Immunisation active pour l’induction de la myasthénie grave auto-immune à kinase musculaire spécifique (MuSK) chez la souris

Résumé

Cet article présente un protocole complet pour un modèle murin expérimental de myasthénie grave auto-immune à kinase spécifique du muscle (MuSK), visant à étudier la physiopathologie et les stratégies thérapeutiques potentielles de la maladie.

Résumé

La myasthénie grave (MG) est une maladie auto-immune affectant la jonction neuromusculaire. Alors que la plupart des patients atteints de MG produisent des auto-anticorps contre le récepteur de l’acétylcholine (AChR), un sous-ensemble de patients présente des auto-anticorps ciblant la kinase spécifique du muscle (MuSK). MuSK MG se caractérise par une faiblesse musculaire sévère, des manifestations cliniques résistantes au traitement et des crises myasthéniques, nécessitant souvent une ventilation mécanique. Par conséquent, les patients nécessitent souvent une utilisation prolongée d’immunosuppresseurs, qui sont associés à des effets indésirables à long terme. Compte tenu de la gravité et de la rareté de MuSK-MG, le développement d’un modèle animal expérimental est crucial pour faire progresser de nouvelles modalités de traitement et une compréhension plus approfondie des mécanismes physiopathologiques sous-jacents. La myasthénie grave auto-immune expérimentale (EAMG) sert de modèle animal pour la MuSK-MG, imitant efficacement, mais en partie, les caractéristiques cliniques et immunologiques de la MG humaine. L’induction de modèles animaux auto-immuns peut être réalisée par l’immunisation active ou passive. Dans le protocole expérimental présenté ici, l’immunisation active a été utilisée en administrant par voie sous-cutanée le domaine extracellulaire purifié de MuSK humain émulsionné dans un adjuvant de Freund complet avec Mycobacterium tuberculosis tué par la chaleur. L’immunisation a été effectuée dans quatre sites, suivie d’une injection de rappel de MuSK le 28e jour. Cet adjuvant avec M. tuberculosis permet l’activation du système immunitaire par TLR4 et une phagocytose accrue de l’antigène administré. Cet article détaille en détail le développement et la caractérisation de MuSK-EAMG du début à la fin.

Introduction

La myasthénie grave (MG) est une maladie auto-immune qui se développe par des mécanismes dépendants des lymphocytes T et médiés par des anticorps. Elle est principalement causée par des anticorps dirigés contre les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (AChR) sur la membrane postsynaptique de la jonction neuromusculaire (JNM) chez 80 à 85 % des patients, et par des anticorps dirigés contre la kinase spécifique musculaire (MuSK) chez environ 5 % des patients, ainsi que par d’autres protéines de la JNM. La MG est devenue un prototype pour les maladies auto-immunes et un modèle pour comprendre la fonction postsynaptique¹. Les modèles animaux de maladies auto-immunes peuvent être divisés en deux catégories principales : (1) les modèles spontanés, dans lesquels les animaux développent naturellement une maladie auto-immune, et (2) les modèles induits, où la maladie auto-immune est imitée et reproduite artificiellement. Des études sur la myasthénie grave (MG) ont démontré que l’immunisation active et passive peut induire la maladie, contribuant ainsi de manière significative à la compréhension des affections médiées par les anticorps².

Le transfert passif est une méthode très efficace pour évaluer les effets aigus des maladies médiées par les auto-anticorps et a été largement utilisé pour étudier les anticorps dérivés de patients dans la MG. Cette approche a permis d’élargir la compréhension des facteurs immunologiques sous-jacents à la maladie. Par exemple, des études de transfert passif ont montré l’impact pathogène des IgG4 anti-MuSK sur la réduction des clusters AChR³. Cependant, le modèle de transfert passif présente certaines limites, telles que les différences fonctionnelles entre les systèmes immunitaire et d’IgG humains et de rongeurs et l’insuffisance du modèle de transfert passif pour imiter les mécanismes d’activation initiaux de l’auto-immunité anti-MuSK se produisant dans les tissus lymphoïdes.

D’autre part, une limitation potentielle des études d’immunisation est la variabilité immunogénétique entre différentes souches de souris⁴. Par exemple, alors que les souris C57BL/6 (B6) sont sensibles à l’immunisation active par l’AChR, les souris AKR/J sont résistantes. Par conséquent, lors de la création d’un modèle animal EAMG, il est crucial de sélectionner correctement l’espèce animale, la méthode d’immunisation et le contenu du protocole pour refléter avec précision la maladie⁵.

De plus, l’utilisation de l’antigène cible comme une protéine entière entraîne souvent des titres d’anticorps élevés. Cependant, tous les anticorps ne peuvent pas réagir de manière croisée avec l’antigène de la souris ou produire des épitopes pathogènes. Par conséquent, les modèles d’immunisation active ne reflètent pas toujours fidèlement la pathologie humaine. Néanmoins, lorsqu’ils réussissent à créer un phénotype clinique et physiologique approprié, ces modèles fournissent une plate-forme à long terme pour tester des thérapies expérimentales.

Des études cliniques indiquent des mécanismes pathologiques et des exigences thérapeutiques divergents pour MuSK-MG, soulignant la nécessité d’une identification plus approfondie des caractéristiques pathogènes spécifiques de ce sous-type ^4,5,6 de MG. Des études antérieures sur l’immunisation active MuSK EAMG ont montré une implication prédominante de l’immunité de type Th2 et des IgG1 anti-souris dans l’auto-immunité MuSK et ont identifié un certain nombre de modalités de traitement potentielles (p. ex. tériflunomide, cellules souches mésenchymateuses, shRNA FCRLB) pour MuSK MG ^7,8,9 humain. Cela a démontré l’importance du modèle MuSK EAMG dans l’essai de nouvelles cibles thérapeutiques et l’étude de la physiopathologie de MuSK MG.

Dans cet article, les procédures d’induction du modèle animal, de suivi de la progression de la maladie et de validation de l’induction de l’EAMG ont été détaillées. L’évaluation clinique a consisté à surveiller le poids, la posture, la force de préhension et les scores cliniques par un observateur. Les souris ont été euthanasiées 28 jours après la deuxième vaccination, et divers tissus, y compris le sang, les muscles des membres postérieurs, la rate et les ganglions lymphatiques axillaires et inguinaux, ont été prélevés pour confirmer l’établissement de la maladie. Les anticorps anti-MuSK ont été quantifiés dans les sérums à l’aide de la méthode ELISA. De plus, une coloration immunofluorescente a été effectuée sur les tissus musculaires pour visualiser les dépôts à la jonction neuromusculaire. Pour démontrer et comparer les réponses cliniques et immunitaires dans des groupes de souris présentant une sensibilité différente à MuSK EAMG, les souris traitées avec le shRNA KCNS3 ont montré une action pro-inflammatoire (non publiée) et le shRNA FCRLB a montré une action anti-inflammatoire⁹, comme déterminé dans des études précédentes.

Protocole

Le protocole a été approuvé par le Comité local d’éthique des expériences animales de l’Université d’Istanbul (HADYEK) avec le numéro de décision 2020/29. Dans nos études précédentes ^7,8,9, le modèle EAMG a été induit chez des souris BALB/c ou B6 âgées de 8 à 10 semaines par immunisation active avec la protéine MuSK. Cet article présente des données exemplaires obtenues à partir de différentes expériences utilisant des souris BALB/C immunisées au MuSK (4 à 8 souris par groupe). Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Production et préparation de MuSK humain pour l’immunisation

1. Clonez les acides aminés 24-495 du domaine extracellulaire MuSK humain (séquence de référence NCBI : NP_005583.1) dans le vecteur pPIC9.
2. Sécrétion d’expression dans le système de levure Pichia pastoris (souche GS115).
3. Induire l’expression par l’ajout de méthanol (2,5 % v/v) dans le milieu de croissance.
4. Ajoutez une balise C-terminal 6xHIS à des fins de purification.
5. Exprimer la protéine sous forme de protéine glycosylée sécrétée et la purifier dans des conditions natives. Dialyser le milieu de culture contre 50 mM tampon phosphate pH 8,0, 300 mM NaCl.
6. Poursuivre la chromatographie d’affinité nickel-ion à l’aide de l’agarose Ni²⁺/nitrilotriacétate (Ni-NTA). Conservez la protéine purifiée après l’ajout de 10 % de glycérol à -80 °C, où elle est stable pendant au moins deux ans¹⁰.
   REMARQUE : Les niveaux d’expression, estimés après purification du Ni-NTA, sont d’environ 0,4 mg/L de culture. Aucune autre impureté protéique n’a été détectée dans les échantillons analysés par SDS-PAGE.
7. Avant l’immunisation, vérifier la pureté du domaine extracellulaire isolé de la protéine MuSK par électrophorèse sur gel (figure supplémentaire 1).
8. Préparez le MuSK pour chaque souris à une concentration de 45 μg/100 μL de PBS.
9. Homogénéiser (émulsionner) le MuSK dans un rapport de 1:1 avec du PBS (100 μL) et un adjuvant de Freund complet (CFA-100 μL) contenant Mycobacterium tuberculosis H37Ra (10 mg/10 mL) (le volume total de l’émulsion est de 200 μL par souris).

2. Procédure d’anesthésie et de vaccination

1. Avant la vaccination, diluez le propofol dans le PBS (rapport 1:5).
2. Administrer par voie intrapéritonéale à raison de 50 mg/kg par souris.
   REMARQUE : L’isoflurane peut également être utilisé pour l’anesthésie par inhalation (selon les protocoles approuvés par l’établissement). La concentration initiale est généralement fixée à 3 % à 5 % avec un débit d’oxygène de 1 à 2 L/min, tandis que la concentration de maintien est généralement de 1 % à 3 % avec un débit d’oxygène de 0,5 à 1 L/min.
3. Première vaccination : Injecter un total de 45 μg/200 μL de MuSK préparé dans l’AFC par voie sous-cutanée dans les épaules et l’intérieur des pattes arrière (environ 11,25 μg/50 μL pour chaque partie).
4. Deuxième vaccination : Injecter un total de 45 μg/200 μL de MuSK préparé dans l’AFC par voie sous-cutanée dans les épaules et les hanches (environ 11,25 μg/50 μL pour chaque partie).
   REMARQUE : Administrer les injections deux fois à 28 jours d’intervalle pour établir le modèle. L’administration intramusculaire est associée à des douleurs musculaires, ce qui peut interférer avec l’évaluation clinique de la faiblesse. Étant donné que l’EAMG est une maladie musculaire, l’utilisation de l’injection intramusculaire peut induire une faiblesse non myasthénique liée à la douleur et ainsi agir comme un facteur de confusion. Il est recommandé d’avoir un groupe témoin immunisé uniquement avec le CFA (sans MuSK).

3. Notation clinique

1. Exercez les souris en les faisant glisser doucement 40 fois sur la grille supérieure d’une cage alors qu’elles tentent de saisir la grille pour induire la fatigue, car les symptômes de la myasthénie grave chez les souris deviennent plus prononcés après l’exercice et la fatigue.
2. Après l’exercice, observez attentivement les souris pour détecter les changements d’activité, de poids et de force musculaire. Attribuez des notes appropriées en fonction de ces observations pour guider les critères d’évaluation.
   REMARQUE : Score 0 : Les souris restent actives et continuent d’explorer leur environnement ; Score 1 : Une posture voûtée est observée après l’exercice, mais les souris retrouvent une activité normale et une sociabilité. Le toilettage de la fourrure est généralement maintenu. Score 2 : Une posture voûtée est visible même avant l’exercice et devient plus prononcée après l’exercice. Une diminution de l’auto-toilettage et de l’activité est notée. Score 3 : Une posture voûtée spectaculaire est observée avant et après l’exercice. Il y a une diminution significative du mouvement, de la sociabilité et de la force musculaire, accompagnée d’une perte de poids de 1 à 2 grammes tous les 2-3 jours. La déshydratation se produit, ce qui rend difficile pour les souris d’atteindre l’eau et la nourriture. La déshydratation est identifiée par le fait que la peau ne revient pas rapidement après avoir été pincée et des changements dans les selles. Les souris qui souffrent se caractérisent par un strabisme et une posture voûtée. Les souris montrant des signes de douleur intense et une perte de poids supérieure à 20 % sont sacrifiées. Score 4 : La souris est retrouvée morte dans la cage. La souris décédée doit être retirée immédiatement et la cage doit être changée⁵.
3. Vérifiez les souris tous les jours, car les symptômes ont progressé rapidement environ 10 jours après la deuxième vaccination. Effectuez des scores et des mesures cliniques chaque semaine pendant les 28 premiers jours, puis deux fois par semaine.
4. Effectuer la mesure du poids.
   REMARQUE : La mesure du poids fournit un paramètre crucial pour suivre la progression de la maladie. En raison des taux métaboliques élevés des souris, le poids corporel peut varier considérablement. Il est important d’utiliser la même échelle pour toutes les mesures et d’effectuer ces mesures au même moment de la journée pour plus d’uniformité.
5. Effectuez une mesure de la force musculaire. Utilisez un dynamomètre horizontal avec un fil de grille pour mesurer la force musculaire.
   1. Exercez les souris pour un score clinique en les faisant glisser doucement sur la cage 40 fois pour induire la fatigue.
   2. Placez immédiatement chaque souris sur la grille du dynamomètre et tirez doucement par la queue, en vous assurant que toutes les pattes saisissent fermement la grille. Ne considérez que les mesures où les souris saisissent la grille avec leurs quatre pattes.
      REMARQUE : Essayez d’appliquer une force égale lors de chaque mesure, et il est recommandé que le même chercheur effectue toutes les mesures pour maintenir la fiabilité et réduire la variabilité. Étant donné que la fatigabilité est la marque de la faiblesse de la MG, une série de tests de force de préhension doit être effectuée sans mesurer la force de préhension. Par la suite, sept mesures ont été effectuées pour chaque souris, et les valeurs maximale et minimale ont été ignorées. La moyenne des cinq mesures restantes est calculée de manière à garantir des résultats fiables.

4. Préparation de l’échantillon de tissu

REMARQUE : Sacrifiez les souris 28 jours après la deuxième vaccination en suivant les protocoles approuvés par l’établissement. La collecte de sang, de muscles, de rate et de ganglions lymphatiques chez les souris sacrifiées sera bénéfique pour des investigations plus approfondies.

1. Prélèvement de sang cardiaque
   REMARQUE : Pour prélever du sang cardiaque, anesthésie les souris à l’aide d’un anesthésique approprié (par exemple, du propofol) approuvé par le comité d’éthique. La ponction cardiaque nécessite une anesthésie et est une procédure terminale, ce qui signifie que les animaux doivent être euthanasiés immédiatement après.
   1. Après avoir profondément anesthésié le rat, placez-le sur le dos, ouvrez l’abdomen et localisez le cœur, à environ 1 cm au-dessus de la côte la plus basse et légèrement à droite.
   2. À l’aide d’une aiguille de 25 à 35 g, prélevez soigneusement du sang du ventricule gauche à un angle de 45 degrés sans bouger la seringue pour éviter les complications¹¹.
   3. Transférez les échantillons de sang dans des tubes secs pour la séparation du sérum et/ou dans des tubes EDTA pour l’isolement de l’ARN, si prévu.
   4. Séparez le sérum par centrifugation et maintenez les échantillons de sérum à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
2. Conservation et préparation d’échantillons musculaires
   1. Recueillir le muscle tibial antérieur 11,12,13. Rincer avec du PBS glacé.
   2. Placez les échantillons dans des cryotubes, plongez-les immédiatement dans de l’isopentane refroidi à l’azote liquide à -20 °C et conservez-les dans un congélateur à -80 °C.
      REMARQUE : Les échantillons doivent être congelés pour obtenir des résultats plus précis dans les expériences.
   3. Placez les mouchoirs verticalement sur un support de sectionnement ; Un bouchon de liège peut être utilisé. Intégrez les échantillons pour la coloration par immunofluorescence dans le composé OCT (Optimal Cutting Temperature compound).
   4. Laissez le tissu flotter sur de l’isopentane refroidi à l’azote liquide. Conserver au congélateur à -80 °C jusqu’à sectionnement avec un cryostat.

5. Évaluation des jonctions neuromusculaires par marquage par immunofluorescence

1. Section et fixation du cryostat
   1. Sectionner les tissus congelés noyés dans l’OCT à -24 °C sur une épaisseur de 7 μm à l’aide d’un cryostat.
   2. Fixez les sections dans de l’acétone refroidie à -20 °C. Laver avec du PBS pendant 5 min.
   3. Laver à nouveau le PBS contenant 0,4 % de Triton X (PBS-T) pendant 10 min.
      REMARQUE : Une étape de perméabilisation peut être effectuée pour corriger la conformation des molécules affectées par la fixation, assurant une liaison plus précise. La perméabilisation impliquait un traitement avec du PBS contenant 1 % de FBS pendant 10 minutes et du PBS-T pendant 10 minutes supplémentaires.
   4. Bloquez les sections avec PBS-T contenant 10 % de FBS pendant 30 min pour éviter les liaisons non spécifiques.
2. Coloration par immunofluorescence
   REMARQUE : Pour la coloration, les anticorps suivants peuvent être utilisés : C3, IgG, marqueur du récepteur de l’acétylcholine α-bungarotoxine.
   1. Diluer les anticorps sélectionnés dans du PBS-T contenant 1 % de FBS.
   2. Incuber à l’obscurité à température ambiante pendant 2,5 h.
   3. Lavez les sections avec du PBS-T contenant 1 % de FBS.
   4. Contre-coloration avec DAPI.
   5. Conserver les coupes jusqu’à l’examen sous un microscope à fluorescence dans un environnement sombre et humide à 4 °C.
   6. Effectuer des images et des analyses.
      REMARQUE : Les jonctions neuromusculaires positives à la bangarotine (BTX) dans chaque section doivent être comptées à l’aide d’un microscope à fluorescence. Capturez des images avec un grossissement de 20x. Pour l’analyse, les jonctions neuromusculaires BTX et C3 ou IgG positives ont été comptées manuellement au microscope. Le pourcentage de jonctions double-positives par rapport au total des jonctions marquées BTX dans les coupes en série doit être utilisé pour l’analyse.

6. Transfert Western

1. Isolement et quantification des protéines
   1. Utilisez des échantillons de muscle congelés.
   2. Préparez le tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase.
   3. Ajouter des billes d’oxyde de zirconium de 0,5 mm égales au poids de l’échantillon et 2 fois le volume du tampon de lyse.
   4. Homogénéiser les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur.
   5. Centrifuger le lysat à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
   6. Prélever le surnageant contenant le lysat de protéines.
   7. Utilisez un kit de dosage BCA ou un réactif Bradford pour quantifier la concentration en protéines.
   8. Préparez les échantillons de protéines à la concentration souhaitée avec un tampon de lyse. 25 μg de protéines par puits sont efficaces pour montrer l’AChR.
2. Électrophorèse sur gel SDS-PAGE
   1. Mélanger les échantillons de protéines avec 4 tampons Laemmli.
   2. Chauffer les échantillons à 95 °C pendant 5 min pour les dénaturer.
   3. Chargez des quantités égales de protéines et une échelle de protéines dans les puits d’un gel SDS-PAGE.
   4. Faites fonctionner le gel à 200 V pendant 30 min (le temps peut varier entre différentes alimentations).
3. Transfert de protéines
   1. Pour le transfert semi-sec avec membrane nitrocellulosique, mouillez chaque composant avec un tampon de transfert à froid.
   2. Mettre en place le sandwich de transfert : éponge, papier filtre, gel, membrane, papier filtre, éponge.
      REMARQUE : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles entre les couches. Le programme de transfert doit être sélectionné conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
4. Blocage et incubation d’anticorps
   1. Bloquer la membrane dans du lait écrémé en poudre à 5 % ou du BSA dans du TBST pendant 1 h à température ambiante en le balançant doucement.
   2. Incuber la membrane avec l’anticorps primaire (anti-AChR) dilué dans un tampon de blocage à 2,5 % pendant la nuit à 4 °C avec un léger balancement.
   3. Lavez la membrane 3 fois pendant 10 min chacune dans du TBST.
   4. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP (IgG HRP) dilué dans un tampon bloquant à 2,5 % pendant 1 h à température ambiante.
   5. Lavez la membrane 3 fois pendant 10 min chacune dans du TBST.
5. Détection et imagerie
   1. Appliquez le substrat ECL sur la membrane selon les instructions du fabricant.
   2. Capturez le signal chimiluminescent à l’aide d’un système d’imagerie.
   3. Analysez les bandes à l’aide d’un logiciel d’imagerie.
      REMARQUE : Gardez toujours les protéines et les réactifs sur de la glace pour éviter la dégradation. Assurez-vous d’une charge égale en utilisant une protéine d’entretien (par exemple, bêta-actine, alpha-tubuline ou GAPDH) comme contrôle. Optimisez les concentrations d’anticorps et les temps d’incubation pour de meilleurs résultats. Il est crucial de montrer que la protéine AChR est moins exprimée chez les souris immunisées par MuSK.

7. ELISA IgG anti-MuSK fait maison

1. Préparer l’antigène MuSK à une concentration de 0,5 μg par puits dans 100 μL de tampon de bicarbonate de carbonate (revêtement sur plaque).
2. Distribuer 100 μL de la solution d’antigène dans chaque puits d’une plaque d’immunoessai.
3. Incuber la plaque pendant une nuit à 4 °C.
4. Lavez la plaque avec du PBS contenant 0,5 % de Tween 20 (solution de lavage).
5. Incuber la plaque avec du PBS contenant 5 % de FBS (solution de blocage) pendant 90 min à 4 °C pour bloquer les sites de liaison non spécifiques (Blocking).
6. Étant donné que les études d’optimisation ont montré des niveaux élevés de MuSK-IgG, diluez les échantillons de sérum 1/50 000 dans une solution bloquante.
7. Sans laver après le blocage, ajoutez les échantillons de sérum dilué dans les puits.
8. Incuber la plaque à 37 °C pendant 90 min.
9. Lavez la plaque trois fois avec la solution de lavage.
10. Diluer l’anticorps secondaire IgG anti-souris conjugué à HRP (ab97023) 1/5000 dans une solution bloquante.
11. Ajouter 100 μL de l’anticorps secondaire dilué dans chaque puits.
12. Incuber la plaque à 37 °C pendant 90 min.
13. Lavez la plaque trois fois avec la solution de lavage.
14. Ajoutez 100 μL de substrat TMB dans chaque puits et observez le changement de couleur.
15. Arrêtez la réaction au moment approprié à l’aide de 2 M H₂SO_4.
16. Mesurez la densité optique à 450 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
17. Effectuez tous les échantillons en double exemplaire et sur la même plaque pour plus de cohérence.
    REMARQUE : Les valeurs de densité optique doivent être utilisées pour l’analyse, car aucune dilution standard de l’échantillon n’était disponible. Il ne doit pas y avoir de changement de couleur dans les puits de contrôle négatifs (vides). Un changement de couleur rapide est attendu, c’est pourquoi la solution d’arrêt doit être conservée à proximité pour arrêter immédiatement la réaction dans les puits.

Résultats

Lors de l’évaluation et de la validation du modèle de myasthénie grave auto-immune expérimentale MuSK (EAMG), plusieurs paramètres clés et résultats expérimentaux sont essentiels pour démontrer le succès de l’induction et de la caractérisation du modèle de la maladie. Vous trouverez ci-dessous les résultats représentatifs qui confirment la mise en place du modèle MuSK EAMG.

Notation clinique
Les souris sont surveillées et notées pour les symptômes cliniques de la myasthénie...

Discussion

MuSK-EAMG murin imite le MuSK-MG humain à la fois dans ses aspects cliniques et immunopathogènes en termes de faiblesse musculaire, de perte de poids due à la faiblesse du muscle bulbaire, d’anticorps anti-MuSK circulants et de réduction de l’AChR musculaire. En ce qui concerne les jalons et l’échéancier prévu pour ce modèle MuSK-EAMG, les signes cliniques de faiblesse musculaire devraient apparaître au cours de la première semaine suivant la deuxième vaccination. Environ 5 % des souris ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
125I-&alpha ;-bungarotoxine	Invitrogen	BTX T1175
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631
40 &mu ; m Cellule Strainer	NEST	258369
96 puits Maxisorp plaque	Sigma-Aldrich	M9410
Adjuvant Incomplet	Becton Dickinson & Co.  ;	263910
Anti-AChR alfa1  ;	Alomone	ANC-001
Anti-souris IgG HRP	Abcam	ab97023
Bullet Blender Storm	Next Advance		Homogénéisateur de tissus
C3	Novus	NB200-540G
Tampon carbonate-bicarbonate	Merck	C3041
Cryostat	Leica	CM1860  ;
Dynamomètre Imada DST-50N	Muromachi	MK380Si
Microscope à fluorescence	Leica	DM4M
Seringue en verre avec luer lock	ISOLAB	094.92.005
IgG	Abcam	ab96871
Photomètre sur microplaques, Multiskan FC	Thermo Scientific	51119000
Kit chirurgical pour souris	Kent Scientific Corparation	INSMOUSEKIT
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Becton Dickinson & Co.& nbsp ;
OCT Compound	Agar Scientific	AGR1180
seringues, 1 mL	Becton Dickinson & Co.& nbsp ;
Seringues 309625, 2 mL	B. Braun	7389
Dispositif universel de contention pour animaux	Merck	Z756911-1EA
WesternBright Sirius-Western kit de détection de transfert	Advansta	K-12043-D10	ECL