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Article de méthode

Dosage quantitatif basé sur la PCR pour mesurer la signalisation Sonic Hedgehog dans un modèle cellulaire de ciliogenèse

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DOI :

10.3791/67407

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31 janvier 2025

 , 
1CellBio Lab, Institute of Health Sciences, Presidency University

Dans cet article

Résumé

L’étude fait la démonstration d’un test quantitatif basé sur la PCR pour l’activation de la voie de signalisation Sonic Hedgehog (SHH) médiée par des cils primaires à l’aide d’un agoniste SHH dans un modèle cellulaire de ciliogenèse.

Résumé

La ciliopathie fait référence à un ensemble de maladies et de troubles humains multisystémiques et polygéniques qui surviennent en raison de l’aberration de la structure ou de la fonction des cils mobiles ou non mobiles (primaires) qui sont des protubérances cellulaires à base de microtubules. Les cils primaires (PC) sont présents dans la plupart des tissus épithéliales et endothéliales humains et servent de plaque tournante pour la transduction des signaux physiologiques, y compris la signalisation Sonic Hedgehog (SHH). Diverses situations exigent d’examiner la fonction de la CP, qui peut être réalisée en mesurant la voie de signalisation canonique SHH qui est presque exclusivement médiée par la CP. Ici, une technique basée sur la PCR quantitative (qPCR) est développée pour mesurer le niveau transcriptionnel des gènes de la voie SHH dans les cellules hTERT-RPE1 (ou RPE1) quiescentes qui contiennent principalement de la PC. La quiescence dans les cellules RPE1 est obtenue par une famine sérique pendant 48 h, tandis que l’activation de la voie SHH est favorisée par un agoniste spécifique. Ce test basé sur la culture cellulaire est facile à suivre et sensible. La démonstration réussie de ce test dans des cellules RPE1 ciliées indique son immense potentiel en tant que test in vitro pour examiner le bon fonctionnement de la PC lors d’une altération génétique ou épigénétique d’un ou plusieurs gènes, qui peuvent être associés à diverses ciliopathies.

Introduction

Un cil est une saillie à base de microtubules et engainée d’une membrane à partir de la surface cellulaire, qui est assemblée sur un corps basal1. Chez les vertébrés, deux types de cils, à savoir mobiles et non mobiles, sont observés. Les cils mobiles sont situés dans des tissus spécialisés et confèrent la motilité. Les cils primaires non mobiles (PC) sont présents dans la plupart des cellules de vertébrés, remplissent des fonctions sensorielles et transduisent des signaux critiques du milieu extracellulaire vers l’intérieur des cellules2. Une fois assemblé, l’allongement ciliaire est aidé par la machinerie de transport intraflagellaire (IFT), qui est un système de transport bidirectionnel transportant une cargaison entraînée par des kinésines (mouvement antérograde) et des protéines motrices dynéine-II (mouvement rétrograde)3,4. Des défauts structurels ou fonctionnels dans les cils mobiles ou primaires peuvent conduire à une pléthore de maladies humaines multisystémiques connues sous le nom de ciliopathies 5,6.

Le PC sert de plaque tournante pour divers processus de signalisation développementale, tels que les récepteurs sans ailes (Wnt), les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR), les récepteurs tyrosine kinases (RTK), le facteur de croissance transformant β (TGFβ) et la signalisation du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) 7,8. Chez les mammifères, la signalisation Sonic Hedgehog (SHH) est critique, qui est presque exclusivement transduite par PC dans les cellules contenant PC 9,10,11. La structure ou la fonction aberrante de la CP conduit à des voies de signalisation atténuées associées à des maladies telles que les malformations cardiaques congénitales, la maladie polykystique des reins, les anomalies craniofaciales, la dystrophie rétinienne et quelques maladies rares telles que le syndrome de Bardet-Biedl (BBS), le syndrome de Joubert (JBTS), le syndrome d’Alström, la dysplasie thoracique de Jeune asphyxie (JATD)12,13,14,15. La plupart d’entre elles sont des maladies polygéniques des tissus épithéliaux ou endothéliaux, ce qui rend le diagnostic précoce et le traitement de ces maladies. Déterminer comment de telles mutations contribuent à la signalisation atténuée médiée par PC dans un modèle de culture cellulaire peut non seulement donner un aperçu de la complexité moléculaire de cette voie de signalisation, mais également faciliter le diagnostic de diverses ciliopathies et suggérer des interventions thérapeutiques. Avec cette notion, un test basé sur la PCR quantitative (qPCR) est développé pour déterminer l’altération de la voie de signalisation SHH médiée par la PC dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes immortalisées par la télomérase humaine (hTERT-RPE1, appelée ici RPE1). Les cellules RPE1 sont des cellules humaines quasi diploïdes, non transformées, qui sont largement utilisées comme modèle cellulaire pour la ciliogenèse, car environ 75 % à 80 % de ces cellules assemblent des PC lors d’une privation sérique (cellules incubées dans un milieu sans sérum) pendant 24 à 48 h, contre seulement 15 % à 18 % de ciliation dans une culture asynchrone de cellules RPE116.

La signalisation du hérisson (HH) est conservée chez les vertébrés pour le développement embryonnaire17. Chez les mammifères, trois types différents de signalisation Hedgehog sont observés : Sonic (SHH), Indian (IHH) et Desert (DHH), dont SHH et IHH montrent des fonctions qui se chevauchent au niveau tissulaire11. La signalisation SHH joue un rôle clé au cours du développement embryonnaire en régulant la structuration des membres et la spécification du type de cellule dans le système nerveux et en maintenant l’homéostasie des tissus adultes 10,11,18. Bien que la signalisation SHH soit complexe, il existe de plus en plus de preuves suggérant que la signalisation SHH canonique dépend de PC 7,11,19, qui est médié par les fonctions collectives des facteurs de transcription Gli (Gli1, Gli2 et Gli3). Il a été suggéré que la signalisation HH et la PC ont coévolué, les composants de signalisation critiques étant concentrés dans le volume compact à l’extrémité du cil pour permettre des réponses efficaces à de faibles rapports de ligands11.

En l’absence de ligands SHH, Patched1 (Ptch1), qui est localisé sur la membrane PC, inhibe l’activité de Smoothened (Smo) par un mécanisme mal compris qui implique probablement le transport des lipides, maintenant ainsi la voie réprimée 7,20. Le GPR161 ciliaire constitutivement actif, qui est un récepteur protéique couplé G et un régulateur négatif du système, assure le maintien de la répression en préservant des niveaux élevés d’AMP cyclique ciliaire (AMPc) qui augmente l’activité de la protéine kinase A (PKA)21, et en maintenant la localisation ciliaire de PKA7. L’activité de la PKA, ainsi que celle de la caséine kinase 1 (CK1) et de la glycogène synthase kinase 3 β (GSK3β), phosphoryle plusieurs résidus des protéines Gli, Gli2 et Gli3, à l’intérieur de la PC. Gli2 et Gli3 peuvent agir à la fois comme activateurs et répresseurs de la transcription des gènes cibles. La phosphorylation médiée par la PKA provoque l’inhibition de la fonction activatrice de Gli2, tandis que la Gli3 phosphorylée est clivée par les protéases pour produire la forme répressive Gli3R22. Dans l’ensemble, l’expression des gènes cibles de SHH est réprimée dans de telles conditions.

Lorsque le ligand SHH est présent, Ptch1 s’y lie, et GPR161 quitte la PC, et Smo, étant phosphorylé par la kinase 2 (GPRK2) et CK1, est trafiqué dans la PC, avec la β-arrestine et le moteur des microtubules KIF3A23. De concert, la localisation de Gli2/3, Suppressor of Fused (SUFU) et Kif7 à l’extrémité ciliaire est favorisée et est liée à une diminution du clivage de Gli2/3, augmentant ainsi la fonction d’activation de Gli2/324,25. Une fois activé, Gli2/3 induit l’expression de Gli1, qui ne peut fonctionner que comme un activateur, et amplifie ainsi la réponse de la voie SHH22. La liaison de SHH à Ptch1 est facilitée par les oncogènes (CDO), frère de CDO (BOC), spécifique de l’arrêt de croissance 1 (GAS1) et protéine 2 liée au récepteur des lipoprotéines de basse densité (LRP2). À l’inverse, la protéine d’interaction avec Hedgehog (HHIP) peut séquestrer SHH en interagissant directement avec elle et entre également en compétition avec Ptch1 en interagissant avec SHH26. Il est important de noter que GLI1, HHIP et PTCH1 sont transcrits lors de l’activation de la voie SHH, tandis que les deux derniers participent à la régulation négative de la voie SHH.

Des études antérieures ont démontré que les niveaux de transcription des gènes cibles de SHH peuvent être mesurés pour évaluer la voie SHH, bien qu’elle puisse varier considérablement dans différents types de cellules27,28. Une telle variation de la réponse de la voie SHH peut être attribuée à différentes combinaisons de signalisation SHH médiée par PC et de signalisation SHH médiée par la membrane cellulaire, probablement en l’absence de PC. SAG est un agoniste de Smo qui est utilisé dans cette méthode pour imiter l’activation de la signalisation SHH dans les cellules RPE1 privées de sérum qui sont principalement ciliées. Les niveaux de transcription des gènes cibles de SHH tels que HHIP, GLI1 et PTCH1 et d’un gène non cible SMO ont été mesurés à l’aide de la qPCR dans des cellules témoins et traitées par SAG et ont été comparés pour déterminer l’activation de la voie SHH. La démonstration réussie de ce test sensible basé sur la culture cellulaire pour mesurer la signalisation SHH médiée par PC suggère son application prometteuse dans la recherche biomédicale associée à la fonction primaire des cils.

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Protocole

1. Culture cellulaire

  1. Passage d’un flacon de culture cellulaire T-25 presque confluent de cellules RPE1 à dilution 1:5 de la culture originale dans un flacon de culture cellulaire T-25 frais contenant 5 mL de milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), un mélange de pénicilline et de streptomycine à 1 % (concentration finale : 100 U/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine). Ce support est appelé le support complet. Cultiver des cellules à 37 °C en présence de 5 % de CO2.
    REMARQUE : Les cellules RPE1 sont des cellules non transformées couramment utilisées pour étudier la régulation moléculaire de l’assemblage et du désassemblage des PC en culture cellulaire. Environ 80 % des cellules RPE1 assemblent du PC lors d’une famine sérique, qui est à nouveau désassemblé lors de la réajout du sérum16.
  2. Préparez les lamelles rondes en verre de 12 mm en les faisant couver dans 50 ml de HCl 1 N dans un bécher en verre couvert pendant la nuit sans agiter à 60 °C dans un bain-marie ou un incubateur.
  3. Le lendemain, à l’aide d’une pipette de 25 ml, pipeter la solution acide et la jeter correctement dans un contenant à risque chimique. Ensuite, lavez les lamelles 3 fois dans 100 ml d’eau distillée en les incubant pendant 15 minutes en les secouant de temps en temps, puis en les pipetant.
  4. Répétez les étapes de lavage avec 70 % d’éthanol et 95 % d’éthanol. Séchez les lamelles en les plaçant individuellement sur du papier buvard de laboratoire dans une enceinte de biosécurité. Une fois séché, stériliser aux rayons UV pendant 60 min.

2. Croissance cellulaire, famine sérique et traitement SAG

  1. Remettre en suspension les cellules dans le ballon T-25 dans un milieu complet préchauffé après avoir délogé les cellules par l’activité enzymatique d’une solution préchauffée de trypsine-EDTA à 0,25 %. Déterminer la densité cellulaire de la suspension en comptant les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
  2. Préparez deux boîtes de culture cellulaire de 35 mm et placez deux lamelles stériles de 12 mm dans chacune d’elles. Passage de 2 x 105 cellules RPE1 en croissance asynchrone dans chaque boîte de 35 mm contenant des lamelles de recouvrement et culture des cellules dans 2 mL de milieu complet pendant 24 h.
  3. Après 24 h, retirez le milieu de croissance des cellules RPE1 et lavez les cellules 1x avec 1 mL de tampon DPBS préchauffé. Ajouter 2 mL de milieu DMEM préchauffé contenant 1 % de pénicilline-streptomycine mais dépourvu de FBS (milieu sans sérum) dans chaque plat et incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C en présence de 5 % de CO2.
  4. Après 24 h, remplacez le milieu par un milieu sans sérum contenant soit du SAG à une concentration finale de 250 nM, soit du DMSO comme solvant de contrôle et incubez les cellules pendant 24 h supplémentaires. La figure 1A présente un schéma animé du protocole de culture cellulaire.

3. Collecte de cellules

  1. Transférez les lamelles dans une plaque à 24 puits avec une lamelle dans chaque puits. Ajouter 0,5 mL de méthanol réfrigéré dans chaque puits et incuber la plaque à -20 °C pendant 10 min pour fixer les cellules sur les lamelles. Immédiatement après, laver les lamelles 3 fois avec 0,5 mL de tampon de lavage (1x PBS contenant 0,5 mM de MgCl2 et 0,05 % de Triton-X 100).
  2. Jetez le milieu et ajoutez 0,5 mL de réactif de trizol directement dans chaque plat. Laissez-le répartir uniformément et laissez reposer 5 min. Pipetez de haut en bas plusieurs fois pour obtenir un mélange homogène et recueillez-le dans des tubes de microcentrifugation sans nucléases de 1,5 ml.

4. Préparation de l’ARN total et de l’ADNc

  1. Ajouter 0,1 mL de chloroforme dans chaque tube contenant des cellules lysées et incuber pendant 2 à 3 min. Centrifugez chaque échantillon pendant 15 min à 12 000 x g à 4 °C. Transférez la phase aqueuse contenant l’ARN dans des tubes de microcentrifugation frais.
  2. Ajouter 0,25 mL d’isopropanol à la phase aqueuse et incuber pendant 10 min. Centrifugeuse pendant 10 min à 12 000 x g à 4°C. Le précipité d’ARN forme une pastille blanche semblable à un gel. À l’aide d’une micropipette, jeter le surnageant.
  3. Remettre en suspension la pastille d’ARN dans 0,5 mL d’éthanol à 75 % fraîchement dilué. Agiter brièvement les échantillons, puis les centrifuger pendant 5 min à 7500 x g à 4°C. Jeter le surnageant à l’aide d’une micropipette.
  4. Faites sécher la pastille d’ARN à l’air libre pendant 10 minutes et mettez-la en suspension dans 25 μL d’eau sans nucléases. Déterminez la concentration d’ARN total en mesurant l’absorbance à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume.
  5. Utilisez 1 à 3 μg d’ARN total des deux échantillons pour préparer les ADNc en suivant les instructions du fabricant pour un kit de synthèse d’ADNc. Stockez les ADNc à -20 °C.

5. PCR quantitative

  1. Réglez les réactions qPCR (en trois exemplaires, tableau 1) à l’aide d’ADNc dilués 1:5 de chaque échantillon avec des ensembles d’amorces de GLI1, PTCH1, HHIP, SMO et β-ACTINE (comme gène de nettoyage ; Tableau 2) gènes avec un mélange maître qPCR contenant de l’ADN polymérase, des dNTP et un tampon appropriés, dans une plaque PCR multi-puits appropriée sensible à la fluorescence.
  2. Couvrez la plaque avec une scelleuse appropriée, placez-la dans un instrument de qPCR approprié et exécutez un programme qPCR standardisé avec 40 cycles d’amplification et une étape d’analyse de la courbe de fusion à la fin du programme. Le programme normalisé de qPCR à 40 cycles, y compris une analyse de la courbe de fusion, est illustré schématiquement à la figure 1B.
  3. Une fois le programme qPCR terminé, vérifiez la courbe de fusion de chaque amplicon pour un seul pic à la température souhaitée.
    REMARQUE : À la fin des cycles d’amplification, l’analyse de la courbe de fusion associée mesure la température de fusion de l’amplicon en augmentant la température de chaque puits de 65 °C à 95 °C, avec un incrément de 0,5 °C par pas d’une durée de 5 s.
  4. Exportez les données d’amplification vers une feuille de calcul et calculez l’expression relative (méthode 2−ΔΔCT) de chaque transcrit en la normalisant par rapport à celle du gène β-ACTINE pour chaque échantillon. Tracez le graphique et calculez la signification statistique des changements dans l’expression relative de chaque transcrit à l’aide d’un test T non apparié.

6. Immunomarquage et acquisition d’images par microscopie à fluorescence

  1. Incuber les cellules fixes sur des lamelles dans 200 μL de tampon de blocage (2 % BSA et 0,1 % TritonX-100 dans 1x PBS) pendant 30 min.
  2. Incuber les cellules avec un mélange d’anticorps primaires (généralement un anticorps anti-souris contre la α-tubuline acétylée de l’axonème PC et des anticorps anti-lapin contre la membrane ciliaire et le centriole, respectivement) dilués dans un tampon de blocage (voir le tableau des matériaux pour la dilution finale) pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
    1. Préparez une chambre humidifiée en plaçant un essuie-tout humide dans la moitié inférieure d’une boîte d’embout de pipette vide de 1 ml. Posez une bande de film transparent sur la surface du rack et repérez une gouttelette (20 à 25 μL) de la solution d’anticorps sur le film, une pour chaque lamelle à incuber. Placez une lamelle sur les gouttelettes afin que les cellules soient immergées et fermez le couvercle de la boîte à pointes.
  3. Le lendemain, retournez à nouveau les lamelles et remettez-les dans le plat à 24 puits. Lavez les lamelles avec le tampon de lavage, puis incubez-les dans 150 μL de mélange d’anticorps secondaires avec une dilution pré-standardisée d’anticorps (ici, anti-souris conjugué à un colorant fluorescent vert et fluorescent rouge dilué dans un tampon bloquant) et de réactifs de coloration de l’ADN nucléaire pendant 1 h à température ambiante. Lavez les lamelles 3 fois.
  4. Repérez une gouttelette (environ 3 à 5 μL) de la solution de montage contenant le réactif anti-décoloration sur une lame de microscope en verre. Placez une lamelle, avec le côté de la cellule vers le bas, sur la solution de montage. Essuyez l’excès de liquide en appuyant doucement sur une lingette propre. Appliquez du vernis à ongles transparent le long du bord de la lamelle pour le sceller sur la lame.
  5. Placez une lame sur le microscope (voir tableau des matériaux) fixée à l’aide d’une platine motorisée et d’une caméra capable d’imagerie numérique. Utilisez un objectif à immersion dans l’huile Plan Apo 60x (avec une ouverture numérique de 1,4) pour acquérir les images des cellules RPE1 en manque de sérum à température ambiante, afin de visualiser la PC dans les cellules, comme indiqué par les anticorps mentionnés.
  6. Acquérez des images des différents échantillons sur des lamelles distinctes en utilisant un temps d’exposition identique pour différents fluorophores le long de l’axe Z à l’aide d’un logiciel d’imagerie par microscopie numérique. Comptez le nombre de cellules contenant du PC à partir d’au moins 500 cellules pour déterminer le pourcentage de ciliation dans un état de famine sérique de 48 heures.

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Résultats

L’activation de la voie de transduction du signal SHH médiée par PC est un moyen de comprendre le bon fonctionnement de PC7. Ici, l’expression relative des gènes cibles de la voie SHH est mesurée à l’aide d’un test RT-qPCR lors de l’activation de la voie SHH médiée par SAG dans les cellules RPE1 qui sont principalement ciliées. Les sorties transcriptionnelles directes GLI1 et PTCH1 de la voie SHH sont fréquemment utilisées pour évaluer l’activité de cette voie11. Ce protoco...

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Discussion

L’examen de la fonctionnalité de la PC est une étape cruciale vers la compréhension de la dynamique de la ciliation et des maladies ou troubles associés au dysfonctionnement de la CP. Outre l’examen de la ciliation par immunocoloration pour les marqueurs ciliaires ou les composants structurels ciliaires marqués au fluorophore, la fonction de la PC est généralement déterminée en dosant l’activation canonique de la voie SHH en mesurant la translocation ciliaire de Smo dans les tissus et le...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail est soutenu par la bourse Ramalingaswami du Département de biotechnologie (DBT) du gouvernement indien et la subvention de recherche du Conseil de recherche en sciences et ingénierie (SERB) du gouvernement indien à SM (CRG/2020/004042). La bourse de PH est parrainée par la Commission des subventions universitaires (UGC), gouvernement de l’Inde. Les auteurs remercient sincèrement le Dr Chandrama Mukherjee et M. Avik Mukherjee du laboratoire RNABio de l’Institut des sciences de la santé de l’Université de la présidence pour l’accès à l’instrument qPCR et la formation à l’instrument respectivement.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMSO, filtre stérileSigmaD2650
Âne, anti-IgG souris (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21202
Âne, anti-Lapin IgG (H+L) Alexa Fluor 568ThermoFisher ScientificA10042
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco, ThermoFisher Scientific41965039
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)Gibco, ThermoFisher Scientific14190144
Sérum fœtal bovin (FBS)HimediaRM1112
équipé d’un objectif 60XCarl Zeiss.Axio observer colibri 5
cellules hTERT-RPE1ATCCCRL-4000
iScript kit de synthèse d’ADNcBio-Rad Laboratories1708891
souris, anticorps monoclonal anti-tubuline acétyléeMilipore Sigma-AldrichT7451Dilution finale 1:1000
Pénicilline-Streptomycine, 100XGibco, ThermoFisher Scientific15140122
Appareil de PCR quantitative, CFX 96Bio-Rad Laboratories
Lapin, anticorps polyclonal Arl13BProteinTech17711-1-APDilution finale 1:250
Lapin, polyclonal Cep135anticorps ProteinTech24428-1-APDilution finale 1:500
SlowFade gold Antifade moutantThermoFisher ScientificS36940
Smoothened Agoniste (SAG)  ;AbmoleM4865Solution mère : dans DMSO, 5 mM
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-RadLaboratories 1725271
TRIzolReagent Invitrogen15596026
TrypLEGibco, ThermoFisher Scientific12605028
Microscope à fluorescence

Références

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