuyez la queue de la souris avec une boule de coton alcoolisée pour rendre la veine de la queue complètement hyperémique.
  2. Coupez le bout de la queue de 1 à 2 mm à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
  3. Pressez doucement le long de la racine de la queue jusqu’au bout de la queue, facilitant ainsi l’écoulement du sang hors de l’incision.
  4. Positionnez le réservoir d’absorption d’échantillon du papier réactif sur le bord de la gouttelette de sang.
    REMARQUE : Le sang sera aspiré dans le papier réactif en raison de l’effet de siphonnage.
  5. Lisez la lecture du lecteur de glycémie et notez le résultat.
    REMARQUE : Exclure les souris dont la glycémie n’a pas dépassé 10 mmol/L après 15 minutes d’injection de glucose.
  6. Retirez tout excès de sang à l’aide d’une boule de coton et appliquez une pression pour arrêter le saignement.

7. Coloration au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC)

  1. Euthanasier la souris par injection intrapéritonéale d’une surdose de pentobarbital (300 mg/kg).
  2. Une fois que la souris cesse de respirer, immobilisez-la rapidement en position couchée.
  3. Ouvrez le thorax à l’aide de ciseaux et découpez le diaphragme pour exposer le cœur.
  4. Insérez une aiguille d’injection de 23 G dans le ventricule gauche de la souris et incisez l’appendice auriculaire avec des ciseaux.
  5. Perfuser 15 mL de solution saline normale jusqu’à ce que le liquide qui s’écoule de l’appendice auriculaire apparaisse clair et transparent.
  6. Décapitez la souris et ouvrez le cuir chevelu pour exposer complètement le crâne à l’aide de ciseaux. Insérez la pointe des ciseaux à 2 mm légèrement en avant de la suture coronale du crâne pour l’ouvrir.
  7. À l’aide d’une pince à épiler, le tissu cérébral de la souris est intact.
  8. Placez le tissu cérébral dans une matrice cérébrale de rongeur et coupez-le en tranches coronales de 2 mm.
  9. Transférez les tranches dans une plaque à 24 puits et incubez-les avec une solution TTC à 2 % à 37 °C pendant 15 min.
  10. Démarrez le logiciel de numérisation et réglez les paramètres sur une résolution de 1200 dpi et un format JPG pour l’analyse d’image.
  11. Découpez les sections de tissu de la plaque à 24 puits à l’aide d’une pince incurvée et disposez les sections sur la plaque de balayage en verre.
  12. Numérisez les coupes de tissus, puis exportez les images pour l’analyse des mesures.
  13. Mesurez la zone de l’infarctus en corrigeant l’enflure des tissus. Soustraire la zone non infarctus du côté ipsilatéral de l’aire du côté controlatéral à l’aide du logiciel ImageJ15. Évaluez la taille de l’infarctus en pourcentage de l’hémisphère controlatéral. Pour plus de détails sur l’analyse de la zone d’infarctus, voir Friedländer et al.16.

8. Observationde G ross

  1. Répétez les étapes 7.1 à 7.8.
  2. Découpez les sections de tissu de la matrice cérébrale à l’aide d’une pince incurvée et disposez les sections sur la plaque de balayage en verre.
  3. Scannez les coupes coronaires du cerveau comme décrit aux étapes 7.10 et 7.12.

9. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)

  1. Répétez les étapes 7.1 à 7.4. Perfuser lentement 15 mL de solution saline normale, suivie d’une perfusion d’environ 15 mL de paraformaldéhyde (PFA).
  2. Répétez les étapes 7.6 et 7.7. Fixez le tissu cérébral avec 4 % de PFA pendant 24 h à température ambiante.
  3. Placez le tissu cérébral fixe dans le déshydrateur de tissus automatisé pour la déshydratation, la vitrification et l’immersion dans la cire.
  4. Incorporez le tissu dans de la cire de paraffine et coupez le tissu cérébral en tranches coronales de 5 m d’épaisseur par microtome.
  5. Déparaffinez la tranche en l’immergeant trois fois dans du xylène, chaque immersion durant 8 min. Ensuite, immergez progressivement la tranche dans des solutions d’éthanol de concentrations décroissantes (100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 %), suivies d’eau distillée, chaque étape durant 5 min.
  6. Teintez la tranche avec une solution d’hématoxyline pendant 3 min. Ensuite, différenciez-le en le plongeant dans de l’alcool à 5 % d’acide chlorhydrique pendant 5 s.
  7. Incuber la tranche avec une solution d’éosine pendant 1 min, puis la déshydrater et l’hyaliniser avec une solution d’éthanol à gradient (90 %, 95 %, 100 %) et du xylène.
  8. Montez la section avec des résines neutres.
  9. Capturez les images de tranches de cerveau colorées à l’H&E sous un champ clair à l’aide de la microscopie à fluorescence.

10. Détermination du lekage Evans Blue (EB)

REMARQUE : Pour plus de détails sur cette procédure, veuillez vous référer à Wang et al.17.

  1. Injecter une solution d’Evans Blue (EB) à 2 % (p/v) (2 mL/kg) par la veine de la queue 23 h après l’obtention d’un MCAO.
  2. Répétez les étapes 7.1 à 7.7 une heure après l’injection d’EB et prenez une photo de l’ensemble du cerveau.
  3. Placez le cerveau dans une matrice de cerveau de rongeur et coupez-le coronalement en tranches de 2 mm. Scannez les coupes coronaires cérébrales comme décrit aux étapes 7.10 à 7.12 pour observer les fuites d’EB.
  4. Divisez les tranches en parties droite et gauche, et mettez chacune dans un tube à centrifuger.
  5. Homogénéiser chaque tranche de tissu cérébral dans 50 % d’acide trichloracétique, avec un rapport de 100 mg de tissu cérébral pour 0,4 ml d’acide trichloracétique.
  6. Après avoir été incubé à 4 °C pendant la nuit, centrifugez l’homogénat pendant 30 min à 10 000 x g (à 4 °C).
  7. Transférez le liquide surnageant dans un autre tube à centrifuger et diluez-le quatre fois avec de l’éthanol.
  8. Mesurer l’absorbance du liquide surnageant à 620 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
  9. Convertissez les valeurs d’absorbance en concentration d’EB à l’aide d’une courbe standard d’EB dans l’éthanol (p. ex., à 31,25, 62,5, 125 et 250 μg/mL).
    REMARQUE : Le résultat est présenté sous la forme d’un microgramme d’EB par gramme de tissu cérébral.

11. Détermination de la fuite FITC-Dextran

  1. Injecter FITC-Dextran (10 KDa, 6 mg/mL, dilué dans 0,01 M de PBS ; 4 mL/kg) dans la veine de la queue 24 h après l’administration du MCAO, en lui permettant de circuler dans le sang pendant 10 min.
  2. Répétez les étapes 7.1 à 7.7 pour effectuer la perfusion et retirer le tissu cérébral intact.
  3. Fixer le tissu cérébral dans 4 % de PFA pendant 24 h à température ambiante dans l’obscurité.
  4. Transférez le tissu cérébral fixe dans la solution de saccharose avec des concentrations de gradient de 10 %, 20 % et 30 % (dilué dans 0,01 M de PBS) pour la déshydratation.
  5. Enfoncez le tissu cérébral à l’aide d’un composé à température de coupe optimale (OCT) et coupez-le en sections de tissu cérébral de 30 μm d’épaisseur. Transférez les coupes sur une lame de microscope à l’aide d’une boucle d’inoculation et assurez-vous qu’elles adhèrent à la surface de la lame.
  6. Montez les coupes de tissu cérébral à l’aide d’un support de montage contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
  7. Démarrez la microscopie confocale laser et son logiciel de contrôle.
  8. Fixez la lame du microscope sur la platine de l’objet et localisez la zone de l’infarctus sous l’oculaire 200x.
  9. Réglez la résolution sur 1024 x 1024 et ajustez la valeur de gain et le temps d’exposition pour obtenir l’image la plus claire possible.
  10. Acquérir les images de la région colorée FITC-Dextran de l’infarctus cérébral sous une longueur d’onde d’excitation de 488 nm.

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Résultats

La procédure expérimentale de cette étude est illustrée à la figure 1. Brièvement, les souris ont subi un MCAO induit par l’occlusion du fil pendant 60 min, suivi d’une reperfusion. Le glucose (30 % dans une solution saline normale, 7,2 ml/kg de poids corporel) a été administré par voie intrapéritonéale 15 minutes avant l’AOCM. La glycémie a été mesurée au départ (avant l’injection de glucose), immédiatement après le MCAO et au moment de la reperfusion. Après 24 heures de re...

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Discussion

Le protocole actuel est conçu pour créer un modèle animal fiable de transformation hémorragique après un AVC ischémique, qui peut reproduire les effets néfastes de la revascularisation des vaisseaux dans des conditions hyperglycémiques. Parmi les différents facteurs de risque d’AVC ischémique, la glycémie dans les 24 heures suivant le début de l’AVC est positivement corrélée à l’exacerbation des lésions cérébrales et à l’augmentation de la mortalité 3,18

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts conflictuels à divulguer.

Remerciements

La figure 1 a été créée à l’aide du logiciel BioRender (https://www.biorender.com/). Cette étude a été soutenue par des subventions du projet d’orientation de la Fondation des sciences naturelles de la province du Hubei (n° 2022CFC057).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC)Sigma-Aldrich108380Le colorant pour la coloration TTC
Plaque de culture à 24 puitsCorning IncorporatedCLS3527Le récipient pour la coloration TTC
Injection de glucose à 30 %Kelun PharmaceuticalH42021188Induction de l’hyperglycémie aiguë
à 4 % de paraformaldéhydeWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd. 		G1101Fixation
tissulaire 5.0 Suture absorbable à l’acide polyglycoliqueJinhuan Medical Co., LtdKCR531Équipement pour la chirurgie
Plaque de culture à 96 puitsCorning IncorporatedCLS3596EB Mesure de la teneur
Appareil d’anesthésieMidmark CorporationVMRAnesthésie pour animal
Antifade Milieu de montage avec DAPIBeyotime BiotechP0131Support pour coupes de tissus
Automation-tissue-dehydrating  ; Machine
Leica BiosystemsTP1020Tissu déshydraté
Microscopie confocaleLeica BiosystemsSTELLARIS 5Acquisition d’images
Diclofénac gel de sodiumMaYinglong PharmaceutiqueH10950214Analgésie pour animal
de coloration à l’éosineServicebio TechnologyG1001Le colorant pour H& Coloration E
Evans BlueAladdinE104208EB
Coloration Gel oculaireGuangzhou PharmaceuticalH44023098Matériau pour la chirurgie
Fitc-dextranSigma-Aldrich60842-46-8Évaluation de la perméabilité de la BHE
Microscope à fluorescenceOlympusBX51Acquisition d’images
Microtome congeléLeica BiosystemsCM1900Utilisation pour les sections congelées
GlucomètreYuWell580Mesure
de la glycémie Coloration à l’hématoxyline SolutionServicebioG1004Le colorant pour H& E coloration
IodeLircon20020059Matériau pour la chirurgie
IsofluraneRwd Life ScienceR510-22-10Anesthésie pour animaux
Laser Doppler Débitmètre sanguinMoor InstrumentsmoorVMS Surveillance duflux sanguin
MCAO SuturesRwd Life Science907-00023-01Matériel pour la chirurgie
MeloxicamBoehringer-IngelheimJ20160020Analgésie pour l’animal
Kit d’instruments microchirurgicauxRwd Life ScienceSP0003-MÉquipement pour la chirurgie
MicrotomeThermo Fisher ScientificHM325Production de coupes de
tissus Lame de microtomeLeica Biosystems819Production de coupes de
tissus Pommade à la mupirocineGlaxoSmithKlineH10930064Anti-infectieux pour animal
Neutre baumeAbsin Bioscienceabs9177Sceau pour H& E coloration Centre d’enrobage
paraffineThermo Fisher ScientificEC 350Produire des blocs de paraffine
Pentobarbital sodiqueSigma-AldrichP3761Euthanasie pour animaux
Solution saline tamponnée au phosphateBeyotime BiotechC0221ARinçage pour coupe de tissus
ScannerEPSONV330Rasoir
à balayage tissulaireShenzhen Codos Electrical Appliances Co., Ltd.CP-9200Équipement pour la chirurgie
SpectrophotomètreThermo Fisher Scientific1510-02362Mesure de la teneur en EB Solution
saccharoseShanghai Macklin Biochemical57-50-1Déshydratation des tissus
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583Milieu d’enrobage tissulaire
Acide trichloracétiqueSigma-AldrichT6399EB Mesure du contenu
Solution de de

Références

  1. Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC focus seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
  2. Goncalves, A., et al. Thrombolytic tPA-induced hemorrhagic transformation of ischemic stroke is mediated by PKCβ phosphorylation of occludin. Blood. 140 (4), 388-400 (2022).
  3. Adebayo, O. D., Culpan, G. Diagnostic accuracy of computed tomography perfusion in the prediction of hemorrhagic transformation and patient outcome in acute ischaemic stroke: A systematic review and meta-analysis. Eur Stroke J. 5 (1), 4-16 (2020).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Knight, R. A., et al. Prediction of impending hemorrhagic transformation in ischemic stroke using magnetic resonance imaging in rats. Stroke. 29 (1), 144-151 (1998).
  6. Orset, C., et al. Combination treatment with U0126 and rt-PA prevents adverse effects of the delayed rt-PA treatment after acute ischemic stroke. Sci Rep. 11 (1), 11993(2021).
  7. Kwon, I., et al. Hemorrhagic transformation after large cerebral infarction in rats pretreated with dabigatran or warfarin. Stroke. 48 (10), 2865-2871 (2017).
  8. Mi, D., et al. Correlation of hyperglycemia with mortality after acute ischemic stroke. Ther Adv Neurol Disord. 11, 1756285617731686(2018).
  9. Seners, P., Turc, G., Oppenheim, C., Baron, J. C. Incidence, causes and predictors of neurological deterioration occurring within 24 following acute ischaemic stroke: A systematic review with pathophysiological implications. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 86 (1), 87-94 (2015).
  10. Reshi, R., et al. Hyperglycemia in acute ischemic stroke: Is it time to re-evaluate our understanding. Med Hypotheses. 107, 78-80 (2017).
  11. Graham, M. L., Schuurman, H. J. Validity of animal models of type 1 diabetes, and strategies to enhance their utility in translational research. Eur J Pharmacol. 759, 221-230 (2015).
  12. Rehni, A. K., Liu, A., Perez-Pinzon, M. A., Dave, K. R. Diabetic aggravation of stroke and animal models. Exp Neurol. 292, 63-79 (2017).
  13. Chiang, T., Messing, R. O., Chou, W. H. Mouse model of middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp. 48, e2761(2011).
  14. Ma, F., Sun, P., Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. Endothelium-targeted deletion of the miR-15a/16-1 cluster ameliorates blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke. Sci Signal. 13 (621), eaay5686(2020).
  15. Wanson, R. A., et al. A semiautomated method for measuring brain infarct volume. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (2), 290-293 (1990).
  16. Friedländer, F., et al. Reliability of infarct volumetry: Its relevance and the improvement by a software-assisted approach. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (8), 3015-3026 (2017).
  17. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588(2014).
  18. Wang, C., et al. Association between red blood cell distribution width and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke patients. Cerebrovasc Dis. 48 (3-6), 193-199 (2019).
  19. Zhu, B., et al. Stress hyperglycemia and outcome of non-diabetic patients after acute ischemic stroke. Front Neurol. 10, 1003(2019).
  20. Won, S. J., Tang, X. N., Suh, S. W., Yenari, M. A., Swanson, R. A. Hyperglycemia promotes tissue plasminogen activator-induced hemorrhage by increasing superoxide production. Ann Neurol. 70 (4), 583-590 (2011).
  21. Zhang, F. H., et al. Rosiglitazone attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal ischemia in rats. Neuroscience. 250, 651-657 (2013).
  22. Soejima, Y., et al. Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient MCAO in rats. Med Gas Res. 2 (1), 9(2012).
  23. Chen, C., Ostrowski, R. P., Zhou, C., Tang, J., Zhang, J. H. Suppression of hypoxia-inducible factor-1alpha and its downstream genes reduces acute hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation in a rat model of cerebral ischemia. J Neurosci Res. 88 (9), 2046-2055 (2010).
  24. Lin, Y., et al. Docosahexaenoic acid attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal cerebral ischemia in rats. Neuroscience. 301, 471-479 (2015).
  25. MacDougal, E. L., Herman, W. H., Wing, J. J., Morgenstern, L. B., Lisabeth, L. D. Diabetes and ischaemic stroke outcome. Diabet Med. 35 (9), 1249-1257 (2018).
  26. Yang, C., Hawkins, K. E., Doré, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. Am J Physiol Cell Physiol. 316 (2), C135-C153 (2019).
  27. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Curr Protoc Neurosci. 79, 9.58.1-9.58.15 (2017).
  28. Ahishali, B., Kaya, M. Evaluation of blood-brain barrier integrity using vascular permeability markers: Evans Blue, Sodium Fluorescein, Albumin-Alexa Fluor conjugates, and Horseradish Peroxidase. Methods Mol Biol. 2367, 87-103 (2021).
  29. Kovács, K. B., Bencs, V., Hudák, L., Oláh, L., Csiba, L. Hemorrhagic transformation of ischemic strokes. Int J Mol Sci. 24 (18), 14067(2023).

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Erratum


Formal Correction: Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia
Posted by JoVE Editors on 1/06/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/67371

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