Article de méthode

Exploiter la puissance des cargaisons de microARN dans de petites vésicules extracellulaires libérées par des sections de cerveau humain fraîchement congelées

1.1K vues

⸱

DOI :

10.3791/67379

⸱

8 novembre 2024

 ,  ,  , 
1Translational Medicine Laboratory, Biomedical Research and Innovation Centre, University of Salford

Dans cet article

Résumé

Ici, nous établissons un protocole utilisant des quantités minimales de coupes de tissu cérébral fraîchement congelé et une méthode de centrifugation à grande vitesse accessible couplée à une chromatographie d’exclusion stérique pour obtenir de petites vésicules extracellulaires comme sources de biomarqueurs de microARN (miARN) pour les troubles neurologiques.

Résumé

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont des médiateurs cruciaux de la communication cellule-cellule, transportant diverses cargaisons comme les protéines, les lipides et les acides nucléiques (microARN, ARNm, ADN). La cargaison de microARN sEV a une utilité potentielle en tant que biomarqueur de maladie puissant et non invasif en raison de la capacité de sEV à traverser les barrières biologiques (par exemple, la barrière hémato-encéphalique) et à devenir accessible par divers fluides corporels. Malgré de nombreuses études sur les biomarqueurs de la sEV dans les fluides corporels, l’identification de sous-populations de sEV spécifiques aux tissus ou aux cellules reste difficile, en particulier à partir du cerveau. Notre étude relève ce défi en adaptant les méthodes existantes pour isoler les sEVs à partir de quantités minimales de sections de cerveau humain congelées à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique (SEC).

Après approbation éthique, environ 250 μg de tissu cérébral humain fraîchement congelé (obtenu de la Manchester Brain Bank [Royaume-Uni]) ont été tranchés à partir des 3 tissus du donneur et incubés dans une solution de collagénase de type 3/Hibernate-E, avec agitation intermédiaire, suivie d’étapes de centrifugation et de filtration en série. Ensuite, les sEVs ont été isolés à l’aide de la méthode SEC et caractérisés en suivant les directives MISEV. Avant d’isoler l’ARN à l’intérieur de ces sEV, la solution a été traitée avec de la protéinase-K et de la RNase-A pour éliminer tout ARN extracellulaire non sEV. La quantité et la qualité de l’ARN ont été vérifiées et traitées pour les expériences de qPCR et de séquençage de petits ARN.

La présence de sEVs a été confirmée par l’analyse de suivi des nanoparticules de fluorescence (fNTA) et le western blot pour les marqueurs de surface (CD9, CD63, CD81). La distribution granulométrique (50-200 nm) a été confirmée par NTA et microscopie électronique. La concentration totale d’ARN dans les sEV lysés variait de 3 à 9 ng/μL et a été utilisée pour la quantification réussie par qPCR de microARN candidats sélectionnés. Le séquençage de petits ARN sur MiSeq a fourni des données de haute qualité (Q >32) avec 1,4 à 5 millions de lectures par échantillon.

Cette méthode permet d’isoler et de caractériser efficacement les sEV à partir de volumes minimaux de tissu cérébral, facilitant la recherche non invasive de biomarqueurs, et est prometteuse pour des études équitables de biomarqueurs de maladies, offrant des informations sur les maladies neurodégénératives et potentiellement d’autres troubles.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont l’un des acteurs clés de la communication intercellulaire chez tous les organismes multicellulaires1. Les VE sont des particules membranaires lipidiques bicouches dérivées de cellules qui peuvent faciliter le transfert d’une variété de charges, telles que des protéines, des lipides et des acides nucléiques, vers les cellules réceptrices. Les VE peuvent avoir une large gamme de tailles allant de 30 nm à 1 μM. Les petits VE (sEV), définis comme des vésicules liées aux lipides d’un diamètre moyen de <200 nm, ont la capacité de traverser la barrière hémato-encéphalique ; par conséquent, ils ont été impliqués dans la propagation et l’exacerbation de maladies neurodégénératives et d’autres affections telles que la maladie d’Alzheimer (MA), la démence frontotemporale (FTD), la maladie de Parkinson (MP) et les cancers 2,3. De plus, comme les sEV peuvent être trouvés dans une gamme de biofluides tels que le sang, le liquide céphalo-rachidien (LCR), la salive et même l’urine, leur utilisation bénéfique peut couvrir le domaine des biomarqueurs et des diagnostics non invasifs. Par exemple, la recherche sur la MA peut indiquer l’utilisation de rapports de protéines pathogènes de biofluides, tels que tau/Aβ, ou même Aβ42/Aβ404.

L’une des cargaisons connues de sEV est le microARN (miARN), un groupe de petites molécules d’ARN non codantes d’environ 22 nucléotides de longueur qui se lient aux régions 3'-UTR de l’ARNm et régulent généralement négativement l’expression des protéines. Impliqués dans de nombreux rôles cellulaires, les miARN ont également été impliqués dans la pathogenèse de diverses maladies, notamment les cancers et les maladies neurodégénératives. Cheng et al. ont effectué une analyse de séquençage à haut débit des signatures d’expression des miARN sEV dérivés du sérum de patients atteints de la maladie d’Alzheimer5. Une fois couplés aux dossiers de neuroimagerie et aux facteurs de risque connus de l’âge, du sexe et de la présentation de l’allèle APOE ε4, les résultats ont permis de prédire la MA avec une sensibilité de 87 % et une spécificité de 77 %. De plus, la recherche a identifié deux miARN du LCR régulés à la hausse (miR-151a-3p, let-7f-5p) et 3 miARN régulés à la baisse (miR-27a-3p, miR-125a-5p et miR-423-5p) qui peuvent potentiellement diagnostiquer la6 à un stade précoce. Dans le cas des maladies pathologiques, l’état pathologique peut précéder certains symptômes caractéristiques des maladies, tandis que dans le cas de la neurodégénérescence, l’accumulation de caractéristiques pathologiques se produit beaucoup plus tôt que le déclin cognitif.

Les microARN sont potentiellement un biomarqueur plus efficace que les protéines, en raison de leurs fonctions diverses et de leur régulation épigénétique d’ordre supérieur. À l’aide de tissus cérébraux, les chercheurs peuvent potentiellement identifier des signatures spécifiques de miARN sEV (BDsEV) dérivées du cerveau pour des maladies et leurs sous-types. Par exemple, les sEV avec des marqueurs neuronaux et gliaux peuvent présenter différentes cargaisons de miARN, et l’analyse peut aboutir à des méthodes plus précises de détection de la maladie. De plus, il est suggéré que les BDsEVs jouent un rôle important dans la propagation transsynaptique des protéines neuropathogènes7. Des rapports antérieurs ont suggéré l’immunoprécipitation et l’ultracentrifugation par gradient de densité (gradient de saccharose) pour obtenir des sEV à partir de tissus cérébraux fraîchement congelés 8,9. Cependant, ces approches nécessitent une infrastructure spécifique avec des méthodes d’ultracentrifugation et de purification en aval pour obtenir des échantillons sEV de haute qualité10. Des rapports plus récents ont suggéré plusieurs modifications et améliorations à l’approche 11,12,13 ; Cependant, malgré cela, l’isolement et l’étude des microARN dérivés de sEV à partir de tissus humains ne sont pas encore largement appliqués. L’approche décrite dans ce protocole vise à fournir un protocole affiné, étape par étape, pour l’étude de la sEV dérivée du cerveau afin d’améliorer l’accessibilité à cette technique. Nous avons établi un protocole utilisant des quantités minimales de tissu cérébral, à partir duquel nous avons isolé des sEV purs à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique et montré des données de séquençage de nouvelle génération de haute qualité à partir de la cargaison de microARN de ces sEV.

Protocole

Le travail a été approuvé éthiquement par la Manchester Brain Bank (référence REC 09/H0906/52) et par le comité d’éthique de l’Université de Salford (ID de la demande : 3408).

1. Dégradation de la matrice intracellulaire à l’aide de la collagénase sur des coupes de tissus cérébraux congelés

  1. Trancher finement 250 mg de tissu cérébral congelé (fragments d’environ 0,4 mm d’épaisseur) à l’aide d’un scalpel stérilisé sur une plaque froide et ajouter 2 ml de solution de collagénase de type III/Hibernate-E à 75 U/mL.
  2. Incuber chaque échantillon dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min. Au bout de 5 minutes, retournez chaque échantillon deux fois pour mélanger ; Au bout de 10 minutes, pipeter chaque échantillon trois fois doucement à l’aide d’une bande de plastique jetable de 10 ml.
  3. Placez chaque échantillon sur de la glace et ajoutez 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase et 1x inhibiteur de phosphatase. Cela arrête la réaction enzymatique et constitue le point final de la digestion à l’aide de la collagénase de type III.
  4. Centrifuger chaque échantillon de tissu cérébral à 300x g pendant 10 min à 4 °C. Prélever chaque surnageant et centrifuger une autre fois à 2000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  5. Recueillir à nouveau chaque surnageant et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Centrifuger chaque filtrat à 10 000 x g pendant 48 min à 4 °C.
  6. Prélever le surnageant et ajouter un tampon de précipitation dans un rapport de 2:1 à chaque échantillon. Incuber toute la nuit à 4 °C.
  7. Centrifuger chaque échantillon à 10 000 x g pendant 96 min à 4 °C et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de PBS exempt de vésicules extracellulaires (VE).

2. Préparation des colonnes de chromatographie d’exclusion stérique

  1. Avant utilisation, équilibrez la colonne SEC pré-préparée à température ambiante (RT) pendant 15 min.
    REMARQUE : Le capuchon inférieur doit être retiré avant le capuchon à vis.
  2. Après l’équilibrage, retirez le tampon de préservation du haut de la colonne et lavez-la deux fois avec 250 μL de PBS sans VE. Chaque lavage PBS est laissé pour entrer dans la colonne par gravité.

3. Isolement de petites vésicules extracellulaires à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique

  1. Ajoutez la pastille remise en suspension sur le dessus de la colonne SEC et centrifugez la colonne à 50 x g pendant 30 s. Jetez le flux continu.
  2. Ajoutez 180 μL de PBS sans VE au sommet de la colonne SEC et centrifugez la colonne à 50 x g pendant 1 min, en laissant les sEV dérivés du cerveau s’éluer de la colonne.
    REMARQUE : La partie du protocole détaillée ci-dessus est résumée à la figure 1.

4. Confirmation de petits marqueurs de vésicules extracellulaires par western blot

  1. Pour lyser les sEV avant l’analyse par transfert Western (afin de s’assurer que toutes les cargaisons membranaires et cytosoliques sont analysées), diluez l’échantillon isolé de sEV 1:1 dans un tampon de lyse et d’extraction (1x inhibiteur de protéase et 1x inhibiteur de phosphatase).
  2. Agiter l’échantillon à 4 °C pendant 30 min.
  3. Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 15 min.
  4. Prélever le surnageant protéique et mesurer les concentrations de protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines.
  5. Mélangez les échantillons avec 4 tampons Laemmli et chargez 20 μg de protéines dans chaque puits contre une échelle protéique pré-colorée.
  6. Une fois résolues, transférez les protéines sur une membrane de nitrocellulose de 0,45 μm. Après le transfert, bloquer la membrane pendant 2 h dans 5 % de BSA.
  7. Incuber les membranes avec des anticorps primaires (tableau 1) pendant la nuit.
  8. Laver la membrane trois fois avec un tampon de lavage (1 % Tween20 en PBS) et colorer à l’aide d’un anticorps secondaire anti-souris. Ensuite, laver trois fois avec un tampon de lavage (1 % Tween20 en PBS).
  9. Suivez les étapes ci-dessus dans le manuscrit avant d’imager les taches.
  10. Image utilisant le substrat de peroxydase de raifort (HRP).

5. Confirmation de petites vésicules extracellulaires par analyse de suivi des nanoparticules (NTA)

  1. Effectuez une NTA pour analyser la concentration et la taille de toutes les particules de l’échantillon. Pour ce faire, il faut diluer chaque échantillon dans du PBS à un facteur de dilution de 1:1000.
  2. Injectez l’échantillon dans l’instrument NTA et lisez l’échantillon à une longueur d’onde de 550 nm. À ce stade, utilisez la quantité de particules pour mesurer la quantité de protéines par particule (généralement exprimée en femtogramme) comme recommandé dans les directives MISEV.
  3. Ensuite, pour le NTA fluorescent, diluer le masque cellulaire orange (CMO) (colore toutes les particules biologiques d’un échantillon) dans le PBS par un facteur de dilution de 1:1000. À partir de là, diluez le colorant CMO à l’aide d’un échantillon sEV avec un facteur de dilution de 1:10 - Incuber cette étape de dilution dans l’obscurité pendant 30 min à 4 °C.
  4. Diluer la deuxième dilution CMO à l’aide de PBS par un facteur de dilution de 1:1000.
    REMARQUE : La dilution finale du colorant CMO doit être de 1:10 000 000.
  5. Lire le CMO de chaque échantillon sEV à une longueur d’onde de 550 nm à l’aide de l’instrument NTA.
  6. Pour les anticorps fluorescents à la tétraspanine (voir le tableau des matériaux), diluez d’abord chaque anticorps respectif dans le PBS par un facteur de dilution de 1:10. À partir de là, diluez chacun des colorants à l’aide d’un échantillon sEV par un facteur de dilution de 1:10 - Incuber l’étape de dilution dans l’obscurité pendant 2 h à 4 °C.
  7. Diluer la deuxième dilution de l’anticorps à l’aide de PBS par un facteur de dilution de 1:1000.
    REMARQUE : La dilution finale de chaque anticorps anti-tétraspanine doit être de 1:100 000.
  8. Lire les lectures d’anticorps fluorescents de l’échantillon sEV à une longueur d’onde de 550 nm à l’aide de l’instrument NTA.

6. Confirmation de petites vésicules extracellulaires par microscopie électronique à transmission (MET)

REMARQUE : Ce protocole a été réalisé par l’installation de microscopie biomédicale de l’Université de Liverpool.

  1. Tout d’abord, fixez les échantillons de sEV à l’aide de glutaraldéhyde et colorez-les à l’aide d’acétate d’uranyle.
  2. À l’aide d’une série graduée d’alcools, déshydratez l’échantillon prêt pour le MET.
  3. Imagez des échantillons à l’aide d’un microscope électronique à transmission approprié.

7. Traitement à la protéinase K et à la RNase A

  1. À 50 μL de VE isolés dérivés du cerveau, ajoutez 1 μL de protéinase K à 20 μg/μL et incubez à 37 °C pendant 30 min.
  2. Arrêtez chaque réaction en ajoutant 1x cocktail d’inhibiteurs de protéinase et incubez sur glace pendant 10 min.
  3. Après l’incubation, ajouter 1 μL de RNase A à 10 μg/μL à chaque échantillon et incuber à 37 °C pendant 30 min.
    REMARQUE : Passez immédiatement à la section 8.

8. Isolement de l’ARN total à partir de petites vésicules extracellulaires

  1. Pour isoler l’ARN total, ajoutez 700 μL de réactif de lyse de récupération de l’ARN de haute qualité à 50 μL d’échantillon d’EV dérivé du cerveau (BDsEV). Agiter chaque échantillon pendant 1 h.
  2. Ajouter 140 μL de chloroforme, agiter vigoureusement chaque échantillon pendant 20 s et laisser incuber à RT pendant 3 min.
  3. Centrifuger l’échantillon à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C et prélever l’interphase de l’échantillon. Ajouter 1,5 fois le volume d’éthanol à 100 %.
  4. Ajouter 700 μL de mélange interphase/éthanol, colonnes d’isolement d’ARN et centrifuger à ≥8000 x g pendant 15 s à RT.
    REMARQUE : Répétez cette étape en utilisant tous les échantillons d’interphase/éthanol.
  5. À la colonne, ajoutez 700 μL de tampon de lavage et centrifugez à ≥8000 x g pendant 15 s. Jetez le flux continu.
  6. Ajouter 500 μL de tampon RPE et centrifuger à nouveau à ≥8000 x g pendant 15 s. Jetez le flux continu.
  7. Ajouter 500 μL d’éthanol à 80 % et centrifuger à ≥8000 x g pendant 2 min. Jetez le flux continu.
  8. À ce stade, séchez la membrane de la colonne en centrifugeant les colonnes à pleine vitesse (>8000 x g) pendant 5 min avec le couvercle ouvert.
  9. Transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte, ajoutez 14 μL d’eau exempte de RNase directement sur la membrane de la colonne et centrifugez à ≥8000 x g pendant 1 min pour éluer l’ARN total des BDsEV.
  10. Quantifiez le microARN total à l’aide d’échantillons à l’aide d’un kit de dosage de quantification de miARN, où les échantillons ont été mesurés sur un fluorimètre de quantification, en sélectionnant le type de test de miARN.

9. Séquençage des petits ARN

  1. Après la quantification des miARN dans l’échantillon, synthétisez une banque d’ADNc à l’aide du kit de préparation de bibliothèque Small RNA-Seq.
    REMARQUE : À l’aide de ce protocole, la génération de la bibliothèque comprend quatre étapes : la ligature de l’adaptateur 3', la purification, la ligature de l’adaptateur 5' et la transcription inverse - où, à la fin, une banque d’ARN/ADNc est formée. Après la génération de la bibliothèque, l’amplification par PCR finale se produit avec l’ajout d’amorces d’index (utilisées à des fins de multiplexage), après quoi les échantillons sont purifiés.
  2. Pour tester la qualité de l’ARN, utilisez un test d’application de contrôle de la qualité détaillant la taille de chaque préparation et l’intensité maximale.
  3. Pour tester la concentration d’ADN, mesurez la quantification de l’ADN sur un fluorimètre de quantification, en sélectionnant le type de test d’ADNdb.
  4. Préparez les échantillons pour le Small RNA Seq à l’aide du kit de réactifs, après quoi les échantillons sont chargés dans la cellule d’écoulement.

Résultats

Pour confirmer la présence de BDsEVs, trois techniques ont été utilisées : le western blot, le NTA et le TEM (figure 3). Les résultats du transfert Western (figure 3A et fichier supplémentaire 1) montrent la présence des cinq marqueurs positifs (CD9, CD63, CD81, Flot-1 et TSG101) et l’absence de calnexine dans les sEV (utilisée comme témoin négatif), confirmant l’absence de contamination par le contenu cellulaire. Comme prévu, les homogénats cérébraux (BH) montrent plus de protéines que ce qui a été observé dans les sEV pour les marqueurs testés. Les images TEM ont confirmé la morphologie des BDsEVs et leur taille relative dans l’échantillon (figure 3B), ce qui a été confirmé par l’analyse du suivi des nanoparticules (figure 3C).

La figure 3C (panneau supérieur) montre les tailles de particules isolées comprises entre 50 et 200 nm. D’après les données NTA, en prenant le résultat de la diffusion comme 100 % des particules représentées, CMO représente environ 52,35 % des particules (Figure 3C, panneau inférieur) à avoir une bicouche lipidique. Parmi ces particules colorées au CMO, 34,66 % contenaient du CD9, 15,49 % contenaient du CD63 et 12,01 % contenaient du CD81. Voir le fichier supplémentaire 2 pour les données de contrôle NTA.

Les données de quantification de l’ARN isolé (tableau 2) montrent des niveaux allant de 3,24 à 8,76 (ng/μL), valeurs qui ont été normalisées lors de la génération des banques d’ADNc. Les résultats de l’analyse TapeStation (Figure 4) montrent des pics majeurs d’environ 120-160 pb, avec des pics plus petits en dessous d’environ 50 pb et d’autres pics plus petits qui sont plus élevés d’environ 484 pb.

Les contrôles qualité des données de séquençage de nouvelle génération montrent des lectures de très haute qualité après le découpage de l’adaptateur (Figure 5A). Toutes les positions de séquence montrent un score Phred de >30, indiquant des taux d’erreur inférieurs à 1 sur 1000 nucléotides. La figure 5B montre que la plupart des séquences se situent autour de 21-22 pb, ce qui correspond à la plage de taille attendue pour les microARN. Grâce à une cartographie plus poussée en aval (à l’aide de BowTie2), à l’aide du biooutil d’analyse Flagstat de Samtools, sur 1 304 100 séquences alignées, 1 116 264 (85 %) ont été cartographiées dans les régions de microARN du génome humain (build hg38 ; Tableau 3).

Sur le total des miARN, 808 miARN ont été exprimés dans les 3 échantillons, dont 344 entre les trois échantillons (~43 %), 5 entre le contrôle 1 et le témoin 2, 183 entre le témoin 1 et le témoin 3, et 16 partagés entre le témoin 2 et le témoin 3 (figure 6). D’après ces données, les miARN les plus élevés exprimés dans les trois BDsEV sont has-let-7b-5p, has-miR-143-3p, has-miR-30a-5p, has-miR-221-3p et has-let7i-5p. De même, les 5 miARN les moins différentiellement exprimés dans les échantillons de BDsEVs (lectures >10) sont has-miR-128-2-5p, has-miR-182-5p, has-miR-193b-5p, has-miR-448 et has-miR-505-3p. Tous les comptes de lecture bruts et normalisés sont donnés dans le fichier supplémentaire 3.

figure-results-1
Figure 1 : Flux de travail de traitement des tissus. La figure montre le processus par étapes d’isolement des sEVs dérivés du cerveau (BDsEVs) à partir de sections de cerveau fraîchement congelées à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Flux de travail d’isolement d’ARN à partir de BDsEV. La figure montre le processus par étapes d’isolement de l’ARN total des BDsEV, y compris l’étape de prétraitement consistant à éliminer tout ARN extracellulaire à l’aide de la protéinase K et de la RNase A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Flux de travail de caractérisation BDsEV. La figure montre différentes méthodes pour caractériser les BDsEVs. (A) Western blot pour détecter les marqueurs protéiques spécifiques de sEV. BH Homogénat cérébral. La calnexine est un contrôle négatif pour les sEVs - l’absence dans sEV et la présence dans BH confirment la pureté de l’échantillon sEV. Pour d’autres marqueurs, comme prévu, la quantité de protéines est plus élevée dans les échantillons BH que dans les échantillons sEV (20 μg de protéines chargées par puits). (B) Image représentative de microscopie électronique à transmission (MET) pour les BDsEVs à l’échelle de 200 μM, confirmant la morphologie attendue avec une membrane bicouche lipidique. (C) Graphique de distribution granulométrique pour l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) pour toutes les particules (panneau supérieur). Chaque point de données représente la variation sur trois répétitions. Proportions normalisées pour les particules biologiques (sEV) et proportions relatives pour des marqueurs de surface spécifiques (panneau inférieur) (données indiquées sous forme de moyenne ± SEM des puits triples (n = 3)). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Contrôle de la qualité de la préparation de la banque d’ADNc. Analyse par bandestation d’échantillons individuels après préparation de la banque d’ADNc. Les pics affichés dans chaque graphique affichent la taille de chaque préparation (axe horizontal, en bp) et l’intensité respective de chaque pic (axe vertical, FU). Les pics attendus de la petite banque d’ARN se situent autour de 120-160 pb, comme le montre la figure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Contrôle de la qualité du séquençage des micronomes. (A) Tracé FASTQC pour la qualité de lecture des échantillons individuels après le découpage de l’adaptateur. L’axe horizontal représente la position des nucléotides et l’axe vertical celui des scores Phred. Les boîtes à moustaches pour chaque position montrent la distribution du score Phred sur toutes les lectures pour chaque position. Toutes les distributions à l’intérieur de la zone verte confirment des données de très haute qualité (>Q30) impliquant une préparation d’échantillon de haute qualité. (B) La distribution de la longueur de séquence pour chaque échantillon montre que pour les trois échantillons, la majorité des lectures étaient d’environ 21-22 nucléotides - la plage de taille attendue pour les microARN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-6
Figure 6 : Chevauchement de l’expression des microARN dans tous les échantillons. Le diagramme de Venn indique le nombre de miARN détectés dans chaque échantillon (nombre de lectures ≥ 10) et de microARN spécifiques partagés dans plus d’un échantillon. Toutes les lectures brutes et normalisées sont affichées dans le fichier supplémentaire 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Épitope de l’anticorpsFacteur de dilution de l’anticorps 
Souris Anti-CD91:2000
Souris Anti-CD631:2000
Souris Anti-CD811:2000
Anti-flottille souris 11:2000
Souris Anti-TSG1011:1000
Anti-Calnexine de souris1:10 000
Anticorps secondaire anti-souris1:3000

Tableau 1 : Épitopes d’anticorps utilisés pour la caractérisation des BDsEV et leurs facteurs de dilution respectifs.

ÉchantillonConcentration de miARN (ng/μL)
18.76
23.24
35.33

Tableau 2 : Données de quantification de l’ARN isolé.

ÉchantillonSéquences alignéesMiARN cartographiésPourcentage ( %)
Échantillon de contrôle 11 444 6651 133 43778.46
Échantillon de contrôle 2442 808381 63186.18
Échantillon de contrôle 32 024 8281 983 72697.97
Moyenne1 304 100.331 166 264.6789.43

Tableau 3 : Quantité de séquences de miARN alignées et cartographiées avec succès.

Fichier supplémentaire 1 : Données supplémentaires d’analyse par transfert de Western. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Données de contrôle supplémentaires de la NTA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Nombre de lectures brutes et normalisées de l’analyse de l’expression des miARN. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Données supplémentaires sur la concentration en protéines. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole modifié et amélioré pour isoler les petites vésicules extracellulaires dérivées du cerveau et leur cargaison de microARN démontre la faisabilité d’utiliser un minimum de tissus sans compromettre la qualité et la quantité des produits en aval. Dans le domaine de la découverte de biomarqueurs, l’identification d’identificateurs moléculaires spécifiques aux types de cellules et de tissus peut conduire à des moyens plus accessibles de tests de diagnostic non invasifs utilisant des fluides corporels. De plus, l’approche décrite ici fournit le cadre pour l’identification de sous-populations spécifiques de sEV dans différents types de cellules (neuronale ou gliale), de types de tissus (tissu de l’hippocampe et tissu du cortex préfrontal) et de biofluides, ce qui permettra de mieux comprendre les signatures de chargement de cargaison, la physiopathologie et l’étendue de la maladie. Comme indiqué précédemment dans Vella et coll., il a été suggéré d’utiliser 450 mg à 1 g pour l’isolation du BDsEV, associée à une ultracentrifugation par gradient de densité (utilisant des vitesses allant jusqu’à 180 000 x g)8. Dans cette méthodologie, les sEV ont été isolées avec succès en utilisant des quantités plus faibles (réduction de >50 %) d’échantillons de tissus cérébraux fraîchement congelés (250-450 mg). La réduction de la quantité de tissu cérébral utilisée pour isoler les sEV permet de réduire les coûts et les consommables. De même, le protocole a été rendu plus accessible grâce à l’application de la SEC couplée à une centrifugation à grande vitesse (10 000 x g) au lieu de l’ultracentrifugation (180 000 x g).

À l’aide de la fNTA et de la TEM, nous avons établi que le profil de la gamme de tailles des sEVs se situe dans la gamme de taille caractéristique de 30 à 200 nm, comme recommandé par les directives MISEV13,14, la TEM fournissant une confirmation morphologique des sEVs obtenus. Comme le montrent la figure 3C et le fichier supplémentaire 4, >87 % des particules ont une taille de <250 nm, et les échantillons, en moyenne, montrent 10,56 fg protéine/BDsEV. Des espèces spécifiques de petites vésicules extracellulaires varient en taille et en forme, où des sous-populations caractéristiques plus petites, telles que les exosomes, ont une morphologie uniforme par rapport aux microvésicules qui auraient une structure irrégulière en raison de leur nature de biogenèse15. Pour le fNTA, une lecture de diffusion (520 nm) a été produite pour analyser les particules totales dans les échantillons, fournissant des détails sur le profil de taille et les concentrations. Les lectures montrent que plus de 50 % des particules étaient biologiques (par coloration de CMO), avec des populations de particules biologiques qui se situent dans la gamme de taille des sEV présentant des marqueurs tétraspanines, CD9 étant le plus prédominant dans nos échantillons de contrôle (34,66 %). Alors que pour le western blot, la présence de cargaisons caractéristiques de protéines membranaires et cytosoliques a fourni des preuves de la présence de sEV, l’absence de Calnexin confirmant que les BDsEVs sont exempts de toute contamination cellulaire. Pour s’assurer que le miARN disponible pour le traitement en aval faisait partie de la cargaison de sEV (et non d’autres ARN extracellulaires), nous avons traité les sEVs avec des enzymes Proteinase K et RNase A avant de perturber les membranes sEV pour dégrader toute protéine et ARN qui étaient présents à l’extérieur de l’espace extracellulaire à l’extérieur des BDsEVs16.

L’ARN total a été extrait des sEV et préparé pour des applications en aval telles que la qRT-PCR et le séquençage de nouvelle génération (pour les petits ARN). Les contrôles standard effectués à l’aide d’essais de contrôle de la qualité ont montré des échantillons de haute qualité et des banques d’ADNc prêts pour le séquençage. Les banques d’ADNc atteignent un pic d’environ 120 à 160 pb, ce qui attribue à des pics d’ADNc dérivés de miARN des séquences d’adaptateur de longueurs variables, les pics plus petits représentant potentiellement des dimères d’adaptateur.

L’analyse des données de séquençage de nouvelle génération à l’aide de FASTQC et de CutAdapt montre des résultats de haute qualité obtenus à partir de miARN BDsEV. Comme le montre la figure 5, chaque position lue a un score Q supérieur à 30 (Q30), ce qui montre une probabilité d’erreur de 0,001-0,0001 (1 sur 1000-10 000). De plus, l’analyse de la distribution de la longueur des séquences (Figure 6) montre des pics prédominants se situant dans la plage caractéristique des miARN (19-25 pb), ce qui suggère une qualité et une spécificité élevées pour les données obtenues.

De nombreuses études futures bénéficieront de cette méthode en raison de son accessibilité améliorée, ainsi que de l’économie de coûts et de ressources grâce à la réduction non seulement de la quantité d’échantillons de tissus, mais aussi de l’économie sur le coût des réactifs. La réduction (>50 %) de la quantité de tissu requise rend cette méthode également plus éthique. Aligné sur les efforts mondiaux en matière de santé de précision, le flux de travail amélioré détaillé ici fournit des outils comparativement plus abordables pour se lancer dans des biomarqueurs précis spécifiques au type de cellule via des voies non invasives (ou peu invasives) à l’aide de BDsEV et de leur cargaison. Cela peut être utilisé pour un large éventail d’affections neurologiques. Une limitation possible de cette méthode est que le protocole devra être ajusté si les chercheurs veulent utiliser un tissu autre que le cerveau humain pour l’isolement de la sEV. À long terme, cette méthode améliorée rendra la découverte et la validation non invasives de biomarqueurs spécifiques aux tissus plus équitables et plus accessibles dans le monde entier.

Déclarations de divulgation

Il n’y a aucun conflit d’intérêts pour l’un ou l’autre des auteurs.

Remerciements

Ce travail a été financé par la bourse de doctorat de Joseph Morgan de la Société Alzheimer du Royaume-Uni (subvention numéro 549/SERA-52) et par les fonds de la stratégie d’innovation de l’Université de Salford (subvention SEFA-39). Le tissu cérébral a été obtenu à partir de la banque de cerveaux de Manchester (référence REC 09/H0906/52) du réseau Brains for Dementia.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Albumine sérique bovineMerckA9418-100G
Masque cellulaire Coloration à membrane plasmique orangeThermoFisher ScientificC10045
Collagénase de type IIIStemCell Technologies07422
Colonnes ExoSpin et systèmesLtd.EX01-50Ce kit contient des colonnes SEC utilisées dans cette expérience, un tampon de précipitation et un PBS sans EV.
Cocktail d’inhibiteurs de protéase Halt (100x)ThermoFisher Scientific78429
Hibernate-E MediumThermoFisher ScientificA1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)BioRad1610747
Lexogen Small RNA-Seq Library Prep KitLexogen052.24Ce kit contient une petite boîte de réactifs de préparation d’ARN avec une plaque d’amorce d’index i7.  ;
miRNeasy Micro Kit (50)Qiagen217084Ce kit contient un réactif de lyse de récupération d’ARN de haute qualité (Qiazol), des colonnes d’isolement d’ARN, des tampons d’isolement (RWT, RPE) et de l’eau sans RNase.
Kit de réactifs MiSeq v3IlluminaMS-102-3001Il s’agit du kit de préparation Illumina
Membrane nitrocellulosique, 0,45 &mu ; mThermoFisher Scientific88018
PE/Dazzle 594 Anticorps CD63 anti-humainBioLegend143914Utilisé pour l’analyse fNTA
PE/Dazzle 594 Anticorps CD81 anti-humainBioLegend349520Utilisé pour l’analyse fNTA
PE/Dazzle 594 Anticorps CD9 anti-humainBioLegend312118Utilisé pour l’analyse fNTA
PhosSTOPMerck
4906845001 Pierce BCA Kit de dosage des protéinesThermoFisher Scientific23225
Proteinase KThermoFisher Scientific25530049
Qubit Kit de dosage des microARNThermoFisher ScientificQ32880
Qubit 1X dsDNA HS Kit de dosageThermoFisher ScientificQ33230
Qubit 3.0Fluoromètre ThermoFisher ScientificQ33216
Tampon de lyse et d’extraction RIPAThermoFisher Scientific89901
RNase AThermoFisher ScientificEN0531
SuperSignal West Femto Sensibilité maximaleSubstrat ThermoFisher Scientific34094
de guidage de cellules tampons

Références

  1. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  2. Fornari, S., Schäfer, A., Jucker, M., Goriely, A., Kuhl, E. Prion-like spreading of Alzheimer's disease within the brain's connectome. J R Soc Interface. 16 (159), 20190356(2019).
  3. Zhang, P., et al. Tumor-derived small extracellular vesicles in cancer invasion and metastasis: molecular mechanisms, and clinical significance. Mol Cancer. 23 (1), 18(2024).
  4. Constantinides, V., et al. CSF Aβ42 and Aβ42/ Aβ40 ratio in Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Diagnostics. 13 (4), 783(2023).
  5. Cheng, L., et al. Prognostic serum miRNA biomarkers associated with Alzheimer's disease shows concordance with neuropsychological and neuroimaging assessment. Mol Psychiatry. 20 (10), 1188-1196 (2015).
  6. Roser, A. E., Caldi Gomes, L., Schünemann, J., Maass, F., Lingor, P. Circulating miRNAs as diagnostic biomarkers for Parkinson's disease. Front Neurosci. 12, 625(2018).
  7. Jackson, N., Guerrero-Muñoz, M. J., Castillo-Carranza, D. L. The prion-like transmission of tau oligomers via exosomes. Front Aging Neurosci. 14, 974414(2022).
  8. Vella, L., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
  9. Yousif, G., Qadri, S., Parray, A., Akhthar, N., Shuaib, A., Haik, Y. Exosomes derived neuronal markers: Immunoaffinity isolation and characterization. Neuromolecular Med. 24 (3), 339-351 (2022).
  10. Kumar, K., et al. Recent advances in microfluidic approaches for the isolation and detection of exosomes. TRAC-Trend Anal Chem. 159, 116912(2023).
  11. Ransom, L., et al. Human brain small extracellular vesicles contain selectively packaged, full-length mRNA. Cell Rep. 43 (4), 114061(2024).
  12. Gomes, P., et al. A novel isolation method for spontaneously released extracellular vesicles from brain tissue and its implication for stress-driven brain pathology. Cell Commun Signal. 21 (1), 35(2023).
  13. Welsh, J., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV 2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2023).
  14. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  15. Pirisinu, M. The long journey of extracellular vesicles towards global scientific acclamation. Adv Pharm Bull. 13 (3), 489-501 (2023).
  16. Bender, A., Sullivan, B. P., Lillis, L., Posner, J. D. Enzymatic and chemical-based methods to inactivate endogenous blood ribonucleases for nucleic acid diagnostics. J Mol Diagn. 22 (8), 1030-1040 (2020).

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Biomarqueurs micro-ARNsEV du tissu cérébralchromatographie d'exclusion stériqueanalyse de suivi des nanoparticulesWestern Blotsuivi d'anticorps fluorescentsCD9 CD63 CD81séquençage de l'ARNdécouverte de biomarqueurs de maladies
Exploiter la puissance des cargaisons de microARN dans de petites vésicules extracellulaires libérées par des sections de cerveau humain fraîchement congelées
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.