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Étude de la différenciation des lymphocytes T CD4 murins à l’aide de l’ablation génique médiée par le complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9

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DOI :

10.3791/67380

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20 juin 2025

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1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une approche hautement adaptable pour utiliser l’ablation génique médiée par le complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9 dans les lymphocytes T CD4 naïfs murins afin d’étudier la fonction des gènes dans la différenciation des lymphocytes T CD4.

Résumé

L’accessibilité généralisée de la technologie CRISPR-Cas9 a fait du ciblage génique dans les cellules primaires une méthode de routine pour évaluer la fonction des gènes dans les lymphocytes T. Compte tenu du coût et de la disponibilité limitée des souches de souris knock-out (KO), tester des hypothèses préliminaires impliquant la fonction des gènes dans les cellules T peut être prohibitif à l’aide de modèles animaux ciblés par des gènes. Cependant, en utilisant des ressources disponibles dans le commerce, y compris des ARN guides préconçus (ARNg), les chercheurs peuvent facilement générer des lymphocytes T naïfs ciblés par des gènes qui peuvent être utilisés pour des études d’activation et de différenciation des lymphocytes T.

Nous décrivons ici un protocole d’utilisation des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) CRISPR-Cas9 délivrés par nucléofection pour générer efficacement des lymphocytes T CD4 naïfs murins du gène KO qui peuvent être utilisés pour évaluer la fonction des gènes dans la différenciation des lymphocytes T CD4, in vitro. L’isolement des lymphocytes T CD4 naïfs à partir d’organes lymphoïdes secondaires de souris, suivi d’une nucléofection avec des complexes Cas9-gRNA, garantit que le gène KO est initié avant l’activation des lymphocytes T en aval, offrant un avantage stratégique par rapport à la livraison d’ARNg à médiation rétrovirale, qui nécessite généralement une préactivation des lymphocytes T, empêchant l’évaluation des effets dans les lymphocytes T naïfs. De plus, cette méthode basée sur la nucléofection contourne les problèmes de développement potentiels associés aux animaux KO géniques.

Après l’administration de l’ARNg Cas9, nous décrivons des protocoles pour étudier la différenciation des lymphocytes T CD4 en lignées Th1, Th2, Th17 et Treg à l’aide de la polarisation in vitro . De plus, ce protocole est adaptable à l’utilisation de lymphocytes T CD4 ou CD8 ciblés par des gènes pour de nombreuses applications en aval, y compris d’autres études d’activation des lymphocytes T in vitro et des études de transfert adoptif in vivo. L’utilisation des méthodes CRISPR-Cas9 a rationalisé notre capacité à évaluer la fonction des gènes dans les cellules T et permet la KO de routine de nombreux gènes d’intérêt, libérant ainsi les chercheurs des limites associées à l’étude des animaux de KO de gènes.

Introduction

L’utilisation de technologies basées sur la répétition palindromique courte (CRISPR) a transformé notre capacité à manipuler les séquences d’ADN génomique, améliorant considérablement notre capacité à étudier la fonction des gènes dans d’innombrables systèmes biologiques. En ce qui concerne les lymphocytes T CD4, des méthodes utilisant des complexes de ribonucléoprotéines (RNP) CRISPR-Cas9 ont émergé, facilitant l’inactivation efficace de gènes (KO) dans les lymphocytes T naïfs primaires qui peuvent être utilisés pour des études in vitro et in vivo 1,2,3,4. L’identification de nouveaux gènes présumés régulant la différenciation des lymphocytes T CD4 est souvent motivée par des analyses transcriptomiques et épigénomiques, générant de nouvelles cibles pour lesquelles il peut y avoir peu de ressources ou des ressources difficiles à obtenir, en particulier si le gène affecte plusieurs tissus et peut nécessiter une évaluation à l’aide de souris ciblées par des gènes conditionnels. Le ciblage génique par transduction rétrovirale des ARNg 5,6 a été utilisé pour évaluer la fonction des gènes dans les lymphocytes T, mais nécessite l’activation des lymphocytes T pour l’infection rétrovirale, et ne peut pas être utilisé pour cibler les gènes dans les lymphocytes T naïfs. CRISPR-Cas9 délivré par nucléofection dans les lymphocytes T naïfs offre un outil alternatif relativement peu coûteux et rapide pour valider et interroger de nouveaux gènes d’intérêt avant d’investir dans des modèles de souris longs et coûteux.

Dans notre protocole décrit ici, l’édition de gènes médiée par CRISPR-Cas9 est réalisée à l’aide de la protéine Cas9 recombinante complexée avec des molécules d’ARN guide (ARNg) qui sont délivrées dans les lymphocytes T CD4 naïfs par nucléofection. L’ARNg est composé de deux composants distincts, un ARN CRISPR trans-activateur (ARNtracr) et un ARN CRISPR (ARNcr). Fonctionnellement, les séquences dérivées de l’ARNtracr facilitent l’association de l’ARNg avec Cas9, tandis que les séquences d’ARNcr contiennent une spécificité pour les régions d’intérêt de l’ADN cible. Les complexes d’ARNg Cas9 médient les cassures d’ADN double brin ciblées (ADNdb), les ARNg médiant la spécificité de la séquence de l’activité endonucléase Cas9 7,8. Le clivage de l’ADNdb médié par Cas9 conduit à l’inactivation du gène, par la génération de mutations indel après la jonction d’extrémités non homologues dans les cellules cibles9. Dans ce protocole, nous recommandons d’utiliser plusieurs ARNg ciblant des gènes d’intérêt pour assurer une KO robuste dans les lymphocytes T CD4 naïfs.

Les lymphocytes T CD4 auxiliaires sont des acteurs clés du système immunitaire, guidant les réponses immunitaires par la production d’une variété de cytokines qui modulent la fonction de nombreux types de cellules immunitaires. Lors de la stimulation par le récepteur des lymphocytes T (TCR) en présence de cytokines spécifiques, les lymphocytes T CD4 naïfs peuvent se différencier en lignées distinctes de lymphocytes T CD4 auxiliaires (Th), y compris les lymphocytes T Th1, Th2, Th17 et les lymphocytes T régulateurs (Treg)10,11,12. La définition de ces lignées distinctes de lymphocytes T CD4 est l’expression de facteurs de transcription (TF) et de cytokines spécifiques définissant la lignée (Figure 1). La différenciation des lymphocytes T CD4 peut être modélisée à l’aide de la polarisation in vitro 13,14,15, en utilisant des lymphocytes T CD4 naïfs activés par le TCR en présence de cytokines favorisant la lignée et d’anticorps bloquants qui empêchent l’adoption inappropriée de la lignée.

La combinaison du ciblage du gène CRISPR-Cas9 dans les lymphocytes T CD4 naïfs avec la polarisation in vitro des lymphocytes T CD4 offre un système robuste pour évaluer la fonction des gènes dans ces cellules (Figure 2). Étant donné la disponibilité généralisée de réactifs pour évaluer la différenciation des lymphocytes CD4 par cytométrie en flux, les aspects clés de la différenciation des lymphocytes T CD4, y compris l’expression des TF et la production de cytokines, peuvent facilement être interrogés à l’aide des protocoles décrits ici. L’identification de nouveaux gènes régulant la fonction des lymphocytes T CD4 améliore notre compréhension de ces cellules, et les méthodes CRISPR-Cas9 associées à la polarisation in vitro offrent une modalité robuste pour évaluer la fonction des gènes avant de s’engager dans des modèles murins de gène KO.

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Protocole

Pour toutes les procédures décrites ici, nous avons utilisé des souris C57/BL6J de type sauvage (WT). Les souris ont été maintenues et traitées dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (SPF) conformément aux directives du NIAID (protocole LISB-22E) et des comités de soin et d’utilisation des animaux du NIH (Animal Welfare Assurance #A-4149-01).

1. Considérations avant de commencer

  1. Sélection des réactifs à ARNg
    REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour obtenir des réactifs d’ARNg préconçus ciblant le génome de la souris utilisés dans ce protocole.
    1. Recherchez le gène d’intérêt (Table des matériaux, ARNc souhaités) et sélectionnez les trois ARNc prédéfinis les mieux classés (format 2 nmol). De plus, obtenir un ARNcr de contrôle négatif à utiliser en parallèle (Table des matériaux).
      REMARQUE : La formation d’ARNg fonctionnels nécessite le duplexage de l’ARNcr avec l’ARNtracr ; procurez-vous un réactif de tracrRNA et suivez les étapes de la section 3.
    2. Concevez des séquences d’ARNg ciblées sur mesure.
      REMARQUE : La conception de séquences d’ARNg ciblées personnalisées n’entre pas dans le cadre de ce protocole, mais peut être réalisée à l’aide d’outils accessibles au public tels que CRISPick (Table of Materials).
  2. Tampons, supports et équipements
    REMARQUE : Sauf indication contraire, utilisez des tampons et des réactifs froids (4 °C).
    1. Préparez le tampon MACS, le tampon FACS, le tampon Triton X-100 à 0,5 %, le tampon de perméabilisation 1x, le support RPMI complet et le support IMDM (Table of Materials) complet avant de commencer la procédure et stockez-les à 4 °C.
    2. Procurez-vous des kits d’isolement de cellules T CD4 naïves et de microbilles anti-FITC (Table des matériaux) avant de commencer cette procédure.
    3. Avant de commencer la nucléofection (section 4), préchauffer (37 °C) 5 mL de milieu IMDM complet et préparer un minimum de 10 mL d’IMDM complet complété par de l’IL-7 à 5 ng/μL réchauffé à 37 °C (Table des matériaux). Ajustez le volume du milieu préchauffé au besoin pour tenir compte de l’ajout de 125 μL par échantillon après nucléofection. Ajuster le volume de l’IMDM complet contenant de l’IL-7 au besoin, en fonction du nombre de cellules nucléofectées (section 4).
    4. Avant de commencer l’isolement des cellules présentatrices d’antigène (CPA), préparez le réactif de mitomycine C en ajoutant 4 mL deH2O stérile dans la fiole de 2 mg de mitomycine C (concentration de base de 0,5 mg/mL).
      REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans une hotte de culture tissulaire et utilisez des techniques d’asepsie stérile.

2. Isolement des lymphocytes T CD4 naïfs

REMARQUE : Les lymphocytes T CD4 naïfs peuvent être isolés par isolement magnétique ou par tri cellulaire. La pureté obtenue à partir de l’isolement magnétique est généralement de 97 % et la viabilité cellulaire est très élevée, tandis que le tri électronique peut améliorer la pureté des cellules au détriment de la viabilité cellulaire. Le protocole décrit ici utilisera l’isolation magnétique, mais peut être adapté à l’un ou l’autre scénario. Assurez-vous que les colonnes LS sont préparées correctement (Table des matériaux).

  1. Isolez la rate et les ganglions lymphatiques (inguinal, brachial, axial et cervical) des souris (souris WT C57BL/6J utilisées ici).
  2. Placez un tamis de 70 μm dans une boîte de 60 mm avec 5 mL de RPMI (Table des matériaux) complet pour chaque tissu traité. Traitez les ganglions lymphatiques et la rate dans différentes boîtes pour augmenter le rendement. Broyez doucement les mouchoirs à travers le filtre à l’aide d’un piston d’une seringue de 3 ml. Rincez le filtre avec 1 à 3 ml de média et transférez les suspensions unicellulaires dans des tubes coniques de 15 ml.
  3. Répétez l’étape 2.2 pour d’autres ganglions lymphatiques et tissus spléniques, au besoin.
  4. Centrifuger les suspensions unicellulaires à 500 × g pendant 5 min à 4 °C.
  5. Préparez-vous à compter les cellules comme suit.
    1. Pour les échantillons spléniques, aspirez le surnageant, remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon de lyse ACK, incubez pendant 2 à 5 min à RT, puis ajoutez 2 mL de RPMI complet, tournez vers le bas, remettez en suspension dans 5 mL de RPMI complet et comptez les cellules.
    2. Pour les cellules des ganglions lymphatiques, aspirez le surnageant, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de RPMI complet frais et comptez les cellules.
  6. Pour les saisir dans le kit d’isolement des CD4 naïfs, mélangez les splénocytes avec les cellules des ganglions lymphatiques pour atteindre le nombre de cellules souhaité pour l’isolement.
    REMARQUE : En règle générale, 1 × 108 cellules ganglionnaires et de rate de souris WT-B6 produisent 2 à 8 × 106 cellules T CD4 naïves.
  7. Centrifuger les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le volume approprié de tampon MACS (Table des matériaux) comme indiqué dans le protocole du fabricant (kit d’isolement des cellules T CD4 naïve).
  8. Suivre précisément le protocole du fabricant pour isoler les lymphocytes T CD4 naïfs par sélection négative (Table des matériaux) à l’aide du cocktail d’anticorps à la biotine des lymphocytes T CD4+ naïfs, des microbilles anti-biotine et des microbilles CD44 ; utilisez des colonnes LS pour cette isolation et collectez les cellules dans des tubes coniques de 15 ml.
  9. Après l’isolement, centrifuger les cellules à 500 × g pendant 5 min, 4 °C, retirer le surnageant, remettre la pastille de cellule en suspension dans 2 mL de milieu RPMI complet et compter les cellules.
  10. Stockez les cellules à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à commencer la nucléofection.

3. Formation du complexe Cas9-gRNA

REMARQUE : Préparez des stocks d’ARNcr de contrôle négatif et spécifiques au gène. Nous décrivons l’utilisation d’un ARNc unique pour les conditions de contrôle négatif et de trois ARNcr uniques pour les conditions de ciblage génique. L’utilisation simultanée de trois ARNc distincts permet d’assurer la KO des gènes d’intérêt.

  1. Remettre en suspension les ARNc et les ARNtracr à des concentrations de stock de 100 μM à l’aide d’un tampon duplex (Table des matériaux). Cela équivaut à 10 μL de tampon pour 1 nmol d’ARN.
  2. Combinez des ARNc individuels avec des ARNrc à un rapport de 1:1 dans des tubes PCR stériles et mélangez par pipetage. Chauffer à 95 °C pendant 5 min dans un thermocycleur. Ensuite, laissez les complexes refroidir à RT sur une paillasse pendant au moins 10 min.
    REMARQUE : Les duplex d’ARNcr/ARNtracr sont appelés ARNg à partir de ce moment. Les complexes sont stables pendant au moins 6 mois s’ils sont conservés à -20 °C. Nous produisons généralement 6 μL d’ARNg (3 μL d’ARNcr + 3 μL d’ARNcr) par cycle, ce qui fournit suffisamment de matériel pour environ cinq échantillons (1 μL/échantillon).
  3. Pour les ARNg ciblant des gènes : Dans des tubes PCR stériles, ajoutez 3 μL d’ARNg (1 μL de chacun des trois ARNg uniques par cible), 1 μL de protéine Cas9 et 1 μL de tampon duplex (5 μL au total par échantillon). Pipetez doucement pour mélanger et assurez-vous que tout le matériau se trouve au fond du tube. Incuber à RT pendant 10 min. Synchronisez le timing de cette étape avec la nucléofection (étapes 4.1-4.2).
  4. Pour l’ARNg de contrôle négatif : Dans des tubes PCR stériles, ajoutez 1 μL d’ARNg, 1 μL de protéine Cas9 et 3 μL de tampon duplex (5 μL au total par échantillon). Pipetez doucement pour mélanger et assurez-vous que tout le matériau se trouve au fond du tube. Incuber à RT pendant 10 min. Encore une fois, synchronisez le timing de cette étape avec la nucléofection (étapes 4.1-4.2).
    REMARQUE : L’utilisation de 50 pmol d’ARNg pour le contrôle négatif (contre 3 x 50 pmol pour le test) est plus rentable et n’a aucun impact sur les résultats.

4. Nucléofection - Ablation génique médiée par Cas9-gRNA

  1. Centrifuger 1-8 × 10 6 lymphocytesT purifiés à 500 × g pendant 5 min, 4 °C par échantillon de nucléofection. Retirez soigneusement autant de surnageant que possible.
  2. Remettre les cellules en suspension dans 20 μL de tampon P3 (16,4 μL de P3 + 3,6 μL de supplément par échantillon ; Nucleofector Kit, Table of Materials) et transfère la suspension dans des tubes PCR contenant les complexes Cas9-gRNA. Mélanger et transférer vers des puits indépendants d’une nucléocuvette de 16 puits (Nucleofector Kit, Table of Materials). Assurez-vous qu’aucune bulle ne s’est formée lors du transfert des cellules vers la cuvette, car cela peut avoir un impact négatif sur l’efficacité de la nucléofection. Tapotez la cuvette contre une surface de travail pour vous assurer que tout le matériau est au fond de chaque puits et exempt de bulles.
  3. Effectuez la nucléofection à l’aide du programme DN100 du nucleofector référencé (Table of Materials). Ajouter immédiatement 125 μL de milieu IMDM complet préchauffé dans les puits de nucléocuvette et transférer les cellules dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Rincer chaque puits une fois de plus avec 125 μL de milieu préchauffé pour assurer la collecte de toutes les cellules.
  4. Centrifuger les cellules à 500 × g pendant 5 min, 4 °C, retirer tous les fluides et remettre en suspension dans 200 μL de milieu IMDM complet chauffé + 5 ng/mL d’IL-7 (Table des matériaux).
  5. Transvaser 200 μL des cellules dans la plaque de culture et ajouter un milieu IMDM complet chauffé + 5 ng/mL d’IL-7 pour obtenir le volume final souhaité en fonction de la taille de la plaque comme suit : 1-2 × 106 cellules par puits sur une plaque de 48 puits (1 mL de milieu par puits), 2-4 × 106 cellules par puits sur une plaque de 24 puits (1,5 mL de milieu par puits), 4 à 6 × 10à 6 cellules par puits sur une plaque à 12 puits (2 ml de milieu par puits), et 6 à 10 × 10 à6 cellules par puits sur une plaque à 6 puits (4 ml de milieu par puits). Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 3 jours.
    REMARQUE : En fonction du renouvellement de la protéine et du dosage en aval, optimisez cette période de culture. Nous avons trouvé une période de repos optimale de 3 jours, mais celle-ci peut être ajustée en fonction du gène cible entre 1 et 7 jours dans ces conditions.
  6. Après la culture dans un milieu IMDM complet + 5 ng/mL d’IL-7, remettre les cellules en suspension par pipetage et les récolter dans des tubes coniques de 15 mL. Centrifuger les cellules à 500 × g pendant 5 min, 4 °C, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de média RPMI complet.
  7. Comptez les cellules pour déterminer le nombre de lymphocytes T CD4 naïfs vivants correspondant aux cellules nucléofectées à ARNg d’intérêt.
    REMARQUE : Dans le processus de nucléification, attendez-vous à perdre ~ 50 % des cellules d’entrée au cours de ce protocole et ajustez le nombre de cellules T CD4 naïves utilisées en conséquence. De plus, à ce stade, vous pouvez tester l’efficacité du ciblage génique dans les lymphocytes T CD4 naïfs à l’aide de diverses techniques (cytométrie en flux, western blot, qPCR ou test T7EI).

5. Isolement des cellules présentatrices d’antigène (APC)

REMARQUE : Assurez-vous que le réactif de mitomycine a été préparé, qui sera utilisé pour traiter les APC après l’isolement (tableau des matériaux). Lisez le protocole anti-microbilles FITC du fabricant avant de commencer et assurez-vous que les colonnes LS sont préparées correctement (Table des matériaux).

  1. Isoler la rate des souris WT désignées pour l’isolement APC.
  2. Fabriquer des suspensions unicellulaires comme décrit ci-dessus (2.2, 2.5.1)-lyser les érythrocytes avec un tampon de lyse ACK, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de RPMI complet (4 °C) et compter les cellules.
    REMARQUE : Après l’isolement de l’APC, attendez-vous à obtenir environ la moitié du nombre de cellules d’entrée, par exemple, 1 × 108 splénocytes d’entrée donnera ~40-50 × 106 APC. Préparez le nombre souhaité de splénocytes pour l’isolement.
  3. Centrifuger les cellules à 500 × g pendant 5 min, 4 °C, et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 800 μL de tampon MACS (Table des matériaux).
  4. Ajouter 4 μL d’anticorps anti-CD4 et d’anticorps anti-CD8 conjugués à la FITC (Table des matières) dans les splénocytes. Bien mélanger et incuber à 4 °C pendant 15 min.
  5. Centrifuger les cellules à 500 × g pendant 5 min, 4 °C et éliminer le surnageant. En suivant les instructions du fabricant, remettez les cellules en suspension dans le volume recommandé de tampon MACS et ajoutez la quantité appropriée de microbilles anti-FITC (Table des matériaux).
  6. Incuber les cellules à 4 °C pendant 15 min. Centrifuger les cellules à 500 × g pendant 5 min, 4 °C. Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de tampon MACS et faire passer les cellules dans la colonne LS préparée comme décrit dans le protocole du fabricant, en recueillant les cellules dans un tube conique de 15 mL.
  7. Centrifuger les cellules à 600 × g pendant 5 min, 4 °C, retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 2,7 mL de PBS stérile.
    REMARQUE : Les APC peuvent mal granuler ; utiliser une vitesse accrue pour la centrifugation.
  8. Ajouter 300 μL de solution de mitomycine C dans les cellules pour obtenir une concentration finale de 50 μg/mL. Bien mélanger et incuber à 37 °C au bain-marie pendant 30 min ou pendant 45 min à 37 °C, 5 % de CO2 dans un incubateur.
  9. Après l’incubation, centrifuger les cellules à 600 × g pendant 5 min, 4 °C, et les laver avec 10 mL de PBS stérile. Utilisez le vide pour éliminer autant de surnageant que possible. Répétez le lavage 2 fois.
  10. Centrifuger à nouveau les cellules à 600 × g pendant 5 min, 4 °C, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de milieu RPMI complet (4 °C). Comptez les cellules. Stockez les APC à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à effectuer la différenciation des lymphocytes T CD4.

6. Différenciation des lymphocytes T CD4

REMARQUE : Ce protocole est configuré pour cultiver des cellules dans un format de plaque à 48 puits -2 × 105 CD4 naïf + 1 × 106 APC par puits-un rapport de 1:5. Les cellules sont cultivées dans un milieu IMDM complet. Ici, nous fournirons les conditions de différenciation des lymphocytes T Th1, Th2, Th17 et Treg CD4 ; Cependant, des conditions de lignage individuelles peuvent être choisies en fonction de l’objectif de l’utilisateur.

  1. Déterminez le nombre de cellules d’une plaque à 48 puits à utiliser et calculez le nombre de cellules nécessaires pour chaque type de cellule.
    REMARQUE : Par exemple, 10 puits nécessiteraient 2 ×10 6 CD4 naïfs et 10 × 106 APC pour maintenir le rapport de 1:5. Si le nombre de cellules le permet, calculez suffisamment de cellules pour un puits supplémentaire afin de tenir compte de toute erreur de pipetage lors du placage.
  2. Mélanger le nombre désiré de CD4 naïfs et d’APC à 1:5, centrifuger les cellules à 600 × g pendant 5 min, 4 °C, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de milieu IMDM complet par puits (par exemple, cellules correspondant à 10 puits dans 5 mL de milieu).
  3. Placez des incréments de 500 μL de cellules dans les puits d’une plaque de 48 puits, en veillant à ce que chaque puits contienne 2 × 10 5 CD4 naïfs + 1 × 106 APC.
  4. Pour les conditions souhaitées de différenciation des lymphocytes T CD4, préparer 2 mélanges cytokines + anticorps dans l’IMDM complet, comme décrit dans le tableau 1. Ajoutez 500 μL du mélange 2x aux incréments de 500 μL précédemment conditionnés des cellules pour obtenir les concentrations finales de réactifs 1x.
    REMARQUE : Ces exemples sont basés sur la fabrication de 2,5 ml de préparations 2x, assez pour cinq puits pour chaque condition. Encore une fois, si les quantités de réactifs le permettent, faites un incrément supplémentaire de 2x mélange pour tenir compte de l’erreur de pipetage.
  5. Ajouter 500 μL de milieux cytokines + anticorps 2x à 500 μL de puits contenant des cellules CD4/APC pour obtenir une concentration finale de réactifs à 1x.
  6. Placez la plaque à 48 puits dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2. Cultivez les cellules pendant 72 h pour permettre la polarisation des CD4.
    REMARQUE : Examinez la plaque après la période de culture pour assurer une croissance robuste. Le milieu doit être de couleur orange après l’incubation, le milieu jaune indiquant une prolifération cellulaire potentielle.

7. Évaluation de l’impact de l’ablation génique dans la différenciation des lymphocytes T CD4

REMARQUE : Pour toutes les étapes de coloration, préparez un mélange principal d’anticorps ajoutés à la dilution appropriée au tampon de coloration requis. Un volume de 50 μL du cocktail d’anticorps/tampon est utilisé par échantillon. Ajustez les anticorps spécifiques utilisés en fonction de l’expérience. Les utilisateurs doivent choisir des panels d’anticorps pertinents pour leurs expériences spécifiques ; Nous fournissons ici un modèle avec lequel aborder cela dans le contexte des gènes ciblés ici.

  1. Après la différenciation des CD4, prélever soigneusement 600 μL du surnageant, puis remettre en suspension les cellules dans chaque puits par pipetage.
  2. Retirez 200 μL de cellules de chaque puits et ajoutez-les à une plaque de 96 puits marquée pour la coloration du facteur de transcription. Granulez les échantillons en les faisant tourner à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, retirez le surnageant et procédez à la coloration de surface (étape 7.5).
  3. Pour l’analyse des cytokines, restimulez les 200 μL restants de cellules avec le PMA (50 ng/mL), l’ionomycine (500 ng/mL) et le Golgi Stop (dilution 1/2 000) dans l’IMDM complet. Ajouter 200 μL du mélange de restimulation 2x dans chaque puits et incuber à 37 °C, 5 % CO2 pendant 4 h.
    REMARQUE : Il doit rester 200 μL dans la plaque à 48 puits ; par conséquent, l’ajout de 200 μL du mélange 2x de PMA (2x, 100 ng/mL), d’ionomycine (2x, 1 μg/mL) et de Golgi Stop (2x, 1/1 000) créera une concentration finale de 1x (Tableau des matériaux).
  4. Entre-temps, commencez la coloration du facteur de transcription. Effectuer la coloration de l’antigène de surface en remettant les cellules en suspension dans 50 μL de tampon FACS contenant les anticorps conjugués au fluorochrome souhaités par échantillon (tableau 2). Incuber dans l’obscurité à 4 °C pendant 30 min.
  5. Ajoutez 150 μL de tampon FACS dans chaque puits pour éliminer le tampon de coloration. Centrifuger la plaque à 500 × g pendant 5 min à 4 °C. Éloignez le surnageant. Répétez l’opération pour un total de deux lavages.
  6. Fixez les cellules avec 100 μL de solution de fixation Foxp3 (Table des matériaux) dans l’obscurité à RT pendant 25 min.
  7. Après 25 min, ajoutez 100 μL de tampon FACS dans chaque puits pour laver le fixateur. Centrifugez la plaque à 500 × g pendant 5 min à 4 °C et retirez le surnageant. Répétez l’opération pour un total de deux lavages.
  8. Effectuer une coloration intracellulaire en remettant les cellules en suspension dans 50 μL de tampon de perméabilisation 1x Foxp3 contenant des anticorps spécifiques du facteur de transcription directement conjugués par échantillon (Tableau 2) pendant au moins 1 h à 4 °C dans l’obscurité.
  9. Une fois la coloration intracellulaire terminée, ajoutez 100 μL de tampon FACS dans chaque puits. Centrifugez la plaque à 500 × g pendant 5 min à 4 °C et retirez le surnageant. Répétez l’opération pour un total de deux lavages. Remettre les cellules en suspension dans un volume final de 200 mL pour la cytométrie en flux.
  10. Après la restimulation PMA/ionomycine/Golgi Stop, remettre les cellules en suspension par pipetage et transférer 400 μL de chaque échantillon de cytokines dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Granulez les échantillons à 500 × g pendant 5 min à 4 °C et retirez le surnageant. Remettre en suspension les échantillons de cellules dans 100 μL de tampon FACS et les transférer sur une plaque à 96 puits pour la coloration de surface. Granulez à nouveau les échantillons en les faisant tourner à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, puis retirez le surnageant.
  11. Préparez un cocktail de coloration de surface avec un tampon FACS contenant des anticorps fluorescents dirigés contre les antigènes de surface (tableau 2). Remettre les cellules en suspension dans 50 μL de tampon de coloration par échantillon et incuber pendant 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
  12. Ajoutez 150 μL de tampon FACS dans chaque puits pour éliminer le tampon de coloration. Centrifuger la plaque à 500 × g pendant 5 min à 4 °C. Éloignez le surnageant. Répétez l’opération pour un total de deux lavages.
  13. Fixez les cellules dans 100 μL de PFA (Table des Matériaux) à 4 % dans l’obscurité à RT pendant 25 min.
  14. Ajoutez 100 μL de tampon FACS dans chaque puits pour éliminer le fixateur. Centrifuger la plaque à 500 × g pendant 5 min à 4 °C. Éloignez le surnageant. Répétez l’opération pour un total de deux lavages.
  15. Effectuer la coloration intracellulaire des cytokines en remettant les cellules en suspension dans 50 μL d’anticorps anti-cytokines contenant 0,5 % de tampon de coloration Triton X-100 par échantillon (tableau 2) pendant au moins 1 h à 4 °C dans l’obscurité.
  16. Une fois la coloration intracellulaire terminée, ajoutez 100 μL de tampon FACS dans chaque puits. Centrifugez la plaque à 500 × g pendant 5 min à 4 °C et retirez le surnageant. Répétez l’opération pour un total de deux lavages. Remettre les cellules en suspension dans un volume final de 200 mL pour la cytométrie en flux.
  17. Analysez le facteur de transcription et les échantillons colorés aux cytokines par cytométrie en flux.
    REMARQUE : Les profils de cytométrie en flux attendus à partir des panneaux de coloration décrits seront présentés dans la section des résultats représentatifs.

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Résultats

Pour valider qu’une population pure de lymphocytes T CD4 naïfs a été obtenue à l’aide de notre protocole (Section 2), nous avons utilisé la cytométrie en flux pour identifier ces cellules avant et après l’isolement magnétique. En utilisant notre approche, nous avons obtenu une population très pure de lymphocytes T CD4 naïfs CD4+TCRb+CD25-CD44-CD62L+ après isolement (Figure 3A). De plus, pour confirmer que les complexes d...

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Discussion

L’intégration de protocoles permettant d’administrer des complexes CRISPR-Cas9 dans des lymphocytes T CD4 naïfs avec des méthodes d’étude de la différenciation des lymphocytes T CD4 fournit un outil robuste pour explorer de nouveaux gènes qui régulent la biologie des lymphocytes T CD4. Ici, nous fournissons un guide complet pour l’utilisation des réactifs Cas9 et gRNA disponibles dans le commerce qui sont simples à utiliser. L’administration par nucléofection de complexes Cas9-gRNA dans ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par le programme de recherche intra-muros du NIAID, NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 M EDTA, pH = 8,0IPM Scientific11005-016
16 % Paraformaldéhyde, PFAMicroscopie électronique Sciences15710Diluer avec du PBS pour obtenir une solution fixatrice de PFA à 4 %
1x Tampon eBioscience (1x tampon de perméabilisation)Thermo Fisher Scientific00-5523-00Utiliser le tampon de perméabilisation du kit pour faire 1x solution 1x
PBS, pH = 7,4Qualité Biologique114-058-101
2-mercaptoéthanol (1000x)Gibco21985-023
4D Nucleofector Core UnitLonzaAAF-1003B
4D Nucleofector X UnitLonzaAAF-1003X
60 mmFalcon353002
70 µ ; Filtre en maille de nylonFisherbrand22363548
ACK Tampon de lysingGibcoA10492-01
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X KitLonzaV4XP-3032Ce kit comprend : P3 Primary Cell Solution, Supplement 1 et 16-well Nucleocuvette strips
Anti-FITC MicrobillesMiltenyi Biotec130-048-701Suivre le protocole Miltenyi Anti-FITC Microbeads
anti-souris CD28 (37.51)bioXcellBE0015-1voir le tableau 1 pour la concentration de stock
anti-souris CD3e (145-2C11)bioXcellBE0001-1voir le tableau 1 pour la concentration de stock
anti-souris IFN&gamma ; (XMG1.2)bioXcellBE0055voir le tableau 1 pour la concentration de stock
anti-souris IL-12p40 (C17.8)bioXcellBE0051voir le tableau 1 pour la concentration de stock
anti-souris IL-4 (11B11)bioXcellBE0045voir le tableau 1 pour la concentration de stock
BioLite 48-well MutlidishThermo Fisher Scientific130187
Albumine sérique bovine, BSASigma Life ScienceA3059
Cas9 enzymeIDT1081059Alt-R S.p. Cas9 Nucléase V3 (10 mg/mL) - contient une séquence de localisation nucléaire
MilieuIMDM complet avec 5 ng/mL IL-7
MédiaIMDM complet IMDM+GlutMAX, 10 % FBS, 1 % L-glutamine, 1 % Pen/Strep, 0,1 % BME
Médiacomplet RPMIRPMI-1640, 10 % FBS, 1 % L-glutamine, 1 % Pen/Strep, 0,1 %
BME CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
ARNcr souhaités  ;IDTUtilisé préconçu à partir du site Web d’IDT : https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN   ;
eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer SetThermo Fisher Scientific00-5523-00Le kit contient trois réactifs : Concentré de fixation/perméabilisation (4x), Diluant de fixation/perméabilisation et Tampon de perméabilisation (10x)
Tampon1x PBS, 1 % FBS, 1 mM EDTA
Sérum fœtal bovin (FBS)VWR Seradigm Life Science97068-085Inactivation de la chaleur avant utilisation (chaud à 56 ° ; C pendant 45 minutes)
FITC anti-souris CD4 (RM4-5)Biolegend100510dilution 1/200 (concentration de 0,5 mg/mL)
FITC anti-souris CD8&alpha ; (53-6.7)Biolegend100706dilution 1/200 (concentration de stock de 0,5 mg/mL)
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZdilution 1/2000
IMDM (1x) + GlutMAX-1 MediaGibco31980-030
Sel de calcium d’ionomycine de Streptomyces conglobatus (1 mg/mL)Sigma Aldrich10634Concentration finale recommandée de 500 ng/mL
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
LS colonnesMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Tampon1x PBS, 0,5 % BSA, 1 mM EDTA, filtre stérilisé
Mitomycine C (0,5 mg/mL)Millipore SigmaM4287-2MG  ;
Naï de souris ; ve CD4 Kit d’isolement des lymphocytes TMiltenyi Biotec130-104-453Follow Miltenyi Naï ; protocole d’isolement des lymphocytes T CD4. Ce kit comprend Naï ; ve CD4+ T Cell Biotine Cocktail d’anticorps anti-biotine, microbilles anti-biotine et microbilles CD44
Contrôle négatif crRNAIDT1072544alternative à la conception de son propre contrôle négatif
Nucléase Free Duplex BufferIDT1072570
bandelettes de tubes PCRUSA Scientific1402-2700
Pénicilline StreptomycineGibco15140-023
Phorbol 12-myristate 13-acétate, PMA (100 µ ; g/mL)Sigma AldrichP8139Concentration finale recommandée de 50 ng/mL
Tubes à centrifuger haute performance ProSeries 15 ml AlkaliScientificPS5600Tubes coniques de 15 mL
recombinants humains (h) IL-2Peprotech200-02voir tableau 1 pour la concentration de stock
TGF-b1 humain recombinant (dérivé de HEK293)Peprotech100-21voir tableau 1 pour le stock concentration
mère recombinante IL-12p70Peprotech210-12voir le tableau 1 pour la concentration mère
recombinante IL-4Peprotech214-14voir tableau 1 pour la concentration mère
mère recombinante IL-6Peprotech216-16voir tableau 1 pour la concentration mère
recombinante IL-7Peprotech217-17Préparer à 100 ng/mL
RPMI 1640 MédiaGibco21870-076
ThermocycleurApplied Biosystems4375786Nous utilisons ce modèle de thermocycleur, cependant tout équipement similaire fonctionnera bien dans ce protocole
tracrRNA Atto550 marqué  ;IDT1075928Permet de détecter les complexes Cas9-gRNA après nucéfection en utilisant la fluorescence Atto550 comme lecture. Nous recommandons ce réactif si possible.  ;
Triton-X1x PBS, 0,5 % TritonX-100, 0,1 % BSA
TritonX-100BioRad161-0407
non marqué tracrRNA  ;IDT1072534Une option de tracrRNA plus rentable, mais ne permet pas d’évaluer l’efficacité de la nucelofection des complexes Cas9-gRNA
Veriti Thermal Cycler, 96-well FastThermo Fisher Scientific4375305Nous utilisons ce modèle de thermocycleur, cependant tout équipement similaire fonctionnera bien dans ce protocole
IMDM complet + IL-7 FACS mère mère Tampon

Références

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Ablation g nique par CRISPR Cas9activation des lymphocytes Tisolement des lymphocytes T na fsd livrance par nucl ofectionsouris knockoutpolarisation in vitroTh1 Th2 Th17 Tregtudes de transfert adoptif
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