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Article de méthode

Imagerie en direct étendue des niches de cellules souches germinales de Drosophila melanogaster femelle

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DOI :

10.3791/67389

⸱

20 décembre 2024

 ,  , 
1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC/Universidad Pablo de Olavide/JA, 2Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

Dans cet article

Résumé

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer une imagerie en direct de la division asymétrique des cellules souches germinales (GSC) dans la niche ovarienne de la drosophile. Nous utilisons une lignée transgénique qui exprime de manière ubiquitaire une fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) de la protéine du spectrosome Par-1.

Résumé

Les méthodes d’imagerie en direct permettent d’analyser les processus cellulaires dynamiques en détail et en temps réel. L’ovaire de la drosophile représente un excellent modèle pour explorer la dynamique d’une myriade de processus de développement, tels que la division cellulaire, la souche, la différenciation, la migration, l’apoptose, l’autophagie, l’adhésion cellulaire, etc., au fil du temps. Récemment, nous avons mis en œuvre une culture ex vivo étendue et une imagerie en direct de la niche GSC de la drosophile femelle. En utilisant une lignée de drosophile hébergeant un transgène GFP ::P ar-1 à titre d'exemple, cette méthode permet de visualiser la division asymétrique des GSC au sein de leur niche et de décrire les changements de morphologie du spectrosome tout au long du cycle cellulaire. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la culture ex vivo de Drosophila germaria, permettant une visualisation prolongée de la niche femelle de la GSC. Il est important de noter que ce protocole est largement applicable aux GSC d’imagerie en direct avec plusieurs protéines d’intérêt marquées par fluorescence qui sont disponibles dans les centres de stockage et/ou dans la communauté de recherche sur la drosophile.

Introduction

L’imagerie en direct des processus biologiques est essentielle pour obtenir des preuves expérimentales directes. La combinaison de la microscopie confocale avancée et de l’optimisation des méthodologies permet d’explorer de multiples événements biologiques avec une grande précision. L’optimisation des étapes dans les protocoles tels que la manipulation et la dissection des tissus, la préparation et la conservation des échantillons, et les paramètres d’acquisition de la microscopie est essentielle pour maximiser la fiabilité et la robustesse des résultats obtenus. Ici, nous présentons un protocole de suivi d’échantillons pour une imagerie étendue, qui est spécialement axé sur les ovaires de Drosophila melanogaster. L’ovaire de Drosophila melanogaster est un excellent système modèle pour l’analyse d’un large éventail de processus de développement. Parmi beaucoup d’autres, cet organe reproducteur de la mouche des fruits Drosophila melanogaster contient une niche de cellules souches adultes très bien définie. Cette niche GSC soutient le développement des gamètes femelles à l’âge adulte. Les ovaires de la drosophile sont composés d’environ 18 ovaires, où se développent les chambres des ovules dans le germarium. À l’extrémité de chaque germarium, 2 à 4 GSC sont maintenues dans une niche cellulaire somatique principalement formée d’un filament terminal de 8 à 10 cellules, d’une rosette de 5 à 8 cellules de coiffe et de 2 à 3 cellules d’escorte antérieures (Figure 1A). Cette niche somatique fournit aux GSCs des signaux essentiels et un soutien physique pour maintenir leur souche, contrôler la prolifération et prévenir la différenciation1,2,3,4,5.

Les GSCs se divisent normalement de manière asymétrique pour générer une nouvelle cellule souche qui reste en contact avec la niche somatique et une cellule fille, le cystoblaste (CB), qui perd le contact direct avec les cellules de la coiffe somatique et se différencie. Les CSG et les CB contiennent un organite cytoplasmique hautement dynamique, le spectrosome, dont la fonction principale est l’orientation correcte du fuseau mitotique pendant la mitose6. Le CB se divise 4 fois avec une cytokinèse incomplète pour développer des kystes à 16 cellules, où l’une des cellules germinales se spécifie dans l’ovocyte et les 15 autres cellules deviennent des cellules nourricières. Le spectrosome CB se développe en une structure ramifiée appelée fusome qui relie les cellules germinales interconnectées à 16 cellules. Le spectrosome est enrichi en petites vésicules et en protéines squelettiques telles que la sérine-thréonine kinase Par-1 et le composant membranaire Hu-li tai shao (Hts)7. Au cours du cycle cellulaire de la GSC, le spectrosome se développe par l’ajout de nouveau matériau et change de forme, ce qui permet d’identifier les phases G1, S, G2 et M (Figure 1B)8,9.

Nous avons récemment mis en œuvre une méthode de culture ex vivo du germarium de drosophile qui permet d’imager des GSC vivantes jusqu’à 16 h. Étant donné que ces cellules se divisent une fois toutes les 15,5 h en moyenne8, cette méthode permet de filmer de grandes parties du cycle cellulaire de la GSC. Ainsi, en combinaison avec d’autres outils, notre méthode de culture a permis de décrire la morphologie des spectrosomes au cours du cycle cellulaire de la GSC et d’analyser la durée des différentes phases du cycle cellulaire in vivo8 (Figure 1C). Nous fournissons ici un protocole détaillé de cette méthode d’imagerie en direct étendue, soutenu par une vidéo guidée étape par étape qui décrit la méthodologie (Figure 2).

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Protocole

REMARQUE : L’étape 1.4 doit être effectuée au moins 2 jours à l’avance. Les étapes 2.1 et 2.2 peuvent être effectuées 1 jour à l’avance.

1. Configuration pré-expérimentale I

  1. Préparez 100 μL d’aliquotes d’un mélange d’antibiotiques streptomycine/pénicilline (10 000 U/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine) et conservez-les à -20 °C jusqu’à l’utilisation.
  2. Préparez 15 ml des solutions suivantes à l’aide d’eau pure autoclave, conservez-les à 4 °C et utilisez-les dans un délai d’un mois : bicarbonate de sodium (NaHCO3) 0,1 M pH 8,0 et 0,1 % Tween 20.
  3. Préparez le milieu de culture et la solution suivants dans une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination. Utilisez des embouts et des tubes filtrants stérilisés.
    1. Préparer 2 mL d’aliquotes de sérum fœtal bovin non dilué et conserver à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé dans des conditions aseptiques.
    2. Préparez le milieu de drosophile de Schneider complété par un mélange d'antibiotiques 15 % FBS et 0,6 % d'antibiotiques streptomycine/pénicilline. Préparez 7 mL d’aliquotes et conservez-les à 4 °C. Une aliquote suffit pour deux plaques MatTek (voir section 2).
      1. Préparez la solution de Ringer (128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 4 mM de MgCl2, 35,5 mM de saccharose, 5 mM de Hepes dans de l'eau pure autoclavée ; pH de 6,9). Préparez 1 mL d’aliquotes et conservez-les à -20 °C jusqu’à utilisation.
  4. Prélever des mouches âgées de 1 à 2 jours exprimant de manière constitutive et ubiquitaire la protéine Par-1 fusionnée à la GFP (poly Ubiquitin-mGFP6 ::p ar-1 line) dans un nouveau tube avec de la nourriture pour mouches complétée par de la poudre de levure. Cultivez-les pendant 2 jours à 25 °C dans un incubateur avant la dissection.
    REMARQUE : Cette étape peut être effectuée avec n’importe quel rapporteur d’intérêt marqué par fluorescence.

2. Revêtement et préparation de la plaque de fond en verre

  1. Placez une goutte de 3 μL d’un adhésif Cell-Tak spécifique (ci-après appelé adhésif pour cellules et tissus) au centre de la lamelle d’une plaque revêtue de poly-D-lysine de 35 mm (plat à fond en verre, voir tableau des matériaux) sans étalement manuel. Utilisez des embouts stériles.
    REMARQUE : L’adhésif pour cellules et tissus doit être stocké à 4 °C. Dans le cas d’expériences avec deux conditions génétiques (généralement, des conditions de contrôle et des conditions mutantes), placez deux gouttes individuelles et bien séparées de l’adhésif dans la même plaque de fond en verre. Cela garantira que les deux fonds génétiques sont imagés dans les mêmes conditions.
  2. Immédiatement après, ajoutez soigneusement un volume égal (3 μL dans cette configuration de protocole) de 0,1 M NaHCO3 pH 8,0 dans la goutte d’adhésif de 3 μL recommandée par le fabricant et mélangez par pipetage.
  3. Pour une évaporation complète, incubez la plaque à température ambiante (RT) pendant 20 min puis conservez-la à 4 °C pendant une nuit pour l’utiliser le lendemain. Vous pouvez également incuber la plaque préparée à 37 °C pendant 25 minutes jusqu’à l’évaporation complète et passer directement à l’étape suivante. Dans les deux cas, entretenez la plaque avec son couvercle. Utilisez des embouts stériles.
  4. Laissez le plat à fond en verre préparé atteindre RT en le plaçant sur le banc pendant 15 à 20 minutes avant utilisation.
  5. Lavez soigneusement 3 fois l’assiette préparée. Évitez de toucher et de perturber la ou les couches adhésives. À chaque lavage, ajoutez 6 μL d’eau pure autoclavée puis retirez l’eau à l’aide d’un embout propre pour chacun des trois lavages afin d’éliminer les résidus de la solution NaHCO3.
  6. Permettez l’évaporation complète de l’eau en plaçant la plaque propre et préparée à RT tout en disséquant pendant 5 à 10 minutes avec son couvercle pour éviter les particules de poussière.

3. Dissection ovarienne de la drosophile et isolement et montage de l’ovariole

REMARQUE : La dissection de l'ovaire est réalisée dans la solution de Ringer (au lieu du milieu de Schneider) sans FBS pour éviter la présence de protéines qui pourraient interférer avec l'adhérence du tissu de l'échantillon à l'adhésif.

  1. Nettoyez une boîte de dissection à trois puits, une pince et des aiguilles de dissection avec de l’éthanol à 70 % avant de commencer.
  2. Ajouter un volume suffisant (~200 μL) de solution de Ringer dans chacun des trois puits.
  3. Disséquez les ovaires de 5 femelles nourries à la levure dans 200 μL de solution de Ringer dans le premier puits à l'aide de deux paires de pinces en suivant les procédures standard 10,11. Saisissez la femelle drosophile à l’intersection du thorax et de l’abdomen avec l’une des pinces. Ensuite, déchirez doucement la cuticule au niveau de la partie postérieure de l’abdomen et tirez sur la cuticule de l’abdomen jusqu’à ce que les deux ovaires soient exposés.
  4. Transférez les ovaires disséqués dans le deuxième puits pour réduire la contamination par des restes d’autres tissus ou des débris résultant de la dissection.
  5. Retirez la gaine musculaire de 15 à 20 ovarioles à l’aide d’un stéréomicroscope (zoom 8X-13,5X) avec éclairage à diodes électroluminescentes (LED) et pinces à pointe fine. Utilisez une paire de pinces pour ancrer tout le corps de l’ovaire, et utilisez la seconde pour saisir en douceur une chambre d’ovule à un stade avancé et étirer doucement jusqu’à ce que le muscle se brise et soit à la traîne.
    REMARQUE : Il est essentiel d’éviter d’endommager la germaria simplement en réduisant le contact avec cette partie des ovaires. Retirez les chambres d’œufs plus anciennes que les stades 8-9.
  6. Transférez un par un les 15 à 20 ovarioles sans gaine musculaire à l'aide de la pince dans le troisième puits contenant 200 μL de milieu de Ringer.
  7. Pré-mouiller une pointe de 20-200 μL avec 0,1 % de Tween 20 par pipetage. Cela évite l'adhérence des ovarioles aux parois en plastique de la pointe.
  8. Transférez 6 μL de solution de Ringer contenant les ovarioles sans gaine musculaire à l'aide d'une pointe pré-humidifiée sur la plaque adhésive préparée (conservée à RT).
    REMARQUE : Évitez tout contact entre la pointe et la couche adhésive pour éviter le détachement de germaria après le dépôt de l’ovariole (étape suivante). Environ 30 % des germaria n’adhèrent pas comme prévu.
  9. Pour vous assurer que les ovarioles transférés adhèrent à la surface adhésive, enfoncez-les soigneusement jusqu'au fond de la goutte de Ringer jusqu'à ce qu'ils entrent en contact avec la surface adhésive à l'aide d'une aiguille de dissection ou d'une pince
    REMARQUE : N’essayez pas de réorganiser les ovarioles une fois qu’ils se sont installés.
  10. Remplissez soigneusement la plaque MatTek avec 3 ml de milieu Schneider's complété par le mélange d'antibiotiques 15 % FBS et 0,6 % de streptomycine/pénicilline (étape 1.3). Pour éviter le détachement des ovaires, ajouter lentement 1 mL à la fois sur le pourtour extérieur de la plaque.
  11. Transportez la plaque contenant les ovarioles sans gaine musculaire sur une surface plane jusqu’à la station de microscope.

4. Imagerie en direct à l’aide d’un microscope confocal

  1. Placez la plaque sur l’objectif 63x d’un microscope à disque rotatif ou d’un microscope confocal (un équipement similaire peut être utilisé) et focalisez l’échantillon. Sélectionnez le plan z du milieu pour chaque germarium.
  2. Configurez les paramètres expérimentaux suivants : type de capture : time-lapse 3D, réglage de la puissance laser de 70/100, longueur d’onde d’excitation : 488 nm, portée de l’empilement z : 30 μm et distance entre les piles Z : 1,2 μm, durée : 17 h, intervalle entre les points temporels : toutes les 10 min.
  3. Si disponible, à l’aide d’une option multi-positions, redéfinissez les coordonnées XY des échantillons et sélectionnez un plan Z au milieu de chaque germarium, car les piles Z seront centrées dans cette position. Lancez l’acquisition.
    REMARQUE : Comme la largeur normale d’un germarium est de 30 μm, chaque pile Z sera de ~25-27 sections. Selon le confocal, au moins 25 germaria peuvent être imagés dans les 10 minutes d’intervalle. Normalement, des objectifs à immersion dans l’huile 40x/1,30 ou 63x/1,40 NA, corrigés par planapo, sont utilisés.
  4. Analysez les images dans le temps et sur l’axe Z pour visualiser des changements spécifiques dans la morphologie du spectrosome à l’aide du logiciel Imaris ou ImageJ (Fiji) 12,13. Des moments spécifiques de leur observation sont affichés (Figure 1B'). Pour monter les vidéos, sélectionnez manuellement le meilleur plan Z à chaque point temporel.

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Résultats

Avec ce protocole prolongé d'imagerie en direct, nous pouvons enregistrer la mitose asymétrique des cellules souches germinales femelles (GSC) à l'intérieur de leur niche, sans perturbation biologique apparente. Pour ce faire, nous utilisons des germariums exprimant de manière ubiquitaire la protéine GFP::Par-1, qui permet de distinguer cinq morphologies distinctes du spectrosome au cours du cycle cellulaire des GSC : ronde, bouchon, barre, fusion et point d'exclamation (Figure 1B,C<...

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Discussion

Nous présentons ici un protocole pour surveiller la niche GSC de Drosophila melanogaster pendant une période prolongée, jusqu’à 16 h. La plupart des protocoles pour filmer les processus biologiques de la drosophile ex vivo se concentrent sur des fenêtres de temps plus courtes et de multiples exemples peuvent être trouvés pour les disques alaires imaginaux 15,16,17, les gonades embryonnaires

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous remercions Acaimo González Reyes et María Olmedo López pour leurs commentaires utiles sur le manuscrit. Cette étude a été soutenue par PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), « Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor » de Junta de Andalucía (J. G-M), « Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos » des VI et VII PPIT-Université de Séville (P. R-R) et « Contrato de Acceso de I+D+i » de VI PPIT-Université de Séville (P. R-R). Nous exprimons nos remerciements à la Company of Biologists Ltd pour avoir aimablement fourni les droits de partage d’images adaptées de la publication originale (doi :10.1242/DEV.199716).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque de verre à 9 puitsCorning  ;7220-85n/a
Chlorure de calcium dihydratéSigma AldrichC3881CaCl2· ; 2H2O ; Pour préparer la solution de Ringer
Cell-TakCorning  ;354240Adhésif pour cellules et tissus utilisé pour fixer des cellules ou des sections de tissus à de nombreux types de surfaces, y compris le plastique, le verre, le métal, le polymère FEP et les matériaux biologiques.
Dumont #5 Forceps  ;Finescience11252-20n/a
Dumont #55 Forceps  ;Finescience11255-20Dimensions 0,05 mm x 0,02 mm et longueur 11 cm
Sérum fœtal bovinGibco10500-064Qualifié, inactivé par la chaleur, approuvé par l’UE, Amérique du Sud Origine  ;
Plats à fond en verreMatTekP35GC-1.5-10-CPlat de 35 mm, lamelle n° 1.5, diamètre du verre de 10 mm,  ; Poly-D-Lysine enrobé
HEPESSigma AldrichH4034Pour préparer la solution de Ringer
Chlorure de magnésium  ;Sigma AldrichM1028MgCl2 ; Pour préparer la solution de Ringer
Porte-aiguilleRoboz  ;RS-6061Poignée creuse légère en acier inoxydable ; 4 3/4" de long.
Jumelles Nikon SMZ18Nikonhttps://www.microscope.
healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18
Pénicilline-streptomycineThermo Fisher Scientific1514012210 000 U/mL
Chlorure de potassiumSigma AldrichP3911KCl ; Pour préparer la solution de Ringer
la drosophile de Schneider MediumBiowest  ;L0207Milieu de culture cellulaire pour cellules d’insectes
Bicarbonate de sodiumSigma AldrichS8875  ;NaHCO3 ; &ge ; 99,5 %, poudre
Chlorure de sodiumSigma AldrichS9888NaCl ; Pour préparer la solution de Ringer
SucroseSigma AldrichS9378&ge ; 99,5 % (GC) ; Pour préparer la solution de Ringer
Aiguille de dissection en tungstèneRoboz  ;RS-60640,25 mm, ultra fin, pointe de 1 micron (Pk 10)
Tween 20Sigma AldrichP9416pour la biologie moléculaire, liquide visqueux
Poudre de levureSigma Aldrich51475n/a
,

Références

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