Malgré des efforts considérables pour traiter les plaies chroniques, le succès a été limité. Les processus cellulaires et moléculaires qui perturbent la cicatrisation normale et contribuent à l’initiation et au développement des plaies chroniques ne sont pas bien compris. Par conséquent, il s’est avéré difficile de mettre au point des traitements efficaces pour ces plaies. Cela est principalement dû au manque de modèles animaux qui imitent les plaies chroniques chez l’homme et parce que l’expérimentation chez l’homme avec des plaies chroniques est limitée. Auparavant, nous avons publié un modèle murin pour étudier les plaies chroniques qui partagent de nombreuses caractéristiques avec les plaies chroniques diabétiques chez l’homme. Ce modèle inclut la présence de biofilms formés naturellement à partir de bactéries présentes dans le microbiote cutané et l’environnement sans qu’il soit nécessaire d’introduire des bactéries externes dans les plaies. Par conséquent, ce modèle peut potentiellement faire progresser la compréhension fondamentale de la façon dont les plaies deviennent chroniques. Nous présentons ici une mise à jour du protocole original pour le développement de ce modèle de souris. Nous nous sommes concentrés sur la réduction de la mortalité des souris de ~30 % à ~5 %. Nous décrivons également comment ce modèle a été utilisé pour comprendre l’initiation et la progression de la chronicité des plaies en utilisant des approches transcriptomiques de nouvelle génération, en élucidant la dynamique des populations bactériennes pendant l’infection et le développement du biofilm, et en démontrant la valeur des tests d’efficacité des traitements, y compris les petites molécules. Jusqu’à présent, c’est le seul modèle de plaie chronique qui ne guérit pas sans intervention.
Article de méthode
Protocole pour la création de plaies chroniques chez les souris diabétiques - une mise à jour du protocole publié
Dans cet article
Résumé
Introduction
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Protocole
MISES À JOUR:
Il s’agit d’une mise à jour du protocole présenté précédemment1
Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux réglementations fédérales et la politique et procédures de l’Université de Californie ont été approuvées par l’IACUC de l’Université de Californie, Riverside.
1. Animaux
Ajouter le Nota suivant à l’étape 1.1 :
REMARQUE : Si des souris diabétiques homozygotes sont achetées directement auprès des fournisseurs, hébergez les souris dans un vivarium conventionnel pour permettre la colonisation de la peau avec une flore cutanée normale. Les mâles et les femelles peuvent être utilisés.
Ajouter la section suivante après l’étape 1.3 :
1.4.Effectuer le génotypage
REMARQUE : Effectuer le génotypage après l’élevage de l’animal comme décrit précédemment jusqu’à l’étape 1.31. Le protocole suivant a été modifié à partir d’une procédure publiée précédemment2. Les souris mâles et femelles peuvent être génotypées dès 14 à 21 jours au sevrage.
1.4.1. Extraction brute de l’ADN
1.4.1.1. Prélever une biopsie à l’aide d’un poinçon d’oreille sur la souris et placer l’échantillon de tissu dans un tube de microcentrifugation.
1.4.1.2. Ajouter 180 μL de NaOH de 50 mM, en veillant à ce que l’échantillon soit immergé.
1.4.1.3. Incuber l’échantillon à 95 °C pendant 10 min, en dépressurisant et en tourbillonnant le tube toutes les 5 min.
1.4.1.4. Refroidir l’échantillon sur de la glace pendant au moins 1 min.
1.4.1.5. Ajouter 20 μL de 1 M de Tris HCl à pH 8,0 et vortex.
1.4.1.6. Conserver les échantillons à -20 °C jusqu’à utilisation.
1.4.2. Réaction en chaîne par polymérase
1.4.2.1 Assembler le mélange d’amorces suivant dans un tube de microcentrifugation (tableau des amorces).
REMARQUE : Les amorces amplifient la région autour de la mutation ponctuelle de LepR.
1.4.2.2. Mettre en place 20 μL de réactions en chaîne par polymérase dans des tubes PCR. Ajouter 10 μL de mélange maître 2x Taq polymérase (qui contient de l’ADN polymérase Taq , des dNTPs, du MgCl2 et du KCI), 1 μL de mélange d’amorces (voir le tableau des amorces), 4 μL d’extrait d’ADN brut et 5 μL de H2O.
1.4.2.3. Régler les paramètres de thermocyclage comme suit : 94 °C pendant 2 min ; 40 cycles de 97 °C pendant 30 s, 52 °C pendant 45 s et 72 °C pendant 45 s ; suivi de 72 °C pendant 2 min et de 10 °C pour une tenue infinie.
1.4.2.4. Une fois la PCR terminée, ajouter 4 μL de colorant de charge d’ADN 6x aux produits de PCR et séparer sur un gel d’agarose à 2 % (figure 1).
REMARQUE : Chaque réaction de PCR génère 3 produits PCR : 610 pb de produit commun, 406 pb de produit d’allèle T mutant et 264 pb d’allèle G de type sauvage. Le génotype de type sauvage comprend les produits de 610 pb et 264 pb, le génotype hétérozygote comprend les trois produits et le génotype db/db comprend les produits de 610 pb et 406 pb.
2. Vivarium et élevage
Remplacez l’étape 2.1 par l’étape suivante et la remarque :
2.1 Héberger les souris db/db dans un vivarium conventionnel (qui n’est pas une installation exempte de barrières/agents pathogènes spécifiques) afin qu’une microflore puisse s’établir sur la peau des souris db/db . Pour modéliser spécifiquement les humains qui souffrent de plaies chroniques, ne prenez pas de précautions particulières pour éviter l’exposition aux agents pathogènes naturels trouvés dans l’environnement des souris, car les agents pathogènes essentiels de l’étude peuvent être perdus avec des conditions de nettoyage de vivarium plus strictes.
REMARQUE : Comme ces souris sont très grandes et diabétiques, il est préférable d’héberger jusqu’à 3 souris db/db par cage avant de les utiliser pour des expériences de plaies chroniques.
3. Exigences pour le développement de plaies chroniques
Ajoutez l’étape suivante après l’étape 3.2
3.3. Gardez la plaie recouverte d’un pansement en film transparent à tout moment pour éviter le dessèchement du tissu de la plaie.
5. Configuration du réactif
Ajouter le nota suivant après 5.2
REMARQUE : N’utilisez que l’ATZ de l’entreprise répertoriée dans le tableau des matériaux. L’ATZ d’autres sociétés n’est pas compatible avec ce modèle et augmentera la mortalité.
6. Chirurgie
6.1. Traitement et anesthésie
REMARQUE : Un régime d’anesthésie mis à jour est décrit ci-dessous.
6.1.5. Dans un système ouvert, administrer à la souris 5 % d’isoflurane administré avec de l’O2 à un débit (2-3,5 L/min) pour induire l’anesthésie. Surveillez en permanence l’état de la souris.
REMARQUE : Une fois que la souris est inconsciente ou ne bouge plus, placez-la sur un tampon chirurgical blanc et ajustez la tête avec un cône nasal fixé au vaporisateur pour permettre l’administration continue d’isoflurane pendant la chirurgie.
6.1.6. Dans un système ouvert, administrer 1 % d’isoflurane au même débit pendant la chirurgie et ajuster le débit d’isoflurane pour maintenir la profondeur de l’anesthésie.
6.3. Blessures
6.3.5. Arrêter l’administration d’isoflurane à 1 % à la souris à la fin de l’intervention.
7. Traitement postopératoire et récupération
Remplacez l’étape 7.1 dans le protocole d’origine par l’étape suivante et notez :
7.1. Après avoir appliqué le pansement en film transparent juste après l’opération, à l’aide d’une seringue à insuline, déposer localement l’AMS sur le dessus de la plaie créée sur le dos de la souris en pénétrant le pansement en film transparent avec l’aiguille. Utiliser 150 mg/kg de MSA dans une solution stérile de PBS dans les 10 minutes suivant l’opération. Cette concentration a été déterminée après une recherche documentaire approfondie, comme expliqué précédemment 3,4.
REMARQUE : MSA a tendance à précipiter s’il n’est pas constamment agité. Assurez-vous que le MSA est complètement dissous dans la solution avant de l’appliquer sur la plaie pour délivrer la dose calculée à la souris.
Remplacez l’étape 7.4 dans le protocole d’origine par l’étape suivante :
7.4. Administrer la deuxième dose de Buprenex 6 h après l’opération. Ensuite, dosez les souris périodiquement selon les règles locales de l’IACUC pendant les 48 premières heures.
REMARQUE : Il n’est pas recommandé d’utiliser des formulations à libération prolongée d’analgésiques qui doivent être administrés par voie sous-cutanée dans ce modèle de souris. La buprénorphine liée aux lipides peut être en suspension dans l’huile de triglycérides d’acides gras à chaîne moyenne (TCM). Bien que l’effet de l’huile TCM ait été testé chez de très jeunes souris db/db, les effets de l’huile TCM sur des souris db/db plus âgées ou obèses âgées n’ont pas été testés 5,6. Compte tenu du poids des souris, de grandes quantités d’analgésiques injectés par voie sous-cutanée près de la plaie peuvent affecter de manière significative les processus cellulaires et moléculaires de cicatrisation des plaies et d’initiation et de développement chroniques des plaies. De plus, cet analgésique se dissoudra dans les niveaux élevés de graisse chez ces souris et, par conséquent, pourrait ne pas être efficace pour tuer la douleur et pourrait devenir toxique.
8. Collecte de données, manipulation des souris après une blessure, stratégies de survie et conseils supplémentaires
8.1 Collecte des données
Ajoutez les étapes suivantes après l’étape 8.1.3.
8.1.4. S’assurer que les tissus prélevés pour l’analyse ne comprennent que des tissus situés à 2 mm du bord de la plaie, tant dans les plaies témoins que dans les plaies chroniques. Les plaies peuvent être recueillies par excision dès 1 à 2 heures après l’application de l’AMS.
8.1.5. Prélever l’excès de liquide accumulé dans la plaie, ou l’exsudat de la plaie, à l’aide d’une seringue stérile en perçant à travers le film transparent. Conserver à -20 °C pour les études bactériennes ou à -80 °C pour les études chimiques et moléculaires.
8.1.6 Pour prélever des tissus entiers de la plaie, y compris le biofilm, après 10 jours, appliquer 4 % de PFA dans du PBS sur la plaie, par voie topique pendant 10 minutes avant de l’exciser avec des pinces et des ciseaux. Lors du retrait du tissu, ajoutez un bord de plaie supplémentaire de 5 à 10 mm afin que le tissu de la plaie soit soutenu par du tissu normal supplémentaire. Poursuivre la fixation dans 4 % de PFA dans le PBS et les lavages ultérieurs et la préparation pour l’enrobage.
REMARQUE : Les plaies chroniques 10 jours après la chirurgie peuvent devenir trop fragiles pour être prélevées pour l’histologie.
8.5. Stratégies de survie
8.5.1. Fournir un soutien supplémentaire en matière d’hydratation : Vérifiez si les souris deviennent léthargiques et ne mangent pas ou ne boivent pas activement parce que la chirurgie et la génération de la chronicité sont stressantes. Administrer une solution saline chaude (35-38 °C) par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale à un volume de 0,25 mL pour 10 g de poids corporel pendant les 48 à 72 premières heures suivant l’intervention. Un soutien hydrique peut être nécessaire jusqu’à 2 à 3 fois par jour, selon le degré de léthargie des souris. De plus, des granulés de nourriture et des gels d’eau peuvent être placés dans la litière pour un accès facile, bien que des changements de cage plus fréquents puissent être nécessaires.
8.5.2. Fournir un soutien thermique supplémentaire : La survie après l’opération est considérablement augmentée si les souris sont placées dans des cages sur un coussin chauffé par de l’eau en circulation (93 °C) immédiatement après l’opération et lorsqu’elles sont dans le vivarium. Placez la cage 1/2 sur et 1/2 hors du coussin pour permettre à l’animal de s’éloigner de la chaleur s’il a trop chaud et de se déplacer sur le dessus du coussin s’il a froid.
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Résultats
Figure 1 : Génotypage pour identifier les hétérozygotes afin de créer des reproducteurs. Un exemple de gel montre les résultats de 8 échantillons de souris inconnus. Les échantillons 2 et 5 sont hétérozygotes car ils contiennent 3 bandes (610 pb, 406 pb et 264 pb). Les échantillons 1, 3, 4, 6, 7 et 8 sont de type sauvage car ils ne contiennent que 2 bandes (610 pb et 264 pb).
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Discussion
Résultats obtenus à l’aide de ce modèle de plaies chroniques :
Ce modèle a été utilisé pour réaliser plusieurs études dans le but de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’initiation et de la progression des plaies chroniques. Il a été démontré qu’en inhibant les enzymes antioxydantes, des plaies chroniques peuvent être créées chez les souris db/db. Les plaies contenaient initialement une communauté polymicrobienn...
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Poinçon d’oreille de 1 mm | Fisherbrand | 13812201 | trou de 2 mm diamètre |
| 3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) | TCI | A0432 | |
| 70 % d’éthanol | |||
| Acu Punch Poinçons de biopsie cutanée de 7 mm | Acuderm Inc. | P750 | |
| agarose ; | |||
| N° B6. BKS(D)-Leprdb/J ; | Le Laboratoire Jackson ; | 00697 | Homozygotes et hétérozygotes disponibles ; |
| Buprenex (buprénorphine HCl) | Henry Stein Santé animale | 059122 | 0,3 mg/ml, |
| Colorant de charge de gel de classe 3, Violet (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Gants | |||
| Décapant Lotion à l’aloès apaisant et à la lanoline | Nair | un dépilatoire chimique | |
| Pompe de thérapie par la chaleur (eau) HTP-1500 | Adroit MedicalSystems | ||
| Coussin chauffant | Conair | Moist Dry Heating | |
| Pad Tuyaux Adaptateurs ; | Adroit MedicalSystems | ||
| Seringues à insuline | BD | 329461 | 0,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2") |
| Isoflurane | Henry Schein Santé Animale | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| Vaporisateur Isoflurane | JA Baulch & Associés ; | ||
| Kimwipes | |||
| Maxi-Therm Couverture d’hyper-hypothermie | Cincinnati Sub-Zero | Cat n° 247 | 22" x30 pouces Tampon HeavyDuty réutilisable |
| Acide mercaptosuccinique (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| Cône | |||
| Réservoir d’oxygène | doit être compatible avec le système de vaporisation | ||
| Solution tampon de phosphate (PBS) | autoclave stérilisé | ||
| Ciseaux chirurgicaux tranchants Petits récipients | |||
| en plastique | |||
| Hydroxyde de sodium ; | |||
| Taq ; 2X Master Mix | New England Biolabs | M0270L | |
| Tegaderm ; | 3M | Réf : 1624W | Pansement film transparent (6 cm x 7 cm) |
| Spatule | |||
| Tri-HCl | |||
| Tube | |||
| Pince à épiler | |||
| Tondeuse à cheveux | Wahl Wahl | Lithium Ion Pro |
Références
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
- Basu, P., Martins-Green, M. Signaling pathways associated with chronic wound progression: a systems biology approach. Antioxidants. 11 (8), 1506(2022).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS and skin microbiome are critical for initiation and development of chronic wounds in diabetic mice. Sci Rep. 9 (1), 19318(2019).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS create a microenvironment that significantly decreases the diversity of the microbiota in diabetic chronic wounds and promotes biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol. 10 (259), (2020).
- Kim, J. H., et al. Pseudomonas aeruginosa activates quorum sensing, antioxidant enzymes and type VI secretion in response to OS to initiate biofilm formation and wound chronicity. Antioxidants. 13 (6), 655(2024).
- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
- Kim, J. H., et al. Targeting anaerobic respiration in Pseudomonas aeruginosa with chlorate improves healing of chronic wounds. Adv Wound Care. 13 (2), 53-69 (2024).
- Jabbari, P., et al. Chronic wound initiation: single-cell RNAseq of cutaneous wound tissue during initiation of chronic wound development. Antioxidants. 14 (2), 214(2025).
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