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Article de méthode

Une plate-forme multi-électrodes pour modéliser l’épilepsie à l’aide d’assembloïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes humaines

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DOI :

10.3791/67396

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27 septembre 2024

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1Division of Pediatric Neurology, Department of Pediatrics, Michigan Medicine, Ann Arbor, 2Michigan Neuroscience Institute, University of Michigan, Ann Arbor

Dans cet article

Résumé

Ce protocole vise à plaquer de manière stable des assembloïdes fusionnés dorsaux-ventraux sur des réseaux multi-électrodes pour modéliser l’épilepsie in vitro.

Résumé

Les organoïdes du cerveau humain sont des structures tridimensionnelles (3D) dérivées de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) qui récapitulent des aspects du développement du cerveau fœtal. La fusion in vitro d’organoïdes cérébraux dorsaux avec des organoïdes cérébraux spécifiés localement génère des assembloïdes, qui ont des microcircuits fonctionnellement intégrés avec des neurones excitateurs et inhibiteurs. En raison de leur complexité structurelle et de la diversité de leur population de neurones, les assembloïdes sont devenus un outil in vitro utile pour étudier l’activité aberrante des réseaux. Les enregistrements multi-électrodes (MEA) servent de méthode pour capturer les potentiels de champ électrique, les pointes et la dynamique de réseau longitudinale d’une population de neurones sans compromettre l’intégrité de la membrane cellulaire. Cependant, il peut être difficile de faire adhérer des assembloïdes sur les électrodes pour des enregistrements à long terme en raison de leur grande taille et de leur surface de contact limitée avec les électrodes. Ici, nous démontrons une méthode permettant de plaquer des assembloïdes sur des plaques MEA pour enregistrer l’activité électrophysiologique sur une période de 2 mois. Bien que le protocole actuel utilise des organoïdes corticaux humains, il peut être largement adapté à des organoïdes différenciés pour modéliser d’autres régions du cerveau. Ce protocole établit un test électrophysiologique longitudinal robuste pour étudier le développement d’un réseau neuronal, et cette plateforme a le potentiel d’être utilisée dans le criblage de médicaments pour le développement thérapeutique dans l’épilepsie.

Introduction

Les organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) sont des structures 3D spatialement auto-organisées reflétant l’architecture tissulaire et les trajectoires de développement in vivo. Ils sont composés de plusieurs types de cellules, y compris des progéniteurs (cellules neuroépithéliales, glie radiale, progéniteurs neuronaux, progéniteurs gliaux), des neurones (neurones excitateurs de type cortical et interneurones inhibiteurs) et des cellules gliales (astrocytes et oligodendrocytes)1,2. Les assembloïdes représentent la prochaine génération d’organoïdes cérébraux, capables d’intégrer plusieurs régions cérébrales et/ou lignées cellulaires au sein d’une culture 3D. Ils constituent un outil utile pour modéliser les connexions entre diverses régions du cerveau ressemblant à leurs homologues in vivo, capturer les interactions entre les neurones et les astrocytes afin de mieux imiter les réseaux neuronaux matures et complexes, et pour étudier l’assemblage des circuits neuronaux. Par conséquent, les assembloïdes deviennent un outil largement utilisé pour récapituler les caractéristiques de la physiopathologie de l’épilepsie, dans laquelle des mesures fonctionnelles sont nécessaires pour interroger les réseaux neuronaux aberrants qui peuvent être à l’origine dela maladie.

Pour modéliser les interactions entre les neurones glutamatergiques corticaux et les interneurones GABAergiques, plusieurs groupes ont développé des organoïdes séparés ressemblant au cerveau dorsal et ventral, puis les ont fusionnés en un assembloïde multi-régions 7,8,9,10. Ici, un protocole de culture assembloïde précédemment décrit avec des sous-types neuronaux spécifiques à la région a été appliqué9. Cependant, un obstacle important est le manque de tests fonctionnels reproductibles pour surveiller l’activité du réseau neuronal pendant le développement neurologique. De nombreux tests fonctionnels des réseaux dans les organoïdes donnent des résultats qui présentent une grande variabilité entre les lots de différenciations et les lignées cellulaires. Les techniques qui impliquent de trancher ou de dissocier des organoïdes modifient leurs réseaux inhérents en coupant la connectivité synaptique8.

Les réseaux multi-électrodes (MEA) fournissent une vue à grande échelle de l’activité du réseau au fil du temps avec une résolution temporelle élevée pour caractériser les propriétés électrophysiologiques des organoïdes sans perturber les conditions de culture ou l’intégrité de la membrane cellulaire11. Par rapport à l’électrophysiologie par patch clamp, la MEA permet l’acquisition de données à haut débit basée sur de grandes populations de neurones plutôt que sur des cellules uniques. Les plates-formes MEA varient dans leur densité d’électrodes, répondant à différents besoins dans la recherche sur les organoïdes cérébraux12. Les systèmes largement utilisés, comme le montre ce protocole, enregistrent de 8 à 64 électrodes par puits 13,14,15. Les MEA à haute densité avec jusqu’à 26 400 électrodes par puits permettent d’augmenter la résolution spatiale et temporelle, la quantification de la vitesse de propagation du potentiel d’action et la combinaison avec la stimulation optogénétique 14,16,17. Par conséquent, la MEA sert d’outil puissant pour la modélisation de l’épilepsie in vitro et de paradigme translationnel pour le dépistage des médicaments anti-épileptiques.

L’un des principaux défis consiste à stabiliser les assembloïdes de grande taille sur une surface métallique hydrophobe pour des enregistrements à long terme. Ce protocole décrit une méthodologie détaillée pour le placage d’assembloïdes intacts sur des plaques MEA pour un enregistrement longitudinal à long terme ainsi que des tests pharmacologiques. Les avantages uniques du protocole comprennent une fixation stable des assembloïdes à la surface de l’électrode sans perte d’activité électrique, l’utilisation de milieux neurophysiologiques basaux disponibles dans le commerce pour accélérer la maturation du réseau fonctionnel après le placage, la possibilité d’effectuer des tests fonctionnels en aval comme le traitement médicamenteux et une large application aux organoïdes générés avec d’autres protocoles spécifiques à une région.

L’objectif est de fournir un test fonctionnel à haute résolution temporelle pour étudier l’activité du réseau, examiner les changements spécifiques à la maladie et tester des médicaments ayant un potentiel thérapeutique dans l’épilepsie. Des instructions vidéo sont fournies pour les étapes les plus difficiles de ce protocole, montrant les techniques de placage des assembloïdes sur des plaques MEA, ainsi que des enregistrements représentatifs de ces cultures.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été menées conformément aux directives éthiques du conseil d’examen institutionnel de la faculté de médecine de l’Université du Michigan et du comité de surveillance de la recherche sur les cellules souches pluripotentes humaines. Les lignées iPSC utilisées dans ce protocole et les expériences représentatives ont été dérivées de fibroblastes de prépuce humain obtenus d’une source commerciale. Les détails des lignées cellulaires, des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Dérivation d’organoïdes cérébraux spécifiques au destin à partir d’iPSC

REMARQUE : Ce protocole contient de l’information pour la préparation de 3 puits dans la plaque de culture de micropuits à partir de 5 puits confluents (~85 %) d’une plaque de 6 puits. Le protocole de maintenance des iPSC varie en fonction des lignées cellulaires.

  1. Préparez le milieu de culture cellulaire individuel en utilisant la composition détaillée dans le tableau 1. Conserver à l’abri de la lumière à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
  2. Rincez une fois tous les puits à utiliser dans la plaque de culture de micropuits avec 1 mL de DMEM/F-12. Ajouter 1 mL/puits mTeSR plus + 50 μM Y-27632 et faire tourner la plaque à 2000 x g pendant 5 min à température ambiante pour éliminer les bulles d’air des micropuits. Conservez la plaque dans un incubateur à 37 °C 5% CO2 .
  3. Nettoyez des régions d’iPSC différenciées à l’aide d’une pointe de pipette P10 stérile au microscope sur un banc propre à flux laminaire. Lavez les débris cellulaires de la monocouche avec 1 mL/puits de PBS sans calcium ni magnésium.
  4. Dissociez la monocouche en cellules uniques en ajoutant 1 ml/puits de réactif de dissociation cellulaire préchauffé et en plaçant la plaque dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO2 pendant 4 à 7 minutes (selon les caractéristiques et la confluence des lignées cellulaires) jusqu’à ce que la plupart des cellules se détachent, avec une légère agitation toutes les 2 à 3 minutes.
  5. Ajouter 4 mL de DMEM/F-12 dans chaque puits pour diluer le réactif de dissociation cellulaire, et triturer modérément avec une pipette sérologique de 10 mL. Recueillir la suspension cellulaire de tous les puits de la même conduite dans un tube conique de 50 ml.
  6. Faites tourner à 200 x g pendant 4 min à température ambiante, aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL et remettez les cellules en suspension dans 2 mL de mTeSR plus + 50 μM Y-27632. Prélever une suspension cellulaire de 10 μL, mélanger 1:1 (v/v) avec du bleu trypan et compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
  7. Plaque 3 x 106 cellules vivantes par puits, 3 puits par ligne. Ajoutez du mTeSR plus + 50 μM Y-27632 supplémentaires au besoin pour porter le volume total à 2 mL/puits. Faites tourner la plaque à 100 x g pendant 3 min à température ambiante et remettez-la dans l’incubateur.
    REMARQUE : La plaque de culture de micropuits utilisée ici contient 300 micropuits par puits, de sorte que le placage de 3 x 106 cellules donne 10 000 cellules/micropuits.
  8. Le lendemain, effectuez un changement de demi-volume en retirant délicatement 1 ml de support et en ajoutant lentement 1 ml de support mTeSR plus (sans Y-27632) avec une pointe de pipette P1000. Gardez la pointe près de la surface du support et aspirez aussi lentement que possible, afin de ne pas déranger les cellules d’agrégation au fond.
  9. Vérifiez au microscope inversé un jour après le changement de support, et un contour clair de chaque agrégat peut être vu. Retirez le support d’origine de chaque puits à l’aide des pointes de pipette P1000.
  10. Vaporiser modérément 0,5 mL de milieu d’induction neurale (NIM) avec de la dorsomorphine (DM) et du SB-4321542 (SB) dans chaque puits avec des pointes P1000 stériles et coupées. Immédiatement, piquez doucement les agrégats en suspension dans le milieu et transférez-les dans une boîte de culture stérile en suspension de 10 cm. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les agrégats soient transférés. Ne triturez pas.
  11. Ajoutez des NIM + SB/DM supplémentaires au besoin pour porter le volume total à 10 ml/plat. Placez la parabole sur un agitateur orbital dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO2 pour éviter la fusion spontanée des agrégats. Marquez la date de transfert comme Jour 0 de la culture d’organoïdes.
  12. Du jour 1 à la fin, suivez la recette des médias dans le tableau 1 et la chronologie des changements de médias9 dans la figure 1. Notamment, les organoïdes sont divisés en deux boîtes de culture en suspension désignées comme « dorsale » et « ventrale » le jour 4.
    REMARQUE : Plusieurs points clés à garder à l’esprit : l’expansion des organoïdes commence le jour 6, lorsque le média est basculé sur le milieu de différenciation neuronale (NDM) avec EGF/FGF. La différenciation neuronale est soutenue à partir du jour 25 par NDM + BDNF/NT3, et les organoïdes sont maintenus dans le NDM sans facteurs de croissance à partir du jour 46.

2. Marquage viral et génération d’assembloïdes

REMARQUE : Le marquage viral 7,9 est recommandé pour reconnaître l’identité de chaque organoïde spécifique à une région dans un assembloïde et attribuer l’activité électrophysiologique d’électrodes spécifiques aux régions assembloïdes. Il est optimal qu’un seul organoïde soit plaqué pour chaque puits MEA. Ce protocole peut également s’appliquer à l’ensemencement d’un seul organoïde.

  1. Calculer les volumes de stock de virus et de milieux de dilution à utiliser : 200 μL de milieux contenant du virus sont nécessaires pour chaque organoïde à étiqueter. Les organoïdes dorsaux sont marqués avec pAAV1-CAG-tdTomato, généralement à un rapport de dilution de 1:1000 (v/v), soit environ 2 x10 10 vg/mL. Pour les organoïdes ventraux, on utilise le virus pAAV1-mDLX-GFP de 1:300 (v/v) ou 2 x 1011 vg/mL.
    REMARQUE : Les dilutions doivent être ajustées à l’effet désiré et sont affectées par le titre viral.
  2. Réchauffez la quantité appropriée de fluide à 37 °C. Décongeler les stocks de virus stockés à -80 °C sur de la glace. Étiquetez suffisamment de plaques à 48 puits pour accueillir tous les organoïdes étiquetés.
  3. Mettez un bécher contenant 10% d’eau de Javel dans la capuche. Expulsez tous les matériaux en contact avec des virus dans le bécher. Diluer les virus complètement décongelés dans des milieux de culture dans des tubes coniques séparés de 15 ml, étiquetés « dorsal » et « ventral ».
  4. Déplacez les organoïdes du jour 56 des plats de culture aux assiettes de 48 puits. Un organoïde par puits est recommandé pour éviter la fusion spontanée en culture statique. Retirez autant que possible les milieux de culture résiduels.
  5. Ajouter 200 μL de mélange virus-milieu dans chaque puits, respectivement. Remettez les plaques dans l’incubateur à 37 °C 5% CO2 . Inclinez les plaques sur une plaque vide stérile pour aider à concentrer les particules virales au fond du puits et optimiser l’efficacité de la transduction.
    REMARQUE : Les particules virales ont tendance à couler au fond du tube conique de 15 ml, de sorte qu’il est très important d’inverser fréquemment le tube pour mélanger les virus avec les milieux avant de les ajouter à chaque puits pour assurer une efficacité de transduction uniforme pour tous les organoïdes.
  6. Le lendemain (jour 57), ajoutez 800 μL de milieu de culture supplémentaire dans chaque puits pour porter le volume total à 1 mL/puits.
  7. Trois jours plus tard (jour 60), effectuez un changement complet de milieu sur les organoïdes étiquetés. Blanchir tous les matériaux en contact avec des particules virales.
  8. Trois jours plus tard (jour 63), vérifiez l’expression de la fluorescence à l’aide d’un microscope inversé à épifluorescence. Si le signal est fort, commencez à générer des assembloïdes (voir étape 2.9).
  9. Rincez deux fois tous les organoïdes marqués avec du PBS à 1 ml/puits pour éviter la contamination croisée par les particules virales restantes lors de la fusion des organoïdes. À l’aide d’une pointe de pipette P1000 coupée, transférez un organoïde ventral dans chaque puits dorsal (ou vice versa) et réétiquetez la plaque assembloïde en conséquence. Inclinez les plaques comme à l’étape 2.5 pour une meilleure fusion.
  10. Effectuez soigneusement un changement de support d’un demi-volume 3 jours après la procédure de fusion (jour 66) sans interrompre les assembloïdes. Il faut généralement environ une semaine pour former des assembloïdes stables (jour 70).

3. Placer les assembloïdes sur des plaques MEA prétraitées

REMARQUE : Il faut au moins 4 jours pour terminer les procédures de préparation de surface des plaques MEA avant de placage des assemblages. Pour gagner du temps, la fusion des organoïdes dorsaux et ventraux (c’est-à-dire l’étape 2.9) et le prétraitement MEA peuvent être effectués en parallèle.

  1. Préparer les réactifs pour le prétraitement de surface et le revêtement.
    1. Pour préparer une solution détergente/enzymatique à 1 %, dissoudre 0,5 g de poudre d’enzyme/détergent dans 50 mL d’eau déminéralisée. Agitez soigneusement jusqu’à ce que la poudre soit complètement dissoute. Stérilisez la solution à l’aide d’un filtre à vide supérieur à tube stérile dans l’enceinte de biosécurité avant de l’ajouter aux puits MEA. Préparez des produits frais avant chaque utilisation.
      REMARQUE : Le détergent/enzyme stérilise la surface MEA, élimine toutes les huiles résiduelles du processus de fabrication MEA et garantit que la surface est suffisamment hydrophile pour favoriser les interactions avec le composé hydrophile polyéthylèneimine (PEI)18.
    2. Pour préparer une solution mère de PEI à 0,07 %19, commencez par préparer une solution mère de PEI à 7 % en mélangeant 1 mL de solution de PEI à 50 % dans un tube conique de 15 mL avec 6 mL de 1 tampon de borate. Diluer 1 mL de solution mère à 7 % de PEI dans 99 mL de 1x tampon de borate pour atteindre la concentration de travail finale. Pour la stérilisation, filtrez à travers une unité de filtration de 0,22 μm dans l’enceinte de biosécurité avant utilisation.
      REMARQUE : Le PEI, un polymère chargé positivement, est utilisé dans le processus de revêtement primaire pour faciliter la fixation d’un revêtement secondaire chargé négativement avec la matrice de membrane basale (BMM) et les assembloïdes20. Prélever 1 mL de PEI à 50 % en versant au lieu de pipeter dans le tube conique, car la solution mère est très visqueuse. La quantité nécessaire peut être plus facilement mesurée en la pesant dans un tube conique, et la solution à 50 % de PEI a une densité de 1,08 g/mL. La solution mère à 7 % de PEI peut être conservée dans des aliquotes de 1 mL à -20 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à un mois. Effectuez toutes les étapes ultérieures dans l’enceinte de biosécurité.
  2. En tenant compte de la taille de chaque assembloïde, des plaques MEA à 6 puits avec 64 électrodes par puits sont utilisées pour accueillir un assembloïde par puits. Calculer le nombre de plaques MEA nécessaires pour les expériences afin d’assurer un nombre suffisant de réplicats biologiques.
  3. Ajouter 1 mL de solution détergente/enzymatique à 1 % dans chaque puits d’une plaque MEA stérile. Veillez à ne pas endommager les électrodes avec la pointe de la pipette. Si vous utilisez un aspirateur pour les lavages, ne laissez pas la pointe toucher le réseau d’électrodes. Incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 2 h.
  4. Retirez le détergent ou l’enzyme et lavez chaque puits cinq fois avec 1,5 ml d’eau déminéralisée stérile. Étant donné que le détergent/enzyme n’est pas biocompatible, il est important de s’assurer que les produits chimiques restants sont complètement lavés.
  5. Remplissez chaque puits avec 1 mL de milieu de culture pour le préconditionnement. Remettez les plaques dans l’incubateur à 37 °C 5% CO2 pendant 2 jours. L’exposition de la surface MEA aux conditions de culture cellulaire favorise l’attachement cellulaire.
  6. Retirer le milieu de culture et couvrir les électrodes MEA de chaque puits avec 50 μL de solution PEI à 0,07 % pour l’enrobage primaire. Incuber à 37 °C pendant 1 h.
  7. Aspirer complètement la solution PEI. Lavez chaque puits avec 1 mL d’eau déminéralisée stérile. Effectuez 3 lavages rapides au total. Faites sécher les plaques à température ambiante pendant 15 minutes dans l’enceinte de biosécurité, sans le couvercle.
  8. Couvrir la zone de l’électrode dans chaque puits avec 50 μL de BMM 1:20 (v/v) dilué dans un milieu de culture pour l’enrobage secondaire. Remettez les plaques MEA dans l’incubateur à 37 °C pendant la nuit. Ajoutez de l’eau stérile dans les compartiments entourant les puits pour assurer une humidité suffisante tout au long de l’enrobage.
  9. Le lendemain, aspirez le BMM dilué sous vide, en laissant une fine couche sur la surface. Si une couche épaisse s’est formée, vaporisez avec force la zone de contact de l’électrode avec un milieu de culture à l’aide d’une pointe de pipette P1000. Lavez autant de fois que nécessaire pour enlever les morceaux épais.
    REMARQUE : Un BMM épais résiduel peut interférer avec le contact de l’électrode avec les cellules.
  10. Prélevez un assembloïde avec une pointe P1000 largement coupée et placez-le sur les électrodes dans un puits tout en transférant le moins de fluide possible.
  11. Dans une hotte à flux laminaire sous un endoscope de dissection, poussez soigneusement l’assembloïde avec une aiguille de dissection stérile ou une pointe P20 jusqu’à l’endroit souhaité, où les organoïdes dorsaux et ventraux peuvent être principalement recouverts par des électrodes. Utilisez un embout P20 pour enlever le liquide autour de l’assemblage. Répétez cette opération pour tous les assembloïdes ou un sous-ensemble, ce qui peut être fait en quelques minutes.
    REMARQUE : Essayez de NE PAS toucher ou rayer la surface MEA avec la pointe de la pipette et/ou l’aiguille. Essayez de NE PAS piquer ou déchirer l’assemblage avec les pointes de la pipette. Terminez le placage le plus rapidement possible pour éviter que l’organoïde ne se dessèche complètement.
  12. Incuber les assembloïdes à 37 °C pendant 10 min (sans milieu). Transférez les plaques de l’incubateur dans une hotte à flux laminaire et appliquez 2-3 petites gouttes de BMM 1:50 diluées dans un milieu de culture sur les assembloïdes sous un endoscope de dissection. Incuber à 37 °C pendant encore 30 min.
  13. Ajouter délicatement 3 gouttes de milieu de culture à proximité des assembloïdes sous une lunette de dissection. Cela permet de garder les organoïdes hydratés. Incuber à 37 °C pendant 1 h.
    REMARQUE : Si l’assemblage se déplace ou flotte dans les étapes suivantes, le placage doit être redémarré à partir de l’étape 3.11.
  14. Toutes les heures, ajoutez soigneusement 20 à 50 μL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits sous un endoscope de dissection. Cela peut se faire au cours d’une journée. L’objectif est d’atteindre au moins 250 μL de volume total à la fin de la journée.
  15. Le lendemain, vérifiez si tous les assembloïdes sont stabilisés sous la portée de dissection. Ajouter 750 μL de milieu de culture supplémentaire pour atteindre un volume total de 1 mL/puits. Laissez les assiettes intactes pendant au moins 2 jours.
  16. Effectuez soigneusement les changements hebdomadaires de milieu en prélevant 500 μL de milieu de culture et en ajoutant 700 μL de milieu neurophysiologique basal. Le volume supplémentaire de média ajouté tient compte de l’évaporation et peut être ajusté en fonction de la quantité d’évaporation de la plaque MEA utilisée. Ajoutez de l’eau stérile autour des puits au besoin pour minimiser l’évaporation des puits MEA.

4. Enregistrement MEA et analyse des données

  1. Commencer l’enregistrement de l’AEM environ une semaine après le passage aux milieux basaux neurophysiologiques (généralement vers le jour 78).
  2. Attendez que la chambre d’enregistrement atteigne sa température de consigne (généralement 37 °C). Transférez une plaque sur l’appareil et laissez-les s’équilibrer pendant au moins 5 minutes avant l’enregistrement.
  3. Paramètres matériels en direct
    1. Réglez la fréquence d’échantillonnage, c’est-à-dire la vitesse à laquelle les données de tension brutes sont enregistrées. Le réglage par défaut (12,5 kHz) est recommandé.
    2. Spécifiez le mode analogique (généralement Neural Spikes, comme dans ce cas) pour configurer la bande passante et le gain matériels pour des applications particulières. Pour une surveillance visuelle de l’activité pendant l’enregistrement, utilisez les modules Détecteur de pointes et Détecteur de rafales .
      REMARQUE : Les paramètres analogiques affectent la façon dont les données de tension brutes sont enregistrées et ne peuvent pas être modifiés après l’enregistrement des données.
    3. (Facultatif) Appliquez un filtre numérique matériel aux données d’enregistrement. Les options de filtre passe-bas incluent une fenêtre Kaiser de 2 kHz ou 3 kHz. Les paramètres par défaut peuvent être modifiés après avoir sélectionné les paramètres analogiques.
    4. Défini sur le référencement par médiane (par défaut), ce qui est fortement recommandé pour l’enregistrement neuronal, comme dans ce cas. Le référencement améliore la qualité des signaux de faible amplitude en réduisant les interférences sonores communes aux groupes de canaux.
      REMARQUE : Les paramètres ci-dessus peuvent être ajustés au besoin en fonction de l’activité observée dans les assembloïdes, mais doivent rester cohérents pour tous les enregistrements d’une expérience donnée.
  4. Ajoutez des cartes de plaques et des descriptions (si nécessaire). Importez la carte de plaque de l’enregistrement précédent pour la même plaque afin d’assurer la cohérence et de faciliter le traitement des données de lot. Assurez-vous que les fichiers sont correctement nommés.
  5. Si les signaux semblent bons (bruit minimal et artefact), enregistrez les données brutes. En général, 2 à 5 minutes d’enregistrement suffisent pour un échantillon représentatif.
  6. Enregistrer longitudinalement l’activité électrique une ou deux fois par semaine, pendant 5 à 15 minutes, selon le plan d’expérience. Attendez au moins 24 h après chaque changement de support avant de commencer la prochaine série d’enregistrement, car l’activité électrique diminue immédiatement après chaque changement de support.
  7. (Facultatif) Si l’activité électrique doit être localisée et distinguée entre les organoïdes dorsaux et ventraux, ou si l’activité de chaque électrode doit être analysée séparément, obtenir une image de chaque assembloïde en fond clair et en épifluorescence (Figure 2B) après chaque enregistrement.
  8. Lors de l’analyse des données, appliquez une configuration d’analyse, y compris un détecteur de pointes/rafales et un compilateur de statistiques. Utilisez un seuil adaptatif défini sur 5,5 à 6 écarts types par rapport à la ligne de base pour la détection des pics. Identifier les pics en tant qu’activité avec ≥5 pics en 100 ms13. Définir l’activité du réseau lorsque plus de 25 % du total des électrodes actives se déclenchent dans un délai de 100 ms avec un minimum de 50 pointes par rafale de réseau13,14.
    REMARQUE : Ces paramètres sont modulés en fonction des caractéristiques de mise à feu d’une expérience spécifique. Pour augmenter la sensibilité aux pics de faible amplitude, le seuil adaptatif de détection des pics peut être abaissé. Pour la détection en rafale, différentes méthodes peuvent être utilisées, et les paramètres peuvent être adaptés pour détecter des rafales de pointes qui diffèrent considérablement de l’activité en arrière-plan. Les paramètres d’activité du réseau peuvent être modulés à un pourcentage plus faible d’électrodes, en particulier lorsque les assembloïdes ne couvrent pas tout le champ des électrodes. Tous les paramètres doivent rester constants pendant toute la durée de l’expérience afin de permettre des comparaisons longitudinales.
  9. Exécutez le module Compilateur de statistiques pour le traitement par lots tout en rejouant les données enregistrées. Exportez des métriques avancées et/ou des fichiers de sortie de pics pour une analyse avancée.
    REMARQUE : La sortie des métriques avancées contient .csv fichier avec les moyennes d’électrode, de puits et de groupe pour la décharge moyenne, l’éclatement et la synchronie. La sortie de pic (fichier .spk) comprend des traces de forme d’onde pour tous les pics, qui peuvent être importées sur d’autres plates-formes pour une analyse avancée, par exemple, le tri des pics.

5. Test pharmacologique final et recyclage des plaques

REMARQUE : Les tests de traitement médicamenteux peuvent être effectués après que les assembloïdes sont suffisamment matures et que l’activité électrique atteint son maximum. L’enregistrement de l’activité de base/avant et après le traitement doit être effectué le même jour.

  1. Ajoutez 1 à 10 μL de solution médicamenteuse juste au-dessus de l’assembloïde et faites tourner doucement la plaque pour assurer un mélange uniforme. Dans certains cas, il est recommandé d’allonger le temps d’incubation dans des milieux contenant du médicament, p. ex., des tests de traitement médicamenteux liés aux synapses avec des agonistes/antagonistes des récepteurs du glutamate et du GABA (figure 2E) (voir la section Résultats pour plus de détails).
    REMARQUE : Il est recommandé d’ajouter une petite quantité de solution médicamenteuse à chaque puits pour atteindre une concentration de travail finale, car un changement important de volume diminuera temporairement l’activité électrique en général. Il est important de s’assurer que l’ajout d’un véhicule dans lequel les médicaments d’intérêt sont dissous ne provoque pas de modifications significatives des paramètres électrophysiologiques.
  2. Effectuez suffisamment de lavages PBS (généralement 3) et rincez les médicaments après l’enregistrement post-traitement. Effectuez un enregistrement supplémentaire le lendemain après le lavage du médicament pour voir si l’activité électrique revient au niveau de base.
  3. En option, pipetez avec force le milieu pour séparer les assembloïdes de la plaque MEA à la fin des enregistrements afin d’effectuer d’autres expériences, par exemple, l’imagerie en direct, la fixation avec 4 % de paraformaldéhyde pour l’immunocoloration complète, ou la lyse pour l’extraction d’ARN ou de protéines.
  4. À des fins d’analyse, utilisez au moins trois répétitions techniques et biologiques pour chaque condition. Exprimer les données électrophysiologiques sous la forme d’une moyenne de n ≥ 3 répétitions.
  5. Pour recycler la plaque à la fin des expériences, aspirez les milieux restants après avoir retiré les assembloïdes attachés. Lavez une fois avec du PBS stérile. Recouvrez entièrement la zone métallique avec 200 μL/puits de trypsine-EDTA à 0,25 % et remettez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit.
  6. Le lendemain, aspirez la trypsine, lavez deux fois avec de l’éthanol stérile à 70 % et trois fois avec de l’eau désionisée stérile.
  7. Faites sécher la plaque à l’air libre dans l’enceinte de sécurité biologique pendant 15 minutes sans le couvercle ou jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche. Fermez l’assiette nettoyée dans un sac en plastique et conservez-la à température ambiante jusqu’à une utilisation ultérieure.
    REMARQUE : Une plaque MEA bien nettoyée peut être réutilisée trois fois sans perte significative de qualité d’enregistrement.

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Résultats

Des assembloïdes dorsaux-ventraux humains ont été placés sur une plaque MEA à 6 puits (n = 6 par différenciation, 3 différenciations), chaque puits contenant 64 électrodes (Figure 2A). Neuf des dix assembloïdes prévus pour l’enregistrement longitudinal ont été solidement fixés aux électrodes pendant plus de 50 jours in vitro (figure 2D). 6 des 8 assembloïdes désignés pour les essais pharmacologiques ont été décantés avec...

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Discussion

Des méthodes basées sur la MEA pour l’enregistrement électrophysiologique de l’activité du réseau dans des assembloïdes dérivés d’iPSC ont été utilisées pour la modélisation in vitro de l’épilepsie22,23. Cette plateforme proposée intégrant des connexions synaptiques excitatrices et inhibitrices a le potentiel d’aborder les mécanismes de l’hyperexcitabilité neuronale et le rôle des interneurones corticaux dans le processu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas de divulgations pertinentes.

Remerciements

Ce manuscrit a été soutenu par R01NS127829 NIH/NINDS (LTD). La figure 1 a été générée à l’aide de biorender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 cm Corning Boîtes de culture non traitées TCCorning08-772-32Pour la culture en suspension sur l’agitateur
100 mL Beaker  ;Fisher ScientificFB100100
100 % éthanolFisher ScientificBP28184-4L
2-Mercaptoéthanol (&beta ;-ME)Thermo Fisher21985023Concentration de travail 100 &mu ; M
Plaque de culture cellulaire 48 puitsFisher Scientific50-202-140
Plaque de culture cellulaire 6 puitsFisher Scientific07-200-83
Aggrewell 800Fisher Scientific501974754
Allegra X-14R Centrifugeuse réfrigéréeBeckman Coulter  ;BE-AX14R
AllopregnanoloneCayman16930Suspension 5mg dans le DMSO pour obtenir 1 mM de solution mère. Aliquote et congélation à &minus ; 80 &°C. Diluer à 1:10 000 pour l’utilisation. Concentration de travail 100 nM.
Compteur de cellules automatiséThermo FisherAMQAX2000
Axion CytoView MEA Plaques 6 puits  ;Axion BiosystemsM384-tMEA-6B
Axion Maestro Plateforme MEAAxionBiosystems MaestroAvec contrôle de la température
Supplément B-27 (régulier, avec vitamine A)Thermo Fisher21985023
supplément B-27 (sans vitamine A)Thermo Fisher12587010
Matrice de membrane basale - GeltrexThermo FisherA1569601
Bain de billesFisher Scientific10-876-001Isotemp
Microscope inversé de paillasseOlympusCKX53Maintenu en flux laminaire propre
Banc bicullineSigma-Aldrich14340Concentration de travail 10 &mu ; M
BleachCLOROX67619-26
Tampon borate 20xThermo Fisher28341Concentration de travail à 1x
média BrainPhysStemCell Technologies5790
Réactif de dissociation cellulaire (StemPro Accutase)Thermo FisherA1110501
Celltron agitateur orbitalHT-Infors  ; I69222° ;
Détergent/enzyme (Terg-A-Zyme)Sigma-AldrichZ273287Concentration de travail 1 % m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-GlutamineThermo Fisher113300
DMSOSigma-Aldrich67685
DorsomorphineSigma-AldrichP5499Dissoudre 5 mg dans du DMSO pour obtenir 10 mM de solution mère. Aliquote et congélation à &minus ; 20 ° ;C. Diluer à 1:2000 pour l’utilisation. (concentration de travail 5 &mu ; M)
D-PBS sans calcium ni magnésiumThermo Fisher14190144
Glial cell line neurotrophic (GDNF)Peprotech450-10Dissoudre 100 &mu ; g dans 1 mL de PBS à 100 &mu ; g/mL. Aliquote et congélation à &minus ; 20 &°C. Diluer à 1:5000 pour l’utilisation. (concentration de travail 20 ng/mL).
Supplément GlutaMAXThermo Fisher35050061
HémacytomètreMicroscopie Election Sciences63510-20
HEPESThermo Fisher15630080
Heraguard ECO Clean BenchThermo Fisher51029692
Incubateur de culture cellulaire à humidité contrôléeThermo Fisher370réglé à 37 ° ; C, 5 % CO2
IWP-2SelleckchemS7085Aliquote et congélation à &minus ; 80 °C. Il précipitera s’il est décongelé à température ambiante. Les aliquotes congelées doivent être placées directement dans 37 ° ; C avant utilisation.
Remplacement sérique knockout (KOSR)Thermo Fisher10828010
mTeSRplus (milieu + suppléments)StemCell Technologies100-0276cGMP, milieu stabilisé sans feeder pour cellules iPSC humaines
Supplément N2Thermo Fisher17502048
Neurobasal AThermo Fisher21103049
Acides aminés non essentiels (NEAA)Thermo Fisher11140050
NT3Peprotech450-03Dissoudre 100 &mu ; g dans 1 mL de PBS à 100 &mu ; g/mL. Aliquote et congélation à &minus ; 20 &°C. Diluer à 1:5000 pour l’utilisation. (concentration de travail 20 ng/mL).
NuFF Fibroblastes du prépuce néonatal humainMTI-GlobalStemGSC-3002
ParafilmPARAFILMP7793
Péniciline/StreptomycineThermo Fisher15140122
Pipette (P10, P200, P1000)EppendorfEP4926000034Coupe autoclavée P1000 pointes pour le prélèvement d’organoïdes
Poly (Ethyleneimine) (PEI)Sigma-AldrichP3143Diluer le bouillon dans un tampon stérile pour borate. Concentration de travail 0,07 %. Voir les détails dans le manuscrit.
Facteur de croissance épidermique humain (EGF) recombinantR& D Systems236-EG-200suspendu en PBS. Aliquote et congélation à -20 °C.
Facteur de croissance des fibroblastes humains recombinants (FGF)-basic  ;Peprotech100-18Bsuspendu en PBS. Aliquote et congélation à -20 °C.
Facteur neurotrophique recombinant dérivé du cerveau humain (BDNF)Peprotech450-02Centrifugeuse brièvement avant la reconstitution. Dissoudre 100 &mu ; g dans 1 mL de PBS à 100 &mu ; g/mL. Aliquote et congélation à &minus ; 20 &°C. Diluer à 1:5000 pour l’utilisation. (concentration de travail 20 ng/mL).
Acide rétinoïque (RA)Sigma-AldrichR2625Dissoudre 100 mg dans 3,3 mL de DMSO pour obtenir 100 mM de solution mère. Aliquote le stock 100 &mu ; L/tube et geler à &minus ; 80 °C. Prenez 200 &mu ; L de 100 mM de stock et diluer 10x (ajouter 1,8 mL de DMSO) pour obtenir 10 mM de stock. Aliquote 50 &mu ; L/tube et stocker à &minus ; 80 ° ;C. Diluer à 1:100 000 pour l’utilisation. (concentration de travail 100 nM).
Inhibiteur de ROCK Y-27632Tocris12541:200 à partir de 10 mM stock
SAG (agoniste lissé)SelleckchemS7779Aliquote et congélation à &minus ; 80 ° ;C. Concentration du stock 1mM. Utilisation à une dilution de 1:10 000 (concentration de travail 100 nM).
SB-431542Tocris1614Dissoudre 5 mg dans 1,3 mL de DMSO pour obtenir 10 mM de solution mère. Aliquote et congélation à &minus ; 80 &°C. Diluer à 1:1000 pour l’utilisation. (concentration de travail 10 &mu ; M)
Remplisseuse de pipettes sérologiqueFisher Scientific14-387-166
Filtre supérieur à tube sous vide SteriflipSigma-AldrichSE1M179M6
Hottes de culture cellulaire stérilesBaker CompanySG-600
Trypan blue solution (0,4 %)Thermo Fisher15250061
Trypsine-EDTA (0,25 %)Thermo Fisher25200056
Stéréomicroscope zoomOlympusSZ61/SZ51Maintenu en flux laminaire banc propre

Références

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