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Imagerie tridimensionnelle des tissus de l’aorte dans l’athérosclérose

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DOI :

10.3791/67400

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25 octobre 2024

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1Division of Vascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig-Maximilians-University, 3Institute of Precision Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons des protocoles optimisés de nettoyage des tissus pour imager l’aorte murine en trois dimensions (3D). Nous décrivons des procédures de pointe pour l’immunomarquage, la clairance optique et l’imagerie dans le but de définir la proximité anatomique du système nerveux périphérique avec les plaques d’athérosclérose et l’adventice dans l’athérosclérose.

Résumé

Des recherches récentes ont fait progresser la compréhension de l’athérosclérose en tant que maladie inflammatoire chronique transmurale impliquant les trois couches de la paroi artérielle, y compris la plaque intima, la médiase et l’adventice, qui forme la couche de tissu conjonctif externe des artères. Nos études récentes ont suggéré que l’adventice est utilisée par le système nerveux périphérique comme conduit pour atteindre toutes les cellules tissulaires. Nous avons également constaté que le système nerveux périphérique, c’est-à-dire le système nerveux sensoriel et sympathique, subit des processus de remodelage majeurs impliquant la néogenèse des réseaux axonaux adjacents aux plaques d’athérosclérose. Dans ce contexte, la compréhension de la structure du réseau neuronal et de ses interactions avec les composants vasculaires des artères malades est porteuse de promesses majeures pour une meilleure compréhension de la pathogenèse des maladies cardiovasculaires. Pour atteindre ces objectifs, des méthodes permettant de visualiser l’architecture subcellulaire des artères saines et malades intactes ainsi que de leurs compartiments périvasculaires environnants sont nécessaires. Le nettoyage des tissus permet d’obtenir une imagerie intacte des tissus profonds de plus grands compartiments tissulaires qui sont autrement inaccessibles. Il permet l’imagerie volumétrique des artères intactes grâce à l’intégration d’outils de marquage, de dégagement, d’imagerie microscopique avancée et de traitement d’image. Ici, nous décrivons deux approches distinctes mais complémentaires de clarification passive des tissus, à savoir la clarification aqueuse du 2,2-thiodiéthanol (TDE) et l’imagerie tridimensionnelle de l’organe clairci par solvant (iDISCO) pour imager des segments aortiques isolés ou une aorte entière in situ chez la souris entière.

Introduction

Les techniques histologiques permettent d’acquérir une compréhension de base des échantillons biologiques grâce à la coupe de tissus/organes. Cependant, la délimitation des interactions anatomiques complexes cellule/cellule et tissu/tissu en trois dimansions (3D) était - jusqu’à récemment - difficile à réaliser. Ce besoin non satisfait était particulièrement évident dans le contexte du système cardiovasculaire dans des conditions saines et malades. L’imagerie de tissus intacts a été difficile dans le passé en raison de l’absorption et de la diffusion de la lumière, ce qui les rend intrinsèquement opaques. Le nettoyage des tissus rend l’échantillon biologique intact transparent en minimisant ces limitations. Les développements récents dans les techniques de clarification tissulaire permettent l’imagerie 3D à haute résolution de tissus transparents non sectionnés pour fournir des informations considérables sur la microarchitecture cellulaire et structurelle d’organes entiers à une résolution micrométrique, permettant ainsi la définition de réseaux de connectivité anatomique.

L’athérosclérose implique trois couches de la paroi artérielle, y compris la couche interne de l’intima, la couche médiale intermédiaire et la couche externe du tissu conjonctif, appelée adventice. Les plaques d’athérosclérose dans la couche interne des artères sont une cible conventionnelle de la recherche depuis des décennies 1,2. Cependant, la couche adventice contient des vaisseaux sanguins, des vaisseaux lymphatiques et des fibres nerveuses du système nerveux périphérique. De plus, l’adventice est liée au tissu adipeux périvasculaire et aux composants du tissu neuronal, y compris les nerfs périphériques et les ganglions périvasculaires 3,4. Les nerfs périphériques sont connus pour utiliser les adventices comme conduits pour atteindre les tissus cibles éloignés et, en fait, les cellules5. Nos études récentes ont fait progresser la compréhension des interactions à plusieurs niveaux des principaux systèmes biologiques, qui comprennent le système immunitaire, le système nerveux et le système cardiovasculaire. Nous avons appelé ces interactions interfaces neuro-immunes-cardiovasculaires 6,7. Au cours de l’athérogenèse, les composants de la paroi artérielle subissent une restructuration et un remodelage robustes. Par exemple, parallèlement à la progression de la plaque d’athérosclérose dans l’intima, des agrégats de cellules immunitaires se forment et une néogenèse axonale neuronale se produit dans l’adventice aortique murine 6,8,9. Au fur et à mesure que l’athérosclérose progresse, les agrégats de cellules immunitaires se transforment en organes lymphoïdes tertiaires artériels (ATLO) bien structurés avec des zones distinctes de lymphocytes T, de lymphocytes B et de plasmocytes10. Cependant, il a été difficile de délimiter ces changements en 3D, l’imagerie à haute résolution des tissus intacts en raison de la perméabilisation insuffisante de la membrane et de la diffusion inhérente de la lumière11. Les approches de nettoyage des tissus ont surmonté les principales limites des approches histologiques conventionnelles 11,12,13,14,15 avec une pénétration accrue des anticorps pour pénétrer profondément dans les tissus ou les organes intacts en ajustant uniformément l’indice de réfraction (IR), ce qui permet d’obtenir des images de résolution micrométrique avec une profondeur d’imagerie plus élevée dans les voxels. Les IR des échantillons peuvent être adaptés soit au glycérol (RI 1,46), soit à l’huile d’immersion (RI 1,52), réduisant ainsi considérablement la diffusion de la lumière et les aberrations sphériques, permettant une haute résolution. Les progrès récents dans les techniques de clarification de l’organe entier ou du tissu du corps entier, telles que le 2,2-thiodiéthanol à base aqueuse (TDE) et l’imagerie 3D des organes clairsemés par solvant (iDISCO), respectivement, ainsi que les techniques d’imagerie volumétrique (y compris l’imagerie confocale, multiphotonique et la microscopie à feuillet de lumière) ont permis de reconstruire la microanatomie de l’architecture vasculaire en construisant leur atlasde connectivité 11,16. La visualisation de ces connexions cellulaires et structurelles en 3D peut fournir de nouvelles informations pour répondre à des questions biologiques jusqu’ici sans réponse.

Protocole

La présente étude a été réalisée conformément aux directives du comité local et national d’utilisation et de soin des animaux. Des souris mâles Apoe-/- hyperlipidémiques sur fond C57BL/6J maintenues avec un régime alimentaire standard pour rongeurs qui développent spontanément de l’athérosclérose au cours du vieillissement ont été utilisées dans la présente étude.

1. Imagerie complète de l’aorte isolée et élimination du TDE

  1. Préparation des tissus
    1. Préparez l’anesthésique à raison de 150 mg/kg de kétamine et de 30 mg/kg de xylazine (voir le tableau des matériaux) par souris. Anesthésier profondément les souris par injection intrapéritonéale et le confirmer par l’absence de réaction au test de douleur profonde.
      REMARQUE : La concentration et le volume d’injection sont les suivants : Kétamine 100 mg/mL ; Xylazine 20 mg/mL ; Volume d’injection 50:50 par volume mélange de kétamine et de xylazine à 3 μL/g.
    2. Placez la souris sur une plaque de mousse recouverte d’essuie-tout chirurgical et fixez les bras et les jambes en position couchée avec des rubans. Désinfectez le thorax avec de l’éthanol à 75 % (voir le tableau des matériaux) et prélevez du sang par le ventricule gauche à l’aide d’une seringue jetable de 1 mL afin d’éliminer le sang et d’obtenir une meilleure perfusion.
      REMARQUE : Le prélèvement de sang cardiaque par thoracotomie peut également être utilisé.
    3. Faites une incision médiane sur la poitrine pour exposer le cœur et une petite incision dans l’oreillette droite pour permettre la perfusion transcardiaque. Perfuser la souris par le ventricule gauche avec 10 ml d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 5 mM ; voir le tableau des matériaux) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 min, suivie de 20 mL de PBS pendant 5 à 10 min jusqu’à ce que le sang soit évacué. Enfin, perfuser avec 10 ml de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 20 min.
      REMARQUE : Toutes les procédures peuvent être effectuées avec une pompe de perfusion péristaltique avec une pression de 100-125 mm Hg à température ambiante (RT). L’aiguille de perfusion est insérée dans le cœur de la souris par le même trou que l’extraction du sang.
    4. Enlever les organes internes, y compris la rate, le foie, les poumons et les organes gastro-intestinaux et reproducteurs, à l’aide d’instruments chirurgicaux. Gardez le cœur, l’aorte et les reins intacts in situ.
      REMARQUE : Les instruments chirurgicaux utilisés pour la dissection et l’ablation d’organes sont les ciseaux de dissection, les ciseaux à iris fins, les ciseaux à ressort, les pinces émoussées, les pinces courbes et les pinces fines incurvées.
    5. Exposez toute l’aorte, de l’aorte ascendante à la bifurcation iliaque, sous le stéréomicroscope disséquant (grossissement de 30-40x). Retirez soigneusement le thymus et le tissu adipeux sans blesser l’aorte.
      REMARQUE : Attention à ne pas couper l’aorte. Pour les souris Apoe-/- , conservez le tissu adipeux périvasculaire minimal entouré de l’aorte pour la structure connectée.
    6. Récoltez toute l’aorte dans une boîte de Pétri remplie de PBS. Séparez l’aorte en différents segments et fendez toute l’aorte longitudinalement à l’aide d’un iris ou de ciseaux à ressort pour exposer la surface intimale en suivant la séquence et la direction indiquées à la figure 1A pour le dégagement de la TDE.
    7. Épinglez l’aorte sur la plaque de cire noire plate en forme de Y, comme indiqué sur la figure 1A. Postfixez-le dans 4 % de PFA pendant la nuit à 4 °C.
      REMARQUE : Épinglez l’aorte à la plaque de cire avant la fixation pour éviter de plier et de gonfler dans les étapes suivantes.
    8. Détachez l’aorte et transférez-la dans le PBS. Lavez soigneusement l’aorte pendant 5 minutes pour 5 fois.
      REMARQUE : Transférez l’aorte dans différents tubes remplis de PBS à chaque fois pour le lavage.
  2. Coloration par anticorps pour l’aorte intra-faciale
    REMARQUE : Toutes les étapes d’incubation sont effectuées dans des tubes de 2 mL avec rotation douce ou agitation à RT.
    1. Transférez l’aorte fixe dans une solution de blocage pendant 2 h pour le blocage et la perméabilisation.
      REMARQUE : La solution de blocage varie en fonction des anticorps primaires et secondaires. Par exemple, solution bloquante : 0,5 mg/mL de CD16/32 (1:100), 10 % de sérum d’âne normal, 2 % de Triton X-100 dans du PBS (voir tableau des matériaux)
    2. Incuber l’aorte avec des anticorps primaires dans la solution bloquante ci-dessus (étape 1.2.1), par exemple CD3e (dilution 1:100), NF200 (dilution 1:200) et B220 (dilution 1:200) pendant 24 h (voir le tableau des matériaux). Lavez l’aorte dans du PBS pendant 5 minutes pour 5 fois.
    3. Incuber l’aorte avec des anticorps secondaires dans du sérum d’âne normal à 10 % (dilution 1:300) et du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI ; 1 mg/mL) pour la coloration nucléaire pendant la nuit (voir le tableau des matériaux). Lavez l’aorte dans du PBS pendant 5 minutes 5 fois et conservez l’aorte dans du PBS à 4 °C jusqu’à la procédure de nettoyage des tissus.
      REMARQUE : Transférez l’aorte dans différents tubes remplis de PBS à chaque fois pour le lavage. Couvrez les tubes avec du papier d’aluminium pour les garder dans l’obscurité pour l’étape 1.2.3.
  3. Élimination des tissus TDE
    REMARQUE : Toutes les étapes d’incubation sont effectuées dans des tubes de 2 mL à verrouillage sûr, tournant doucement à RT et recouverts de papier d’aluminium dans l’obscurité. Les solutions de travail TDE (voir Tableau des matériaux) sont très perméables et doivent être manipulées avec précaution dans une hotte. Collectez et jetez les déchets conformément aux réglementations locales.
    1. Transférez l’aorte colorée dans des solutions de travail à 20 % de TDE et incubez pendant 1 h.
    2. Transvasez l’aorte dans des solutions de travail à 47 % de TDE et incubez pendant 12 h. Transvasez l’aorte dans des solutions de travail à 60 % de TDE et incubez pendant 24 à 36 h jusqu’à ce que les échantillons deviennent transparents à la lumière visible pour correspondre à l’IR.
    3. Conservez l’aorte dans 60 % de TDE à RT dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie.
      REMARQUE : Actualisez les solutions de travail toutes les 30 minutes pour la période d’incubation à court terme (par exemple, étape 1.3.1) et toutes les 4 heures pour les solutions d’incubation à long terme (par exemple, étape 1.3.2). Le temps d’incubation de chaque étape peut être ajusté en fonction de la taille des tissus pour obtenir une meilleure pénétration des anticorps ou une transparence claire. Pour l’aorte de souris Apoe-/- entourée de tissu adipeux, le temps d’incubation doit être prolongé de manière appropriée.
  4. Imagerie de l’aorte clairsante TDE à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (CLSM)
    1. Utilisez des puits d’espacement d’imagerie rectangulaires collants double face d’une épaisseur de 0,2 mm disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Collez le puits sur une lame de verre propre et transférez l’aorte dégagée. Assurez-vous que l’adventice aortique en face fait face à la lamelle.
      REMARQUE : Tapotez doucement l’aorte en face à plat avec le côté abluminal de l’aorte en face sur le dessus à l’aide d’une pince inclinée. Empilez plusieurs puits d’espacement d’imagerie pour correspondre à la taille du tissu si nécessaire.
    2. Montez l’aorte avec des gouttes de solution TDE à 60 %. Fixez soigneusement une lamelle sur le puits, en évitant les bulles d’air entre l’échantillon et la lamelle.
      REMARQUE : Retirez soigneusement les bulles avec une aiguille avant la lamelle. N’utilisez pas une quantité excessive de solution de montage, car l’échantillon pourrait flotter.
    3. Utiliser un instrument CLSM inversé (voir tableau des matériaux) équipé d’un objectif (multi) d’immersion 20x (NA : 0,75).
      REMARQUE : Le CLSM permet l’imagerie volumétrique jusqu’à 70 μm de profondeur avec une résolution plus élevée, ce qui est nécessaire pour l’analyse du diamètre des nerfs et de l’interaction entre les cellules nerveuses et immunitaires dans l’adventice aortique.
    4. Sélectionnez l’objectif d’immersion 20x/0,75 (huile). Réglez les détecteurs à diodes hybrides en fonction des colorants colorés. Ajustez les paramètres d’affichage et sélectionnez le format XY 1024 x 1024 pixels pour l’imagerie.
      REMARQUE : Un objectif à immersion dans l’huile capture les signaux mieux que l’eau.
    5. Déposez l’huile d’immersion (avec glycérol) uniformément le long de l’aorte sur la lamelle. Déplacez grossièrement l’objectif 63x vers l’échantillon jusqu’à ce qu’il touche l’huile d’immersion/lamelle.
    6. Déplacez finement l’objectif 63x sous le microscope pour localiser la région d’intérêt. Acquérez une pile Z du côté adventice de l’aorte en face à une taille de pas de 2 à 4 μm jusqu’à une profondeur de 60 μm pour l’imagerie 3D.
    7. Nommez le fichier avec les détails de l’échantillon, numérisez les détails et enregistrez les données.
  5. Imagerie de l’aorte clairsante du TDE à l’aide d’un microscope multiphotonique
    1. Suivez les étapes 1.4.1-1.4.2 pour monter l’aorte en face sur la glissière.
    2. Utilisez un microscope multiphotonique droit (voir tableau des matériaux) équipé d’un objectif 20x (immersion dans l’eau, NA : 1,00, distance de travail = 2 mm), permettant une imagerie volumétrique jusqu’à 1,5 mm de profondeur.
    3. Acquérez des empilements Z du côté abluminal à une taille de pas de 10 à 15 μm jusqu’à une profondeur de 700 μm. Nommez le fichier et enregistrez les données comme à l’étape 1.4.7.

2. Immunocoloration du corps entier et nettoyage des tissus iDISCO

  1. Préparation des tissus
    1. Suivez les étapes 1.1.1 à 1.1.3 ci-dessus pour l’anesthésie, la réparation de la souris et la perfusion.
    2. Enlevez la peau et les organes internes, y compris la rate, le foie, les poumons et les organes gastro-intestinaux et reproducteurs, à l’aide d’instruments chirurgicaux. Gardez le cœur, l’aorte et les reins intacts in situ.
    3. Disséquez la partie du corps au-dessus du niveau du diaphragme et fixez la partie inférieure du corps avec 4 % de PFA pendant 1-2 jour (s) à 4 °C.
      REMARQUE : Effectuez la fixation, les lavages et les incubations dans des tubes de 50 mL sur un agitateur tournant doucement. Rafraîchissez la solution dans de nouveaux tubes 2 à 3 fois.
    4. Lavez soigneusement l’échantillon pendant 10 min 3 fois à RT.
      REMARQUE : Transférez l’aorte dans différents tubes remplis de PBS à chaque fois.
    5. Incuber l’échantillon dans une solution d’imagerie cerveau/corps à 20 % claire et non obstruée et une solution d’analyse computationnelle (CUBIC) pendant 48 h pour la décoloration.
      REMARQUE : Pour une solution CUBIQUE à 20 %, dissoudre 25 g d’urée dans 15 mL de Triton X-100 et 28 mL de Quadrol, et ajouter du PBS au volume final de 100 mL. Préparez-le dans la hotte car les ingrédients sont stimulants (voir Tableau des matériaux).
    6. Laver soigneusement l’échantillon pendant 1 h cinq fois dans du PBS à RT.
  2. Coloration des anticorps
    REMARQUE : Toutes les étapes d’incubation sont effectuées dans des tubes de 50 mL avec rotation douce ou agitation à 4 °C.
    1. Incuber l’échantillon dans une solution de gélatine-Triton X-100-sérum (PGST) PBS pendant la nuit pour la perméabilisation et le blocage.
      REMARQUE : La solution de blocage varie en fonction des anticorps. Par exemple, solution bloquante : PBS-gélatine-Triton X-100-sérum (PGST, voir tableau des matériaux) solution : 0,2 % de gélatine de peau de porc, 0,5 % de Triton X-100 et 5 % de sérum de chèvre dans du PBS.
    2. Incuber l’échantillon avec des anticorps primaires dans une solution de PGST, par exemple NF200 (dilution 1:200, voir tableau des matériaux) à 4 °C, et agiter doucement pendant 10 à 12 jours. Ensuite, lavez soigneusement l’échantillon dans PGST pendant 1 h 5 fois à RT.
    3. Incuber l’échantillon avec une solution secondaire d’anticorps (dilution 1:300) et du DAPI (1 mg/mL) dans du PGST à 4 °C pendant 7 jours.
    4. Lavez soigneusement l’échantillon dans le PGST pendant 1 h 5 fois à l’heure de la RT. Transférez l’échantillon dans le PBS et conservez l’aorte dans le PBS à 4 °C pour les étapes suivantes.
      REMARQUE : Couvrez les tubes avec du papier d’aluminium pour les garder sombres pour les étapes 2.2.3-2.2.4.
  3. Clarification tissulaire iDISCO modifiée
    REMARQUE : Pendant le nettoyage, les tubes doivent être recouverts d’une feuille d’aluminium pour éviter le blanchiment/extinction du signal dû à l’exposition directe à la lumière naturelle/artificielle. Tous les réactifs organiques utilisés dans le nettoyage DISCO sont nocifs, et toutes les étapes de nettoyage doivent être effectuées dans une hotte. Portez une blouse de laboratoire, des gants et un masque lorsque vous manipulez les réactifs pour éviter l’inhalation et le contact avec la peau et les yeux. Collectez et déversez les déchets de nettoyage dans les conteneurs à déchets appropriés dans la hotte.
    1. Transvaser les échantillons colorés de l’étape 2.2.4 dans une série de concentrations accrues de solutions de travail de tétrahydrofurane (THF, voir le tableau des matériaux) pour la déshydratation, c’est-à-dire 50 %, 70 %, 90 % et 100 % (deux fois 100 %). Incuber pendant 12 h par concentration.
      REMARQUE : Diluez le réactif THF (99 %-100 %) dans de l’eau distillée pour des solutions de travail de différentes concentrations dans la hotte. Actualisez les solutions de travail toutes les 6 h.
    2. Transférez l’échantillon dans une solution de dichlorométhane absolu (DCM, voir tableau des matériaux) pendant 3 h pour l’élimination des lipides.
    3. Transvaser l’échantillon dans une solution de travail BABB (benzyl-alcool-benzyl-benzoate) correspondante (voir le tableau des matériaux). Incuber pendant 3 à 6 h jusqu’à ce que le tissu soit translucide et presque transparent à la lumière visible.
      REMARQUE : Pour préparer la solution de travail BABB, mélangez 1 partie d’alcool benzylique et 2 parties de benzoate de benzyle (1:2) dans une bouteille en verre. Secouez-le doucement pendant 5 min dans la hotte.
  4. Imagerie des tissus clairseurs iDISCO à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière
    REMARQUE : Imagez l’échantillon effacé dès qu’une transparence optimale est atteinte. Un microscope à feuillet de lumière, tel qu’un ultramicroscope-II (voir Tableau des matériaux), est utilisé pour l’imagerie. Remplissez le réservoir d’imagerie avec la solution de clarification finale, la solution BABB. Veillez à ne pas renverser BABB sur l’instrument pour éviter de l’endommager.
    1. Utilisez un objectif à air 1x pour des images à faible grossissement couvrant toute la largeur de l’échantillon. Transférez délicatement l’échantillon de la solution éclaircissante sur un chiffon en papier et séchez-le brièvement.
      REMARQUE : Utilisez une pince émoussée pour éviter de presser l’échantillon.
    2. Sélectionnez un porte-échantillon de taille appropriée en fonction de la taille de l’échantillon/du tissu et fixez la face arrière de l’échantillon au porte-échantillon avec de la super-colle.
      REMARQUE : Attendez 1 à 2 minutes jusqu’à ce que l’échantillon soit fermement fixé au porte-échantillon.
    3. Remplissez le réservoir d’imagerie du microscope à feuillet de lumière avec la solution BABB et placez-y délicatement l’échantillon. Ajustez le porte-échantillon pour vous assurer que l’échantillon est perpendiculaire à la feuille lumineuse et qu’il est correctement éclairé.
    4. Abaissez l’objectif de mise au point de l’échantillon et ajustez les paramètres d’affichage tout en faisant la mise au point pour afficher correctement l’échantillon. Sélectionnez la ou les feuilles de lumière appropriées dans le logiciel du microscope et ajustez leur largeur pour éclairer uniformément tout le champ de vision.
      REMARQUE : Dans un système d’ultramicroscope avec éclairage laser des deux côtés, commencez par aligner et focaliser le laser d’un côté. Une fois les deux côtés réglés, activez les lasers des deux côtés pour observer une image de balayage fusionnée des deux éclairages.
    5. Sélectionnez un canal rouge lointain (680 nm) pour imager les structures neuronales colorées par NF200 et un canal d’autofluorescence (488 nm) pour imager l’aorte et les tissus conjonctifs non colorés. Ajustez la puissance laser en fonction de l’intensité du signal fluorescent pour un rapport signal/bruit optimal, du temps d’exposition et de la largeur de la ou des feuilles de lumière.
    6. Sélectionnez le mode de balayage x-y-z. Réglez le balayage z-stack avec un pas z de 2 à 8 μm et sélectionnez un chevauchement de 25 % à 60 % le long de l’axe Y longitudinal des balayages de tuiles (16 bits) couvrant les surfaces ventrale et dorsale des échantillons pour imager l’ensemble du volume de l’échantillon (jusqu’à 6-8 mm de profondeur).
    7. Nommez le balayage avec des informations détaillées, y compris la date du balayage, le nom de l’échantillon, l’anticorps utilisé, l’objectif, le facteur de zoom, les pas z et les lasers utilisés. Enregistrez les données.
    8. Passez à un grossissement plus élevé (2x ou 4x) via la fonction de zoom avant pour imager des régions corporelles spécifiques d’intérêt.
    9. Suivez les étapes 2.4.4 à 2.4.7 ci-dessus pour l’imagerie et enregistrez les données.

3. Traitement et analyses d’images

REMARQUE : Une station de travail de traitement haute puissance est nécessaire pour le traitement. Assurer la sauvegarde des données immédiatement après le traitement en raison du volume élevé d’images (5 à 100 Go par image).

  1. Traitement d’images CLSM et multiphotoniques
    1. Chargez les images en mosaïque Z-stack des microscopes CLSM et multiphotoniques sur le poste de travail de traitement d’images équipé du logiciel Las X, Imaris (logiciel d’analyse d’images) ou Fiji pour la visualisation, la segmentation et la quantification 3D et bidimensionnelle (2D).
    2. Pour coder en couleur la profondeur volumique d’une cellule ou d’une structure, utilisez un logiciel de restauration d’image (voir Table des matériaux) pour déconverrouiller l’image brute et générer une projection d’intensité maximale des données déconvolutées en utilisant le codage couleur temporel en Las X ou Fidji.
  2. Traitement d’images de feuillette
    1. Chargez la série d’images TIFF en mosaïque Z dans le logiciel Fiji. Assemblez des images avec le plugin d’assemblage de Fiji et enregistrez les images assemblées au format TIFF.
      REMARQUE : Si nécessaire, compressez les images assemblées au format LZW pour permettre un traitement rapide avec différents logiciels.
    2. Chargez les images assemblées dans un logiciel de visualisation 3D (voir Table des matériaux) pour la segmentation des images. Tracez manuellement les structures neuronales et vasculaires dans l’axe x-y-z. Pour le traçage manuel de petites fibres nerveuses, sélectionnez manuellement les signaux NF200+ pixel par pixel dans chaque plan z le long de tout le trajet de la fibre nerveuse entre l’aorte et les ganglions.
    3. Chargez des images prétraitées dans un logiciel d’analyse d’images (voir la table des matériaux) pour la génération de vidéos, la visualisation 2D et 3D des images.
    4. Utilisez l’autofluorescence pour segmenter l’aorte et les tissus conjonctifs, y compris les ganglions lymphatiques et les muscles, dans le logiciel d’analyse d’images. Appliquez des pseudo-couleurs distinctes dans le logiciel d’analyse d’images pour visualiser des segments aortiques distincts tels que la paroi aortique et la plaque.
    5. Utilisez la fonction d’égalisation d’histogramme adaptative à contraste limité (CLAHE) dans le logiciel Fiji pour améliorer le contraste local sur l’arrière-plan des images traitées.

Résultats

Pour démontrer la microanatomie de l’aorte intacte saine et malade et pour révéler les connectivités physiques entre le système immunitaire, le système nerveux et le système cardiovasculaire dans des modèles murins d’athérosclérose, nous avons utilisé deux approches complémentaires de clarification tissulaire : la clarification TDE de l’aorte isolée et la clarification iDISCO de la souris entière (Figure 1). Après une immunocoloration complète, l’aorte endofaciale a été éliminée avec une série de solutions de travail TDE. L’IR est apparié à 1,4-1,5, en fonction de la concentration TDE de l’étape finale, pour obtenir une transparence optimale du tissu aortique sans modifier son volume (Figure 1A). Contrairement à la clairance TDE, le protocole de clarification iDISCO comprend des étapes de décoloration et de perméabilisation avant l’immunocoloration complète, suivies d’une délipidation et d’une déshydratation à l’aide de différents solvants chimiques, et de l’appariement RI à 1,56 (Figure 1B). Le dégagement iDISCO permet de visualiser des tissus de grande taille et même l’ensemble du corps de la souris en raison du rétrécissement du tissu.

L’imagerie 3D confocale et multiphotonique de l’aorte intégrale en face nettoyée par TDE permet de visualiser les structures, y compris les plaques intimales, la cellularité de l’adventice et les projections neuronales de l’adventice, entre autres structures, tandis que l’imagerie par feuillet de lumière de la souris dégagée iDISCO permet la visualisation et la reconstruction de l’arbre artériel ainsi que du tissu adipeux périvasculaire, des ganglions lymphatiques rénaux et des composants neuronaux associés, y compris les nerfs et les ganglions (Figure 1C). Par exemple, l’imagerie confocale de l’aorte athéroscléreuse éliminée par TDE a détecté plusieurs lymphocytes T colorés au CD3e dans la plaque et une néogenèse étendue de fibres nerveuses colorées à NF200 de différents diamètres dans les ATLO, tandis que l’imagerie multiphotonique de l’aorte abdominale malade du mont entier éliminée par TDE de souris Apoe-/- âgées a montré la territorialité de la germination axonale exprimant NF200 dans les zones de lymphocytes T négatifs B220 au sein des ATLO (Figure 2A). À l’inverse, l’imagerie à feuillet lumineux d’iDISCO a permis de visualiser la relation spatiale entre l’aorte et les ganglions sympathiques adjacents. La segmentation et le traçage d’images 3D d’axones individuels des ganglions à la surface aortique ont révélé une restructuration neuronale robuste, y compris des axones nouvellement formés et colorés à la NF200 dans l’aorte adventice adjacente à la plaque d’athérosclérose (Figure 2B).

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Figure 1 : Déroulement de l’étude. (A) Élimination aqueuse de l’aorte face à l’EDT. (B) Nettoyage iDISCO à base de solvant de la souris entière. (C). 3D l’imagerie volumétrique et le traitement d’images d’échantillons isolés d’aorte ou de souris entières optiquement clairs. Cette figure a été modifiée avec la permission de Sun et al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Exemple d’images 3D de tissus éliminés par TDE et iDISCO. (A) Imagerie 3D de TDE éliminé dans l’aorte faciale. Panneau supérieur : Les images confocales ont montré des lymphocytes T CD3e+ (rouge, flèche) dans la plaque intimale et des axones nerveux NF200+ (vert) dans l’aorte adventice athéroscléreuse (ATLO) ; Panneau inférieur : Des images multiphotoniques ont montré des axones nerveux NF200+ (vert, pointes de flèches), des lymphocytes B B220+ (rouge, triangle ouvert), une génération de seconde harmonique dérivée du collagène (SHG, blanc) chez des souris Apoe-/- mâles de 78 semaines. Sytox (en bleu) et DAPI (en bleu) ont montré les noyaux. (B) Des images 3D reconstruites et segmentées d’iDISCO ont dégagé tout l’abdomen de la souris. Reconstruction, segmentation et traçage en 3D des nerfs et axones NF200+ (flèches, vert) et leur relation spatiale avec les ganglions sympathiques (pointes de flèches) de l’aorte abdominale intacte. Un triangle ouvert indiquait un axone nouvellement formé adjacent à des plaques d’athérosclérose. L’autofluorescence (auto) a été utilisée pour imager l’aorte et le tissu conjonctif, y compris la plaque (cyan) et le ganglion lymphatique rénal (RLN, bleu). CG, ganglions cœliaques, SycG, ganglions de la chaîne sympathique. Cette figure a été modifiée avec la permission de Mohanta et al.6 et de Sun et al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’athérosclérose peut être considérée comme une maladie inflammatoire transmurale des artères impliquant les trois couches de la paroi artérielle. De plus, les artères sont entourées par les tissus adipeux et neuronaux périvasculaires. Au cours de la progression de l’athérosclérose, chacun de ces tissus subit des altérations cellulaires et structurelles considérables, ce qui nécessite des méthodes pour acquérir un accès optique subcellulaire aux tissus intacts entourant les artères saines et malades. Ces méthodes sont présentées ici pour mieux comprendre les interactions cellule-cellule et cellule-tissu et pour faire progresser la compréhension de la pathogenèse des maladies cardiovasculaires. Le nettoyage des tissus et l’imagerie microscopique 3D qui s’ensuit permettent d’imager des compartiments tissulaires intacts à grande échelle, jusqu’alors inaccessibles, révélant des reconstructions détaillées des artères. Ici, nous présentons des protocoles pour les techniques de nettoyage des tissus TDE et iDISCO, soulignant leur efficacité et leur simplicité pour obtenir une transparence tissulaire presque complète, une imagerie efficace avec la microscopie confocale/multiphotonique ou à feuillet de lumière, et, en même temps, maintenir l’intégrité structurelle.

La clarification du TDE utilise un réactif soluble dans l’eau pour obtenir une transparence tissulaire en ajustant l’IR, préservant ainsi efficacement les signaux de fluorescence dans le tissu. Il s’agit d’une méthode efficace de nettoyage des tissus pour les vaisseaux sanguins de plus petite taille, c’est-à-dire un volume de tissu de taille micrométrique à millimétrique sans rétrécissement des tissus. Cependant, il nécessite un temps de traitement plus long pour les tissus plus gros, c’est-à-dire des volumes de tissus de l’ordre du millimètre au centimètre. Il est important de noter que la procédure peut être adaptée aux besoins de l’utilisateur en ajustant la concentration des réactifs et le temps d’incubation. D’autre part, iDISCO utilise une série de solvants organiques pour éliminer les lipides et l’eau, ce qui permet d’obtenir une meilleure transparence des tissus pour les tissus plus grands, les organes entiers, la souris entière ou les tissus humains plus grands. Il offre les avantages uniques d’un temps de traitement court et d’une aptitude à de grands volumes de tissus. Cependant, cela entraîne un rétrécissement des échantillons clairs, l’extinction des signaux de fluorescence et l’élimination des lipides, ce qui constitue une limitation majeure pour les tissus athéroscléreux riches en lipides. De plus, la microscopie à feuillet de lumière, contrairement à la microscopie confocale ou multiphotonique, ne peut pas visualiser les détails subcellulaires au niveau micrométrique et visualiser les projections neuronales de petit diamètre, telles que les axones uniques et leurs connexions avec d’autres cellules vasculaires.

L’innervation vasculaire joue un rôle important dans le développement de l’athérosclérose 6,7,18. L’étude de la distribution des nerfs périphériques le long de l’arbre artériel et de leurs changements aidera à comprendre la progression de la maladie. En raison de sa capacité de traitement efficace, iDISCO est couramment utilisé pour l’imagerie de l’ensemble du réseau vasculaire dans les modèles d’athérosclérose chez les rats et les souris 12,19,20,21, fournissant des images tridimensionnelles à haute résolution. Le TDE, quant à lui, convient aux études nécessitant la conservation de marqueurs fluorescents, comme l’observation de marqueurs neuronaux spécifiques, révélant ainsi avec précision la structure fine et les modifications de l’innervation vasculaire6. Les deux protocoles de nettoyage des tissus sont nécessaires car le nettoyage TDE n’implique pas de rétrécissement et peut imager les lipides, tandis que iDISCO entraîne un rétrécissement des tissus dû à la déshydratation et à la délipidation. De plus, le protocole iDISCO modifié peut être utilisé pour l’élimination des tissus cardiovasculaires humains22,23. Les deux techniques de nettoyage offrent des avantages complémentaires à l’étude du remodelage artériel dans l’athérosclérose. En combinant les forces des deux méthodes, une compréhension plus complète et plus approfondie des mécanismes pathologiques de l’athérosclérose peut être obtenue.

Déclarations de divulgation

SKM, CJY et AJRH sont les cofondateurs d’Easemedcontrol R & D GmbH and Co. KG.

Remerciements

Ce travail a été financé par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) SFB1123/Z1, le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK) DZHK 81X2600282 et une subvention de la Fondation Corona (S199/10087/2022) à SKM ; et ERA-CVD (PLAQUEFIGHT) 01KL1808 et une subvention gouvernementale à AJRH chez Easemedcontrol R & D GmbH and Co. KG.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2,2'-thiodiéthanol (TDE)Sigma  ;166782réactif de clarification
AmiraThermo Fisher Scientificlogiciel de visualisation 3D ; Logiciel de traitement d’images utilisé pour la segmentation manuelle et le traçage dans les images 3D
Alcool benzyliqueSigma  ;W213713Réactif d’élimination
Benzyl benzoateSigmaB6630Réactif d’élimination
CD16/32eBioscience14-0161-82Solution bloquante
Microscope confocal à balayage laser  ;Leica MicrosystemsTCS-SP8 3XAppareil d’imagerie pour l’imagerie multidimensionnelle haute résolution de tissus biologiques intacts ou de coupes avec une haute spécificité à résolution subcellulaire.
DAPIInvitrogenD3571Marqueur de noyaux
Dichlorométhane (DCM)Sigma  ;270997Réactif nettoyant
Dissection de la cire pan-noire  ;Thermo Scientific  ;S17432Dissection et fixation de l’aorte  ;
Stéréomicroscope de dissectionLeica Microsystems  ;Stemi 2000Dissection d’organes
de souris Éthanol  ;SigmaE7023Défection
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Roth  ;8040.1Tampon de perfusion  ;
Fidji  ;(ImageJ, NIH)Logiciel de traitement d’images open source pour les images 2D et 3D
Chèvre anti-hamster IgG, Cy3Dianova  ;127-165-099Anticorps secondaire
Chèvre anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 680Thermo Fisher Scientific / InvitrogenA-21109Anticorps secondaire  ;
Chèvre anti-Rat IgG, Cy5Dianova712-175-150Anticorps secondaire
Hamster Anti-CD3e  ;BD Bioscience145-2C11  ;Marqueur de cellules Pan-T
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging, Pays-BasVersion 19.10Logiciel de restauration d’images ; Logiciel de traitement d’images utilisé principalement pour la déconvolution d’images 2D et 3D Poste de
travail de traitement d’imagesMIFCOM  ;MIFCOM X5équipée de tous les logiciels de traitement d’images, y compris la suite d’applications Leica X, Fiji et Imaris pour le post-traitement des images acquises par microscopes confocaux, multiphotoniques et à feuillets de lumière
ImarisBitplaneVersion 8.4Logiciel d’analyse d’images ; Logiciel de traitement d’images utilisé pour la segmentation automatisée d’images 3D
Incubateur et rotateur  ;Marshall Scientific  ;Innova 4230Dispositif d’incubation et de rotation pendant l’élimination des tissus
iSpacerSunjin LabIS4020Rectangulaire ainsi que le porte-échantillon
KétamineLivistoAnesthésique
Leica Application Suite X (LAS-X)  ;Leica MicrosystemsVersion 3.5Logiciel de traitement d’images pour les images acquises avec le microscope Leica
Microscope optiqueLeica MicrosystemsDM LBAppareil d’imagerie pour l’imagerie lumineuse stratifiée
MicroscopeLaVision BioTechUltramicroscope IITechnique d’imagerie pour l’imagerie rapide et haute résolution de grands spécimens biologiques ou de souris entières avec une faible exposition à la lumière en acquérant rapidement des images de coupes optiques minces.
Microscopie multiphotoniqueLeica MicrosystemsTCS-SP5II MP  ;Modalité d’imagerie pour l’imagerie multidimensionnelle à haute résolution de tissus biologiques intacts et viables au niveau subcellulaire et moléculaire sur des périodes prolongées, profondément dans l’échantillon et avec une invasion minimale.
Sérum de chèvre normal  ;SigmaG9023Solution bloquante
Paraformaldéhyde (PFA)  ;Sigma  ;P-6148  ;Fixation  ;
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma  ;P4417-100TAB  ;Tampon de lavage
Gélatine de peau de porcSigma  ;G1890Tampon d’incubation
QuadrolSigma122262CUBIC réactif d’élimination
Lapin Anti-NF200SigmaN4142Marqueur pan-neuronal
Rat Anti-B220  ;BD BioscienceRA3-6B2Marqueur de cellules Pan-B
SaccharoseSigma  ;90M003524V  ;Déshydratation
SytoxThermo Fisher ScientificS11380Marqueur de noyaux
TétrahydrofuraneSigma  ;401757Réactif de nettoyage  ;
Triton X-100Roth  ;3051.1
Pénétration de l’uréesigma  ;U5128CUBIC réactif de clarification
Xylène  ;Fisher Chemical  ;x/0250/17  ;Anesthésique  ;
Station de traitement d’images

Références

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