Ce protocole décrit une méthode unique de construction d’un modèle orthotopique du cancer superficiel de la vessie.
Article de méthode
Etablissement d’un modèle murin de cancer de la vessie superficielle au moyen d’une technique d’administration de cellules intravésicales
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cette étude présente une méthode innovante pour établir un modèle de tumeur orthotopique de la vessie murine avec une efficacité élevée et une localisation tumorale précise. Après avoir anesthésié des souris femelles C57BL/6J en position couchée, une aiguille intraveineuse de 24 G est insérée dans la vessie pour évacuer son contenu. Une aiguille de distribution de 34 G est ensuite introduite à travers le cathéter, tournée cinq fois pour créer une lésion focale de la muqueuse du dôme de la vessie, puis retirée. La suspension cellulaire MB49 est aspirée et reliée à une aiguille de distribution de 30 G, qui est insérée dans la vessie via le cathéter. Les cellules tumorales sont injectées sous-muqueusement dans la vessie sous pression. Cette technique entraîne un traumatisme minimal pour les souris, un taux élevé d’absorption de la tumeur et un emplacement fixe de la tumeur. Il se caractérise par sa simplicité et son excellente reproductibilité. Ce modèle fournit une plate-forme expérimentale idéale pour développer des thérapies intravésicales pour le cancer de la vessie, facilitant l’avancement et l’optimisation des stratégies de traitement de cette tumeur maligne.
Introduction
Le cancer de la vessie représente un fardeau important pour la santé mondiale, avec des disparités notables selon le sexe en matière d’incidence et de pronostic. Cette malignité est caractérisée par des sous-types moléculaires distincts, chacun associé à diverses voies pathogènes. Les caractéristiques moléculaires et pathologiques diffèrent considérablement entre le cancer de la vessie non invasif sur le plan musculaire (NMIBC) et le cancer de la vessie invasif sur le plan musculaire (MIBC)1,2. Le NMIBC représente environ 75 % des cas, avec des tumeurs d’origine épithéliale transitionnelle qui restent localisées sans métastases ni propagation. À l’inverse, la MIBC se caractérise par l’infiltration de cellules cancéreuses dans la couche musculaire de la vessie, accompagnée d’un risque élevé de dissémination, nécessitant fréquemment une cystectomie en pratique clinique3.
Dans la recherche préclinique, des modèles qui représentent avec précision le stade superficiel de la maladie sont essentiels pour évaluer les traitements médicamenteux. La mise en place d’un modèle in situ de carcinome superficiel de la vessie est donc d’une importance capitale, car elle constitue un outil de recherche essentiel pour le développement de médicaments cliniques et de thérapies innovantes par instillation.
Le développement de modèles murins de cancer de la vessie orthotopique a toujours été confronté à des défis. Les modèles induits chimiquement commencent souvent par des tumeurs superficielles, mais peuvent évoluer vers des formes invasives, avec une variabilité qui limite leur utilité dans les expériences à grande échelle4. Les modèles d’implantation orthotopique traditionnels, qui reposent sur l’injection de cellules tumorales à travers la paroi de la vessie5, ont du mal à reproduire fidèlement le cancer superficiel de la vessie. Des méthodes alternatives, y compris les lésions de la muqueuse combinées à l’instillation de cellules tumorales 6,7,8,9,10, ont été tentées mais sont limitées par des taux de mortalité élevés et de faibles taux d’absorption de tumeurs, ce qui entrave leur application plus large.
Cette étude vise à développer une nouvelle méthode de construction d’un modèle de cancer de la vessie superficiel qui démontre une plus grande stabilité, une mortalité plus faible et un positionnement tumoral fixe par rapport aux modèles existants. En obtenant une représentation plus précise de la maladie à ses débuts, le modèle actuel est sur le point d’améliorer l’évaluation rigoureuse des interventions préventives et thérapeutiques, faisant ainsi progresser le traitement du cancer de la vessie.
Protocole
Tous les protocoles et procédures d’expérimentation animale ont été approuvés par le Comité d’examen éthique de l’expérimentation animale de l’Université de médecine de Tianjin, Tianjin, Chine (numéro d’approbation SYXK : 2020-0010). Des souris femelles C57BL/6J âgées de six à huit semaines ont été utilisées pour cette étude. Les animaux ont été logés dans des conditions environnementales contrôlées, y compris un cycle lumière-obscurité de 12 heures, des températures variant de 21 à 25 °C, des niveaux d’humidité réglables entre 30 % et 70 % et un accès illimité à la nourriture et à l’eau, sauf indication contraire. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
1. Préparation cellulaire
- Cultivez la lignée cellulaire MB49 du cancer de la vessie murine dans le milieu complet Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) pour favoriser une croissance optimale.
- Maintenir les cultures cellulaires dans des conditions standard à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Rafraîchissez le support tous les 2 à 3 jours pour assurer la santé et la viabilité des cellules.
- Récoltez les cellules à l’aide d’une procédure normalisée de digestion à la trypsine. Pipeter doucement pour déloger les cellules du ballon de culture après avoir appliqué de la trypsine et incubé pendant une brève période.
- Comptez les cellules récoltées à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer la densité cellulaire exacte. Préparez une suspension unicellulaire en les remettant en suspension à 2 x 103/μL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Gardez cette suspension sur de la glace pour maintenir la viabilité cellulaire.
2. Préparation des animaux
- Le groupe loge les souris (5 souris par cage) dans des cages en polycarbonate ventilées individuellement.
- Laissez les souris s’acclimater pendant 7 jours avant le début de l’étude.
3. Génération de modèles de tumeurs orthotopiques animales
- Administrer l’anesthésie aux souris par injection intrapéritonéale à l’aide d’une solution à 2,5 % d’Avertin (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
- Attendez que les souris atteignent un niveau d’anesthésie approprié pour la chirurgie, comme l’indiquent une diminution de la fréquence respiratoire avec une augmentation de la profondeur, l’absence de réflexes des paupières et de la cornée, une réduction du tonus musculaire et des réponses réflexes, et aucune réaction à un pincement de la queue.
- Positionnez la souris anesthésiée en position couchée pour faciliter l’intervention.
- Utilisez un cathéter intraveineux de 24 G avec le stylet de l’aiguille retiré pour la procédure de cathétérisme urétral. Appliquez une lubrification suffisante sur le cathéter pour minimiser l’inconfort et faciliter l’insertion en douceur.
- Identifiez l’urètre, situé immédiatement en arrière des plis vulvaires et en avant du vagin, tout en maintenant la souris en position couchée.
- Commencez le cathétérisme en vous approchant de l’urètre à un angle de 45 degrés pour naviguer sous l’os pubien. Ajustez à un angle plus faible pour guider le cathéter à travers l’urètre et dans la vessie.
- Évitez d’appliquer une force excessive contre la résistance, car cela peut entraîner une perforation de l’urètre ou de la vessie. Confirmez l’emplacement du cathéter dans la lumière de la vessie en vérifiant s’il y a de l’urine dans le cathéter.
- Appliquez doucement une pression sur le bas-ventre de la souris pour faciliter l’évacuation de l’urine de la vessie. Assurez-vous que la vessie est complètement vidée pour vous préparer aux étapes ultérieures de la procédure.
- Poussez doucement le cathéter intraveineux de 24 G vers le haut de la vessie. Assurez-vous que l’extrémité du cathéter entre en contact avec l’apex de la vessie.
- Une fois le contact confirmé, relâchez le cathéter, ce qui lui permet de se rétracter légèrement. Maintenez le cathéter dans une position fixe par rapport à la souris pour assurer la stabilité et éviter le délogement.
- Insérez l’aiguille de distribution modifiée de 34 G le long du cathéter de 24 G. Avancez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle atteigne le haut de la vessie.
- Une fois positionné, tournez l’aiguille six fois pour créer une lésion muqueuse localisée à l’apex de la vessie. Après avoir terminé la rotation, retirez délicatement l’aiguille le long du cathéter.
- Connectez l’aiguille de distribution de 30 g au haut d’une seringue de 1 ml. Assurez-vous d’une connexion sûre entre l’aiguille et la seringue.
- Une fois connecté, aspirez la suspension de cellules MB49 de 2 x 10³/μL pré-préparée dans la seringue en tirant doucement le piston vers l’arrière. Vérifiez que la suspension cellulaire est aspirée dans la seringue sans bulles d’air.
- Insérez l’aiguille de distribution de 30 G le long du cathéter de 24 G. Assurez-vous que l’aiguille est correctement alignée et fixée à l’intérieur du cathéter.
- Une fois positionné, appliquez une pression sur le piston de la seringue de 1 mL pour injecter le contenu (préparé à l’étape 1). Maintenez une pression constante sur le piston pendant 60 s pour vous assurer que le contenu est distribué sans réduction significative du volume.
- Après 60 s, retirez avec précaution la seringue et l’aiguille de distribution de 30 G du cathéter.
4. Suivi postopératoire
- Placez la souris anesthésiée en position couchée sur un coussin chauffant jusqu’à ce que le réflexe de redressement revienne.
- Assurez-vous que l’animal n’est pas laissé sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience.
- Ne retournez pas l’animal en compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli.
Résultats
L’efficacité des injections sous-muqueuses a d’abord été évaluée par l’administration de Trypan Blue. Après l’injection, la distribution du colorant dans la couche sous-muqueuse a été clairement visualisée, confirmant l’administration précise et contrôlée des substances injectées (Figure 1).
Le développement de la tumeur a été méticuleusement suivi. Environ 14 jours après l’implantation, une incidence notable d’hématurie a été observée, un symptôme critique indiquant une néoplasie de la vessie. Les tumeurs ont été identifiées comme étant fermement établies dans la couche sous-muqueuse de la vessie. Le schéma de croissance précoce de ces tumeurs était caractérisé par une expansion expansive et non invasive, conforme à la classification du NMIBC. L’examen histologique a confirmé l’absence d’invasion musculaire, les tumeurs étant confinées à la couche sous-muqueuse, s’alignant ainsi sur les critères de NMIBC (Figure 2).
Les observations macroscopiques ont corroboré le processus de formation des tumeurs. Les tumeurs étaient visuellement distinctes, présentant une croissance papillaire avec une gamme de tailles et de formes (Figure 3). De plus, les tumeurs se sont développées relativement lentement, ce qui a laissé suffisamment de temps pour la recherche dans l’expérience (Figure 4).
Dans cette étude, pour vérifier la localisation de la tumeur et l’absence d’ensemencement urétral, nous avons utilisé des cellules MB49-luc pour l’implantation, suivie d’une imagerie chez de petits animaux. La figure 5 montre les images de bioluminescence in vivo prises 35 jours après l’injection de cellules tumorales, démontrant clairement que la tumeur est située dans la vessie sans signe d’ensemencement ectopique, comme dans l’urètre.
Le tissu tumoral devient généralement détectable 14 jours après l’implantation. D’après notre expérience, 70 % ou plus des souris présentent une hématurie au 14e jour. La procédure n’entraîne généralement aucune mortalité. Sans intervention, l’euthanasie devient nécessaire au 60e jour. Les critères d’euthanasie comprennent la léthargie, la cachexie, la fourrure ébouriffée, la courbure, le comportement insensible ou une perte de ≥20 % du poids corporel initial.
Figure 1 : Efficacité de l’injection sous-muqueuse avec du bleu trypan. Démonstration de l’efficacité de l’injection sous-muqueuse à l’aide de Trypan Blue. Les flèches indiquent les sites d’injection où le Trypan Blue résiduel reste visible même après trois lavages avec du PBS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Confirmation histologique de l’implantation tumorale. Confirmation histologique de l’implantation tumorale dans la sous-muqueuse par coloration H&E. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Visualisation directe des tumeurs de la vessie. Visualisation directe des tumeurs de la vessie, mettant en évidence une prolifération vasculaire évidente à la base de la tumeur. Barre d’échelle : 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : État de la tumeur au 35e jour après l’implantation. Évaluation de l’état tumoral au 35e jour après l’implantation. La paroi de la vessie à la base de la tumeur présente des vaisseaux sanguins élargis et désorganisés, accompagnés d’une base tumorale largement étendue. Barre d’échelle : 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Imagerie de bioluminescence in vivo du cancer de la vessie. Images de bioluminescence in vivo de souris 35 jours après l’implantation avec des cellules cancéreuses de la vessie MB49-LUC. Les images sont codées par couleur pour représenter l’intensité de la fluorescence : le rouge indique une fluorescence élevée (activité tumorale élevée) et le bleu indique une faible fluorescence (faible activité tumorale). Des régions d’intérêt (ROI) ont été sélectionnées dans la zone de la vessie pour quantifier le signal de bioluminescence spécifique à la tumeur. Les résultats démontrent que les tumeurs sont localisées dans la vessie sans signe d’ensemencement ectopique, comme dans l’urètre. Les régions à faible signal peuvent être dues à des signaux diffusés provenant de zones de haute intensité pénétrant à travers les tissus et n’indiquent pas nécessairement la présence de cellules tumorales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Schéma de l’administration intravésicale de cellules cancéreuses. Représentation schématique de l’administration intravésicale de cellules cancéreuses pour construire le modèle orthotopique du cancer superficiel de la vessie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Configuration des aiguilles de distribution modifiées. Configuration des aiguilles de distribution modifiées dans le cathéter 24 G. (A) Photographie de l’aiguille de distribution de 34 G à l’intérieur du cathéter de 24 G. (B) Photographie de l’aiguille de distribution de 30 G à l’intérieur du cathéter de 24 G. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
La recherche sur le cancer de la vessie s’appuie sur des modèles animaux, indispensables à la fois pour la recherche fondamentale et appliquée. Pour mieux imiter l’environnement de croissance tumorale, les modèles de tumeurs orthotopiques de la vessie offrent une approche supérieure par rapport aux modèles de tumeurs sous-cutanées11.
À l’heure actuelle, les modèles de cancer de la vessie orthotopique peuvent être classés en deux types principaux à des fins expérimentales : ceux utilisant des souris immunodéficientes, telles que les modèles de xénogreffe dérivée du patient (PDX)1 et les modèles de xénogreffe dérivée de lignées cellulaires (CDX)5, et ceux utilisant des souris immunocompétentes, tels que les modèles de greffe syngénique12.
Le modèle PDX consiste à implanter des tissus tumoraux dérivés de patients dans des souris immunodéficientes, ce qui permet une évaluation personnalisée de la réponse de la tumeur aux médicaments chimiothérapeutiques. Cependant, l’absence d’un système immunitaire intact chez ces souris présente des limites importantes pour l’étude des mécanismes immunitaires. De même, le modèle CDX, qui utilise des lignées cellulaires tumorales dérivées de l’homme, offre des taux élevés de formation de tumeurs mais souffre également de l’absence d’un microenvironnement immunitaire5.
Dans le contexte des souris immunocompétentes, la méthode principale de construction de tumeurs orthotopiques de la vessie consiste à injecter des lignées cellulaires MB49 dérivées de souris dans la paroi de la vessie pour former des tumeurs de la vessie in situ 12. Cette procédure nécessite une laparotomie et une injection intravésicale de cellules tumorales, ce qui pose des défis tels que la fuite potentielle de cellules tumorales et l’ensemencement des voies d’aiguille. Par conséquent, il est difficile de créer des tumeurs superficielles de la vessie, ce qui entrave la réplication précise de la progression du cancer de la vessie humaine des stades non invasifs sur le plan musculaire aux stades13 invasifs sur le plan musculaire.
Pour établir des tumeurs orthotopiques superficielles de la vessie, les techniques de modélisation traditionnelles impliquent généralement l’induction de lésions de la muqueuse à l’aide d’agents tels que des solutions acido-basiques ou l’électrocautérisation, suivie de l’instillation intravésicale de suspensions de cellules tumorales, avec des temps de rétention de 2 h ou plus 8,14. Cependant, ces méthodologies présentent plusieurs limites importantes. Tout d’abord, ils ne parviennent pas à assurer l’uniformité du nombre et de l’emplacement des implants tumoraux dans la vessie, compromettant ainsi la reproductibilité du modèle. De plus, ces techniques entraînent souvent de graves lésions de la vessie, entraînant des taux de mortalité élevés. La cicatrisation de la vessie et la capacité réduite qui en résultent constituent des obstacles substantiels pour les études sur de nouveaux agents thérapeutiques qui nécessitent des instillations intravésicales répétées. Cela sape non seulement la fiabilité des résultats expérimentaux, mais soulève également des préoccupations éthiques concernant le bien-être animal.
Par conséquent, le développement d’un modèle animal capable de simuler avec précision le cancer superficiel de la vessie humaine fournirait une meilleure plate-forme expérimentale pour comprendre la prolifération et la progression des tumeurs. Un tel modèle serait inestimable pour la recherche de nouveaux agents thérapeutiques intravésicaux et l’avancement de nos connaissances sur la biologie du cancer de la vessie.
Cette étude décrit une méthode d’implantation in situ qui utilise une aiguille de distribution à pointe émoussée pour injecter des cellules tumorales sous pression sous pression (Figure 6). L’étude utilise la lignée cellulaire MB49 et des souris femelles C57BL/6J pour construire un modèle de tumeur in situ .
Au cours de la construction de ce modèle, la couche protectrice à la surface normale de la muqueuse de la vessie pose un défi important pour l’instillation directe de cellules tumorales, empêchant souvent la formation efficace de tumeurs8. Par conséquent, il est nécessaire d’induire une lésion localisée au niveau du dôme de la vessie à l’aide d’une aiguille émoussée de 34 G pour créer un « sol » approprié pour l’implantation de cellules tumorales.
Les aiguilles de distribution 34 G et 30 G utilisées dans cette étude ont subi des modifications partielles. La pointe de l’aiguille de 34 G a été serrée pour créer une extrémité légèrement irrégulière, ce qui améliore sa capacité à causer des lésions à la muqueuse. Les points de connexion des aiguilles 34 G et 30 G ont été coupés pour s’assurer que les parties exposées sur le cathéter 24 G mesurent respectivement de 0,3 mm à 0,5 mm (figure 7A) et de 1 mm à 1,5 mm (figure 7B).
L’ensemble de cette procédure peut être terminé en 10 minutes, éliminant ainsi le besoin d’une laparotomie ou d’une ligature urétrale prolongée pour l’instillation intravésicale. Cependant, cette approche a aussi des limites. En raison des multiples étapes techniques impliquées dans cette méthode de modélisation, telles que l’insertion du cathéter à demeure à travers l’urètre dans la vessie et la rotation de l’aiguille émoussée de 34 G pour obtenir le degré approprié de lésion de la muqueuse sans perforer la paroi de la vessie, les expérimentateurs doivent s’entraîner à améliorer le taux de réussite de l’implantation tumorale. De plus, si une force excessive est utilisée lors d’une lésion de la muqueuse ou d’une injection de cellules tumorales, cela peut entraîner une perforation de la vessie ou l’implantation d’une tumeur dans la couche musculaire.
En conclusion, cette technique offre des avantages significatifs par rapport aux méthodes traditionnelles, notamment une réduction du temps de procédure, une mortalité plus faible et une meilleure cohérence dans la localisation et la croissance de la tumeur, sans avoir besoin de procédures invasives ou de rétention intravésicale prolongée. Ces avantages en font un outil précieux pour les études précliniques visant à évaluer de nouveaux agents thérapeutiques pour le cancer de la vessie.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Remerciements
Cette étude a été financée par le fonds du projet clé de l’industrie de la santé municipale de Tianjin (subvention no. TJWJ2022XK014), le fonds de projet de recherche scientifique de la Commission municipale de l’éducation de Tianjin (subvention n° 2022ZD069), le programme de financement des talents de l’Institut d’urologie de Tianjin (subvention n°. MYSRC202310), le fonds du projet de recherche en médecine clinique du deuxième hôpital de l’Université de médecine de Tianjin (subvention n° 2023LC03), le fonds pour la jeunesse du deuxième hôpital de l’Université de médecine de Tianjin (subvention n° 2022ydey15) et le projet de culture des talents du Département d’urologie du deuxième hôpital de l’Université de médecine de Tianjin (subvention n° 2022ydey15) MNRC202313). Les sponsors ont joué un rôle dans la préparation, l’examen et l’approbation du manuscrit.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Aiguille de distribution 34 G | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, Chine | SGL-362 | |
| Aiguille de distribution 30 G | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, Chine | SGL-362 | |
| Avertin | Sigma-Aldrich LLC | T48402 | |
| Bleu trypan | Sigma-Aldrich LLC | 302643 |
Références
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Réimpressions et autorisations
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