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Inactivation efficace d’un gène dans le foie par injection intrasplénique d’un petit ARN en épingle à cheveux délivré par le virus adéno-associé de sérotype 8 (AAV8)

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DOI :

10.3791/67376

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1 novembre 2024

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Translational Medical Sciences, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit comment l’injection intrasplénique de petits ARN en épingle à cheveux délivrés par AAV8 atteint la même efficacité d’inactivation génique dans le foie que l’injection dans la veine porte, représentant une procédure plus simple avec une mortalité et des complications périopératoires et postopératoires beaucoup plus faibles.

Résumé

Le foie est un organe majeur qui remplit des fonctions métaboliques essentielles. La mise au point d’une méthode efficace et sûre pour inhiber l’expression des gènes dans le foie constitue un outil important pour déterminer la fonction des gènes dans la physiopathologie hépatique. Dans cette étude, nous décrivons une méthode d’injection intrasplénique du virus adéno-associé de sérotype 8 (AAV8) conçue pour exprimer un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) contre un gène cible d’intérêt, la nucléostémine (NS). L’injection intrasplénique d’AAV8 exprimant un shRNA ciblant le NS (AAV8-shNS1) a permis d’obtenir la même efficacité d’inactivation du NS dans le foie que l’injection dans la veine porte, par rapport à l’injection d’AAV8 exprimant un shRNA à séquence brouillée (AAV8-shScr). De plus, l’injection du virus AAV8-shRNA a déclenché des réactions inflammatoires minimes dans le parenchyme hépatique. Plus important encore, ce protocole d’injection intrasplénique n’était pas techniquement exigeant et provoquait un saignement minimal au site d’injection, qui est la principale cause de mortalité périopératoire et postopératoire lors de l’injection de la veine porte. Cette étude fait état d’une méthode améliorée et relativement sûre pour obtenir une neutralisation efficace des gènes dans le foie.

Introduction

Le foie est un organe vital qui métabolise les nutriments et les produits chimiques, mais il est également constamment exposé à des agressions cytotoxiques et cancérigènes. Alors que le foie adulte est capable de repousser après une blessure, son pouvoir de régénération est gravement entravé à l’âgede 1 an. À ce jour, la seule option thérapeutique pour les patients atteints de maladies hépatiques chroniques en phase terminale ou de lésions hépatiques aiguës massives est la transplantation hépatique, qui pose de nombreux défis en soi2. Pour mieux comprendre la physiopathologie moléculaire du foie en interrogeant les fonctions des gènes d’intérêt, des manipulations génétiques ont été développées pour une application in vivo , y compris l’inactivation médiée par l’ARNi et la délétion ciblée par une recombinase Cre en présence de sites loxP3. La cassette d’expression créale et la construction shRNA peuvent être délivrées par des véhicules viraux.

Le virus adéno-associé de sérotype 8 (AAV8) est un vecteur robuste pour l’administration de gènes à des types de tissus sélectifs (par exemple, le foie, les muscles squelettiques, le cœur, le cerveau et le pancréas) avec une efficacité élevée et une faible réponse inflammatoire 4,5. Pour cibler les organes internes du corps, l’AAV8 est généralement introduit par injection dans la veine de la queue, dans laquelle les particules virales traversent d’abord les poumons avant d’atteindre la circulation systémique. En revanche, l’injection dans la veine porte leur permet d’atteindre le foie avant de circuler dans les poumons, une source potentielle de séquestration et de dilution. Cependant, l’injection dans la veine porte est techniquement difficile et souvent compliquée par des saignements induits par l’opération et un taux de mortalité élevé. Pour obtenir une inactivation génique (KD) efficace dans le foie tout en évitant le problème d’une mortalité péri/postopératoire élevée, nous avons testé une méthode d’injection intrasplénique d’AAV8 portant un shRNA modifié ciblant la nucléostémine (NS) (AAV8-shNS1) et comparé son efficacité KD à celle de l’AAV8-shNS1 injecté dans la veine porte.

La NS est une protéine enrichie en cellules souches/progénitrices découverte d’abord dans les cellules souches neurales, puis dans plusieurs autres types de cellules souches et de cancers 6,7. L’importance biologique de la NS est démontrée par le phénotype létal embryonnaire précoce des souris germinales NS-knockout (NSKO) in vivo 3,8 et par la perturbation de l’auto-renouvellement induite par la NSKD in vitro 9,10. Chez les animaux adultes, des niveaux élevés d’expression de NS sont trouvés dans le testicule et plusieurs tissus en cours de régénération, y compris les cellules épithéliales dédifférenciantes pigmentées de triton après lentiectomie et les cellules musculaires après amputationd’un membre 11, ainsi que les tissus mammifères en régénération, tels que les cardiomyocytes de souris après une lésion cardiaque12 et les hépatocytes après une lésion hépatique (par exemple, CCl4) ou une résection chirurgicale (par exemple, hépatectomie partielle)13,14. De plus, il a été démontré que le NS joue un rôle important dans le développement des tumeurs mammaires, hépatiques et buccales 15,16,17. D’un point de vue mécanistique, il a été démontré que le NS favorise l’auto-renouvellement en protégeant le génome réplicatif des dommages à l’ADN18,19. Cependant, en raison du phénotype létal embryonnaire précoce de la lignée germinale NSKO, une méthode expérimentale pour introduire temporellement la NSKD après la fin du développement tissulaire est nécessaire pour déterminer davantage ses activités biologiques dans les organes adultes.

Dans cet article, nous utilisons la SN comme exemple pour illustrer l’établissement et la mise à l’essai d’une méthode KD in vivo du gène hépatique qui est efficace et dont la mortalité induite par la procédure est faible.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux réalisées dans le cadre de cette étude ont été examinées et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Texas A&M University Health Science Center à Houston (numéro d’approbation : 2021-0264-IBT) et réalisées conformément à toutes les directives réglementaires et institutionnelles pertinentes. Des souris femelles C57BL/6J (âgées de 4 à 5 mois, poids corporel de 23 à 30 g) ont été utilisées. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Conception et production d’AAV8- shRNA

REMARQUE : Veuillez consulter Sands et al.4 pour les détails de la procédure.

  1. Concevez des oligonucléotides shRNA sens et anti-sens qui ciblent une longue séquence de 21 nucléotides dans la région codante du gène d’intérêt. Dans ce cas, on a utilisé du NS de souris (shNS1) et une séquence brouillée de 21 nucléotides comme contrôle négatif (shScr) (Figure 1A, panneau du bas).
  2. Inclure dans la structure en épingle à cheveux une séquence tige-boucle de TTCAAGAGA, une extrémité émoussée de 5', une extrémité cohésive compatible avec le XhoI de 3' et une séquence de détection ciblée spécifique au gène de 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3' (shNS1) ou une séquence brouillée de 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3' (shScr).
  3. Phosphoryler et recuire chaque paire d’oligonucléotides.
  4. Digest Le vecteur de transfert de gène AAV, AV5-siRNA-GFP (Figure 1A, panneau supérieur), avec HpaI et XhoI, déphosphoryle et gélifie le fragment de vecteur.
  5. Ligate des oligonucléotides recuits dans le vecteur purifié en gel.
  6. Transformez les produits d’ADN ligaturé en bactéries DH5α compétentes avec une efficacité de sous-clonage.
  7. Choisissez des clones uniques en fonction de leur résistance à l’ampicilline et cultivez une culture bactérienne de 100 ml pour le miniprep plasmidique. Confirmez le clonage correct par séquençage et préparez les plasmides à l’aide du kit sans endotoxines disponible dans le commerce (en suivant les instructions du fabricant).
  8. Emballez les virus AAV8 en transfectant le vecteur de transfert AV5, le sérotype 8 Rep/Cap et les plasmides auxiliaires AdF6 dans des cellules 293T à l’aide du réactif de transfection iMFectin. Au total, 40 plats de × 15 cm ont été transfectés et récoltés/digérés 3 jours après la transfection.
  9. Récupérer l’AAV8 associé à la cellule par lyse cellulaire et précipiter l’AAV8 sécrété dans le milieu avec 40 % de PEG. Après la digestion, combiner les virus AAV8 dans le lysat cellulaire et le milieu, purifier sur un gradient d’iodixanol discontinu et se concentrer dans des unités de centrifugation de coupure de poids moléculaire (1,00,000 MW).
  10. Quantifiez les titres d’AAV8 par qPCR avec les amorces : WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') et WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. Injection intrasplénique d’AAV8 (Figure 1B, 1C) 

  1. Placez les souris C57BL6/J dans une chambre d’anesthésie remplie d’isoflurane à 2 % et d’oxygène (conformément aux protocoles approuvés par l’établissement). Après la perte de conscience, transférez les souris dans la zone chirurgicale aseptique en position couchée latérale droite. Maintenez l’anesthésie par 2 % d’isoflurane avec de l’oxygène délivré par un cône nasal.
  2. Stérilisez le site d’incision avec de la chlorhexidine à 2 % suivie de 80 % d’éthanol. Utilisez une paire de ciseaux médicaux de 6,3 pouces pour faire une incision de 15 mm sur la paroi abdominale supérieure gauche, suivie d’une incision de 10 mm sur le péritoine.
  3. Exposez doucement la rate à l’aide d’une pince et maintenez-la en place avec une gaze humide placée sous l’organe.
  4. Mélanger délicatement et injecter les virus AAV8 (50 μL) sur une période de 30 s dans la rate à l’aide d’une aiguille de 30 G dont l’extrémité est placée à une profondeur de 3 mm sous la surface (figure 1B). Couvrez le site d’injection avec un coton-tige et compressez pendant 1 min.
  5. Suturez le péritoine avec une suture intestinale chromique résorbable 4-0.
  6. Fermez la paroi abdominale et la peau avec une suture en soie 4-0.
  7. Placez les souris dans une cage propre sur un coussin chauffant électrique et surveillez-les jusqu’à ce qu’elles se rétablissent.

3. Injection d’AAV8 dans la veine porte

  1. Anesthésie les souris C57BL6/J par inhalation d’isoflurane (2 %) mélangé à de l’oxygène (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
  2. Effectuez une laparotomie 4,13 à travers une incision médiane (~ 1 pouce) sur la peau, puis dans le péritoine.
  3. Placez un tampon de gaze stérile imbibé de solution saline stérile sur le côté gauche de la souris et utilisez un coton-tige stérile pour retirer doucement le gros et le petit intestin. Placez l’intestin sur une gaze mouillée et couvrez-le d’un tampon pour éviter d’entrer en contact avec la peau ou de le dessécher.
  4. Injecter le virus AAV dans la veine porte à l’aide d’une aiguille stérile de 32 G dans un volume de 50 μL. Insérez l’aiguille de 3 à 5 mm dans la veine du port à un angle inférieur à 5 degrés. Laissez le sang circuler au-delà de l’aiguille pendant 5 secondes pour éviter le reflux.
  5. Placez un coton-tige stérile sur le site d’injection avec une légère pression jusqu’à la fermeture complète de la veine et aucun saignement (environ 5 min) pour éviter les saignements.
  6. Remettez doucement les organes internes dans la cavité abdominale.
  7. Fermez la paroi abdominale et la peau avec une suture en soie 4-0.

4. Analyse qRT-PCR

  1. Extraire les ARN de 50 à 100 mg de tissu hépatique 4,13 à l’aide d’un réactif d’isolement d’ARN disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matières).
  2. Synthétisez des ADNc 1er brin à partir d’ARN totaux avec des hexamères aléatoires et la transcriptase inverse M-MLV20,21.
  3. Déterminez les valeurs ΔC(t) entre le gène cible et les gènes de référence à l’aide du système de détection PCR en temps réel monochrome et du réactif vert supermix SYBR conformément aux rapports précédemment publiés22,23.
  4. Mesurer les valeurs ΔΔC(t) à partir de quatre répétitions biologiques et de trois répétitions techniques (n = 12). Réglez Tm à 60 °C pour toutes les réactions. Confirmez les résultats à l’aide de deux gènes de référence, Rps3 et Rplp0.
  5. Concevoir les séquences d’amorces comme suit : Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' et 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3' ; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' et 5'-cat tct gtg tcc tgg c-3' ; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' et 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

Résultats

Efficacité du gène KD dans le foie par intrasplénique vs. injection dans la veine porte d’AAV8-shRNA
Les stocks viraux d’AAV8 ont été dilués à une concentration de travail de 2E+12 copies du génome (gc) par millilitre (gc/mL). Des souris individuelles ont reçu une injection de 1E+11 gc d’AAV8-shNS1 ou d’AAV8-shScr (50 μL) par injection intrasplénique ou dans la veine porte. Deux semaines après l’injection, des tissus hépatiques ont été prélevés pour l’isolement de l’ARN, la synthèse de l’ADNc 1brin et l’analyse qPCR. Les résultats ont montré que la méthode d’injection intrasplénique a atteint statistiquement la même efficacité NSKD (20,8 % ± 4,4 %) que la méthode d’injection de la veine porte (16,3 % ± 3,6 %) en utilisant Rsp3 et Rplp0 comme référence interne (Figure 2). Plus particulièrement, la procédure d’injection intrasplénique pouvait être terminée en 15 minutes sans presque aucun décès causé par la procédure, alors que la méthode d’injection dans la veine porte nécessitait normalement 25 à 30 minutes avec beaucoup de pratique et était associée à un taux de mortalité plus élevé (~25 % à 30 % de taux de mortalité).

Réponse inflammatoire tissulaire
Des tissus hépatiques ont été prélevés chez des souris recevant une injection dans la veine porte ou une injection intrasplénique d’AAV8-shScr (figure 3A) ou d’AAV8-shNS1 (figure 3B) et comparés à ceux de souris témoins (figure 3C). Les réactions inflammatoires ont été examinées par coloration H&E4. Les résultats ont montré que ni AAV8-shScr ni AAV8-shNS1 n’ont provoqué de réactions inflammatoires notables dans le parenchyme hépatique par rapport au PBS injecté par la méthode d’injection intrasplénique (Spl) ou d’injection dans la veine porte (PV) (Figure 3A-C).

figure-results-1
Figure 1 : Illustrations de la conception de l’AAV8-shRNA et de la procédure d’injection intrasplénique. (A) (En haut) Schéma du plasmide AV5-siRNA-GFP conçu pour fabriquer le virus adéno-associé de sérotype 8 (AAV8) pour les expériences de knockdown in vivo. AV5-siRNA-GFP contient une séquence de shRNA pilotée par le promoteur CMV et EGFP. (En bas) Petites constructions d’ARNi en épingle à cheveux conçues pour cibler des séquences de 21 nucléotides sur un NS de souris (shNS1) ou une séquence de 21 nucléotides brouillée (Scr). (B) Un schéma du flux de travail dans la procédure d’injection intrasplénique d’AAV8. (C) Vues par étapes de l’intervention chirurgicale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Efficacité de l’inactivation de la nucléostémine (NS) médiée par AAV8-shRNA dans le foie par injection intrasplénique par rapport à l’injection dans la veine porte. Tests qRT-PCR de l’expression de NS dans des échantillons de foie prélevés sur des souris à 2 semaines après l’injection intrasplénique (Spl) ou veineuse porte (PV) d’AAV8-shScr ou d’AAV8-shNS1 (1E+11 gc). Les graphiques montrent les résultats en référence à deux contrôles internes, Rps3 (A) et Rplp0 (B). Les barres montrent la MEB moyenne ± quatre répétitions biologiques, chacune avec trois répétitions techniques de PCR ; *p < 0,01 ; **p < 0,001 ; p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Histologie des tissus hépatiques après injection intrasplénique ou injection dans la veine porte de PBS, AAV8-shScr ou AAV8-shNS1. Coloration H&E des tissus hépatiques à 2 semaines après l’injection intrasplénique (Spl) ou l’injection dans la veine porte (PV) d’AAV8-shScr (A) ou d’AAV8-shNS1 (B), par rapport à celle des échantillons témoins non injectés d’AAV8 (C). Barres d’échelle : 100 μm. Les panneaux de droite montrent des vues agrandies des inserts dans les panneaux de gauche. Barres d’échelle : 50 μm. Six à neuf coupes de deux animaux différents ont été examinées dans chaque groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le gène KD par livraison virale d’une construction exprimant soit un shRNA dans un fond de type sauvage24,25, soit une construction exprimant la recombinase Cre dans un fond floxé26 est un moyen puissant d’interroger la fonction du gène in vivo d’une manière inductible et contrôlée dans le temps. Une méthode d’administration idéale pour les études in vivo de KO/KD de gènes devrait permettre d’obtenir une efficacité élevée de KO/KD dans l’organe d’intérêt et, en outre, la procédure elle-même devrait être techniquement facile avec un minimum de mortalité péri/postopératoire.

Pour les organes internes comme le foie, les particules virales peuvent être introduites par injection par la veine de la queue27 ou la veine porte28,29 ou par injection directe dans la rate (injection intrasplénique)30,31. La veine porte et les injections intraspléniques introduisent des particules virales dans la circulation porte, qui s’écoulent dans le foie avant de pénétrer dans la veine cave inférieure et par la suite, dans la circulation pulmonaire. En revanche, les particules virales introduites par injection dans la veine caudale contournent la circulation porte et passent dans la circulation pulmonaire avant d’atteindre la circulation systémique. Pour les organes recevant la circulation portale, tels que le foie, la veine porte et les injections intraspléniques offrent l’avantage de délivrer des particules virales directement à ces organes sans risquer d’être séquestrés par le poumon ou dilués dans la circulation systémique. Pour les organes qui ne reçoivent pas de circulation portale, comme le cerveau, l’injection dans la veine de la queue peut être plus bénéfique pour ne pas soumettre les particules virales au foie avant d’atteindre la circulation pulmonaire et, par la suite, la circulation systémique.

Dans cette étude, nous avons injecté AAV8-shNS1 à une dose de 1E+11 gc par animal, ce qui a donné une meilleure efficacité KD par rapport à 1E+10 gc mais a obtenu le même effet KD que 5E+11 gc par injection intraporte (données non présentées). À la dose 1E+11 gc, en comparant la méthode d’injection dans la veine porte et la méthode d’injection intrasplénique, aucune différence statistique n’a été observée entre ces méthodes dans leur efficacité NSKD dans le foie, atteignant une efficacité KD de 70 % à 80 %. L’effet du gène KD de l’AAV8 injecté dans la veine porte dans le foie peut durer jusqu’à six semaines de manière dépendante de la construction23. Notamment, les complications liées à l’intervention, telles que les saignements induits par l’opération et l’adhérence de l’épiploon / péritoine, ainsi que les difficultés techniques, sont significativement moins nombreuses et plus faibles pour la méthode d’injection intrasplénique par rapport à la méthode d’injection de la veine porte. En conséquence, l’injection de la veine porte est effectuée une fois, tandis que l’injection intrasplénique peut être effectuée à plusieurs reprises32. Enfin, les réponses inflammatoires étaient faibles ou nulles dans le parenchyme des foies recevant soit une injection dans la veine porte, soit une injection intrasplénique d’AAV8-shScr ou d’AAV8-NS1. La dernière découverte, cependant, n’exclut pas la possibilité que des titres extrêmement élevés d’AAV puissent encore déclencher des réponses inflammatoires qui confondent les résultats expérimentaux. Par conséquent, la dose optimale d’AAV doit être déterminée empiriquement et équilibrée entre l’efficacité du KD et la réaction induite par l’AAV8, et peut varier entre différents gènes et/ou séquences ciblés. En conclusion, ces résultats démontrent que l’injection intrasplénique d’AAV8-shRNA est une méthode très efficace, relativement sûre et simple pour obtenir in vivo le gène KD dans le foie.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) Individual Investigator Research Award (RP200081) à RYT.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Unités de centrifugation par filtre AmiconMilliporeSigmaUFC9100Ultrafiltration rapide
AV5-siRNA-GFP  ;Addgene  ;#124972Plasmide
Compétent DH5&alpha ; bactéries  ;Invitrogen#18265-017Souche chimiquement compétente pour le clonage  ;
HpaI  ;New England BiolabsR0105Enzyme de restriction
iMFectine réactif de transfection  ;GenDepotI7100-101
M-MLV transcriptase inverse  ;PromegaM1708ADN polymérase dépendante de l’ARN²
Système de détection PCR monochrome en temps réel MyiQ  ;Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
Kit sans endotoxines omégaBioteckD6915-03Préparation midi de l’ADN plasmidique  ;
Hexamères aléatoires  ;Invitrogen48190-011
Supermix SYBR réactif vert  ;Bio-Rad1708882Applications de PCR en temps réel
T4 ADN LigasePromegaM1801
TRIzol Reagent  ;Life Technologies15596-018Isolement d’ARN total de haute qualité
XhoINew England BiolabsR0146Enzyme de restriction

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D livrance par AAV8expression g nique h patiqueinjection dans la veine porteinactivation de la nucl ost minefoie de sourisinterf rence ARNr g n ration h patique
Inactivation efficace d’un gène dans le foie par injection intrasplénique d’un petit ARN en épingle à cheveux délivré par le virus adéno-associé de sérotype 8 (AAV8)
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