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Article de méthode

Imagerie calcique unicellulaire pour l’étude de l’activation des canaux ioniques calciques

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DOI :

10.3791/67412

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13 décembre 2024

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1School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine, 2School of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article présente une méthode de surveillance quantitative en temps réel des concentrations d’ions calcium (Ca2+) dans les cellules à l’aide de l’imagerie unicellulaire Ca2+ avec le colorant Fura-2/AM. Cette technique permet un chargement efficace du colorant et un calcul précis des niveaux de Ca2+ grâce aux rapports d’intensité de fluorescence, ce qui en fait une approche simple et rapide pour les applications de recherche.

Résumé

L’imagerie Ca2+ sur cellule unique est essentielle pour l’étude des canaux Ca2+ activés par diverses stimulations telles que la température, la tension, les composés natifs et les produits chimiques, etc. Il s’appuie principalement sur la technologie d’imagerie par microscopie et l’indicateur Ca2+ Fura-2/AM (AM est l’abréviation de Acetoxymethyl ester). À l’intérieur des cellules, Fura-2/AM est hydrolysé par les estérases en Fura-2, qui peut se lier de manière réversible avec le Ca2+ cytoplasmique libre. La longueur d’onde d’excitation maximale passe de 380 nm à 340 nm (lorsqu’elle est saturée de Ca2+) lors de la liaison. L’intensité de fluorescence émise est quantitativement liée à la concentration de Ca2+ lié. En mesurant le rapport 340/380, la concentration de Ca2+ dans le cytoplasme peut être déterminée, éliminant ainsi les erreurs causées par les variations de l’efficacité de charge de la sonde fluorescente entre différents échantillons. Cette technologie permet un suivi en temps réel, quantitatif et simultané des changements de Ca2+ dans plusieurs cellules. Les résultats sont stockés dans ". XLSX » pour l’analyse ultérieure, qui est rapide et génère des courbes de changement intuitives, améliorant considérablement l’efficacité de la détection. Sous différents angles expérimentaux, cet article répertorie l’utilisation de cette technologie pour détecter les signaux Ca2+ dans des cellules avec des protéines de canal endogènes ou surexprimées. Entre-temps, différentes méthodes d’activation des cellules ont également été présentées et comparées. L’objectif est de fournir aux lecteurs une compréhension plus claire de l’utilisation et des applications de l’imagerie Ca2+ sur cellule unique.

Introduction

Ca2+ joue un rôle crucial dans la transduction du signal cellulaire, régulant diverses fonctions cellulaires telles que la contraction musculaire1, la conduction nerveuse2, la sécrétion3 et l’expression des gènes4, influençant ainsi plusieurs processus physiologiques. Des concentrations anormales de Ca2+ peuvent entraîner des maladies telles que des arythmies5, des troubles de la coagulation6 et des déséquilibres hormonaux7. Par conséquent, l’étude des mécanismes des changements de concentration intracellulaire en Ca2+ est d’une importance capitale.

Divers canaux ioniques sont impliqués dans la régulation de la concentration de Ca2+ dans les cellules, y comprisles canaux 8 du calcium activé par la libération de calcium (CRAC) hautement sélectifs en Ca2+ et les canaux cationiques non sélectifs de la famille TRP9. Ces canaux ioniques peuvent être activés par des stimuli tels que la température10, les composés et les ingrédients actifs trouvés dans la médecine traditionnelle chinoise11, jouant un rôle crucial dans divers processus physiologiques liés au Ca2+.

Une surveillance efficace des changements de concentration intracellulaire de Ca2+ est essentielle pour étudier les canaux ioniques liés au Ca2+, en particulier dans le domaine de la médecine traditionnelle chinoise, où la régulation de la signalisation calcique joue un rôle central dans de nombreuses approches thérapeutiques. À l’heure actuelle, les principales méthodes de mesure du Ca2+ intracellulaire peuvent être classées en deux types : les mesures électriques et les mesures optiques. L’approche de mesure électrique utilise la technique du patch-clamp pour évaluer les changements de potentiel de membrane cellulaire dus à l’influx de Ca2+ 12.

En mesure optique, les sondes fluorescentes se lient spécifiquement au Ca2+, ce qui permet aux chercheurs de suivre les changements d’intensité de la fluorescence cellulaire. Les méthodes optiques courantes comprennent les techniques à base de protéines fluorescentes et les techniques à base de colorants fluorescents. Dans les méthodes basées sur les protéines fluorescentes, les chercheurs peuvent surexprimer des protéines fluorescentes sensibles au Ca2+ comme Cameleon13 et GCaMP14 dans les cellules et surveiller les changements de signal de fluorescence à l’aide de la microscopie à fluorescence ou de la cytométrie en flux pour observer les changements dans les concentrations cytoplasmiques de Ca2+ . De plus, les chercheurs peuvent surexprimer ces protéines chez la souris et utiliser la microscopie à fluorescence à deux photons pour la surveillance en temps réel in vivo ou au niveau tissulaire des concentrations intracellulaires de Ca2+ , offrant une haute résolution et une pénétration profonde des tissus10.

Pour les méthodes à base de colorants fluorescents, les sondes Ca2+ couramment utilisées comprennent Fluo-3/AM, Fluo-4/AM et Fura-2/AM10. Les chercheurs incubent des cellules dans une solution contenant ces sondes fluorescentes, qui traversent la membrane cellulaire et sont clivées par des estérases intracellulaires pour former des composés actifs (par exemple, Fluo-3, Fluo-4 et Fura-2) qui restent à l’intérieur de la cellule. Ces sondes présentent une fluorescence minimale dans leur forme de ligand libre, mais émettent une forte fluorescence lorsqu’elles sont liées au Ca2+ intracellulaire, indiquant ainsi des changements dans les concentrations cytoplasmiques de Ca2+ . Comparé à d’autres protéines et colorants fluorescents, Fura-2 est généralement excité à des longueurs d’onde de 340 nm et 380 nm. Lorsqu’il est lié à du Ca2+ libre intracellulaire, Fura-2 subit un décalage d’absorption, déplaçant le pic de longueur d’onde d’excitation de 380 nm à 340 nm, tandis que le pic d’émission près de 510 nm reste inchangé. Il existe une relation quantitative entre l’intensité de fluorescence et la concentration liée en Ca2+ , ce qui permet de calculer la concentration intracellulaire en Ca2+ en mesurant le rapport d’intensité de fluorescence à ces deux longueurs d’onde d’excitation. Les mesures de rapport réduisent les effets du photoblanchiment, des fuites de la sonde fluorescente, des charges inégales et des différences d’épaisseur des cellules, ce qui permet d’obtenir des résultats plus fiables et reproductibles (Figure 1).

Les systèmes d’imagerie Ca2+ unicellulaire utilisent principalement des techniques de microscopie et l’indicateur Ca2+ Fura-2/AM pour détecter les concentrations intracellulaires de Ca2+ . Ces systèmes comprennent un microscope à fluorescence, une source lumineuse d’imagerie Ca2+ et un logiciel d’imagerie par fluorescence, permettant un suivi quantitatif en temps réeldes modifications du cytoplasme de plusieurs cellules simultanément (jusqu’à 50 cellules par champ de vision). Les résultats sont enregistrés au format « .xlsx » pour une analyse ultérieure. Le système offre une vitesse d’analyse rapide (environ 1 min pour l’analyse d’un groupe de cellules dans un champ de vision) et génère des courbes de changement intuitives, améliorant considérablement l’efficacité de la détection. L’imagerie Ca2+ unicellulaire est une approche technique essentielle pour l’étude des canaux liés au Ca2+ et présente une valeur considérable dans la recherche biomédicale liée aux canaux ioniques. Son application dans la technologie d’imagerie calcique unicellulaire devrait faire progresser considérablement la recherche sur les mécanismes sous-jacents à la médecine traditionnelle chinoise.

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Protocole

Les méthodes expérimentales ont été approuvées et ont suivi les directives de l’IACUC de l’Université Tsinghua et de l’Université de médecine chinoise de Pékin. Ce protocole introduit des méthodes d’imagerie Ca2+ unicellulaire pour divers types de cellules, y compris des kératinocytes primaires isolés de la peau de plusieurs souris nouveau-nées (dans les trois jours suivant la naissance, avec des compagnons de portée randomisés en fonction du sexe, des souris C57BL/6). Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation cellulaire

NOTE: Les cellules primaires, les lignées cellulaires avec des gènes cibles endogènes ou celles transfectées avec des plasmides surexprimés sont toutes adaptées à l’imagerie Ca2+ unicellulaire. Les plasmides utilisés dans cette étude ont été obtenus dans le laboratoire du professeur Xiao Bailong à l’Université Tsinghua. Ces plasmides ont été construits en incorporant des séquences de la protéine fluorescente GFP avec l’humain STIM1, de la protéine fluorescente DsRed avec l’humain Orai1, de la protéine fluorescente mRuby avec le lapin TRPV1, ainsi que de la protéine fluorescente rouge mCherry dans des vecteurs plasmidiques de phage10.

  1. Préparez des lames de verre stériles d’un diamètre de 8 mm dans une plaque à 24 puits. Ajouter 500 μL de tampon poly-D-lysine (PDL) (50 μg/mL dans DPBS) dans chaque puits.
  2. Incuber les lames à 37 °C pendant 1 h pour permettre l’enrobage, puis jeter la solution d’enrobage à l’aide d’une pipette.
  3. Lavez les lames une fois avec du DPBS et mettez-les de côté pour une utilisation ultérieure.
  4. Cultiver des cellules primaires et des lignées cellulaires séparément selon leurs méthodes de culture spécifiques10.
  5. Semez les cellules sur la plaque préparée de 24 puits à une densité d’environ 1,5 x 10,5 cellules par puits. Utilisez les cellules pour l’imagerie Ca2+ une fois qu’elles ont adhéré à la lamelle.
  6. Pour les cellules qui surexpriment des plasmides, transfecter10,15 le plasmide cible (1 μg/puits) à l’aide du réactif de transfection Lipofectamine 2000 (ou Lipofectamine 3000) dans un rapport de 1:1, et incuber dans un incubateur de culture cellulaire pendant environ 24 h.
    NOTE: Un temps d’incubation plus long peut être nécessaire pour les protéines exprimées plus grandes.

2. Préparation de la solution de travail Fura-2/AM

  1. Ajouter 50 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un tube contenant 50 μg de poudre de Fura-2/AM et bien mélanger pour préparer une solution mère de 1 μg/μL de Fura-2/AM.
  2. Mélangez la solution mère de Fura-2/AM et de Pluronic F-127 dans le tampon de Hank contenant 1,3 mM de Ca2+.
    NOTE: La concentration finale de Fura-2/AM et de Pluronic F-127 dans la solution de travail est de 2,5 μg/mL. Le tampon de Hank’s est préparé en ajoutant 10 mM de HEPES à 1x tampon HBSS.
  3. Utilisez du papier d’aluminium pour protéger la solution de travail Fura-2/AM de la lumière.

3. Prétraitement cellulaire pour l’imagerie Ca2+ unicellulaire

  1. Transférez les lames de verre avec les cellules dans une nouvelle plaque à 24 puits contenant le tampon de Hank pour le lavage.
  2. Jetez le tampon à l’aide d’une pipette et ajoutez 500 μL de tampon de travail Fura-2/AM dans chaque puits.
  3. Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 min pour permettre le chargement de la sonde.
  4. Retirez le tampon de travail Fura-2/AM et lavez les cellules trois fois avec le tampon de Hank pour éliminer l’excès de Fura-2/AM. Les cellules sont maintenant prêtes à l’emploi.

4. Démarrage du système d’imagerie Ca2+

REMARQUE : Dans cette étude, un microscope à fluorescence est utilisé pour l’imagerie Ca2+ .

  1. Démarrez les composants suivants dans l’ordre : lumière DG4 (lampe au xénon), caméra, source de lumière blanche, contrôleur de platine de microscope, microscope, ordinateur et logiciel d’imagerie de fluorescence.
    NOTE: Si vous détectez l’activation des canaux ioniques par la température, allumez également les composants suivants : système de perfusion, système de chauffage, régulateur de température et dispositif de chauffage/refroidissement à circulation de liquide.

5. Procédure de réponse cellulaire Ca2+

  1. Ouvrez le logiciel d’imagerie par fluorescence (voir Tableau des matériaux).
    1. Choisissez Protocole, puis Fichier, puis Charger le protocole. Sélectionnez le protocole et cliquez sur OK.
    2. Configurez l’expérience (dans la liste des menus).
    3. Sélectionnez Nouvelle expérience.
  2. Montez la chambre de perfusion sur le microscope.
    NOTE: Abaissez toujours complètement l’objectif lors du montage ou du retrait des chambres à l’aide du bouton de mise au point approximatif pour éviter d’endommager l’objectif.
  3. Retirez les lames de cellules traitées à Fura-2/AM et placez-les dans la chambre contenant le tampon de Hank.
  4. Démarrez le système de perfusion.
  5. Sélectionnez l’objectif DIC 20x et ajustez la mise au point sous lumière blanche.
  6. Cliquez sur Cfg Exp dans la barre des tâches.
    1. Sélectionnez les fluors souhaités pour l’imagerie.
    2. Déterminez la fréquence d’acquisition et les paramètres d’affichage à l’écran (Acquérir : vérifiez 340, 380, GFP ; Intervalle d’acquisition : 1 s ; Intervalle de sauvegarde : 1 s).
  7. Foyer
    1. Sur le panneau de configuration de l’expérience, cliquez sur le bouton Focus .
    2. Ajustez le temps d’acquisition (généralement 100 ms) et le gain selon vos besoins, puis « économisez pour cette onde ».
      NOTE: Pour la lumière UV, utilisez le gain au lieu du temps d’exposition.
    3. Choisissez la longueur d’onde souhaitée pour la mise au point (par exemple, 380) et cliquez sur Démarrer la mise au point.
    4. Basculez la vue des jumelles à celle de l’ordinateur.
    5. Assurez-vous qu’une légère couleur verdâtre est visible à travers les jumelles.
    6. Concentrez-vous sur les cellules, en utilisant d’abord la mise au point approximative pour rapprocher l’objectif, puis la mise au point fine.
      NOTE: Le microscope émettra un bip s’il s’approche trop près de la platine. Si cela se produit, abaissez l’objectif, réalignez la plaque sur la scène et concentrez-vous à nouveau. Minimisez le temps passé à vous concentrer pour réduire les dommages cellulaires induits par le laser.
    7. Vérifiez l’intensité de fluorescence des cellules pendant le processus de mise au point.
    8. Ajustez l’intensité de fluorescence des cellules en modifiant le temps et le gain d’exposition.
      NOTE: Le temps d’exposition et le gain pour 340 et 380 doivent être constants.
    9. Une fois la mise au point correcte, appuyez sur le bouton du microscope pour basculer la vue sur l’ordinateur.
    10. Refaites la mise au point si nécessaire pour obtenir l’image la plus nette sur l’ordinateur, puis cliquez sur Arrêter la mise au point.
  8. Procédure alternative pour trouver des cellules positives à la GFP
    1. Utilisez d’abord la procédure 340/380 pour obtenir une bonne concentration sur les cellules.
    2. Sélectionnez FITC, puis cliquez sur Commencer la mise au point.
    3. Utilisez le contrôleur de platine pour trouver des cellules GFP positives.
    4. Basculez la vue sur l’ordinateur, puis cliquez sur Arrêter la mise au point.
  9. Sélection de la région
    1. Cliquez sur le bouton Région dans la barre de menus.
    2. Sélectionnez le type d’éclairage de votre choix (340/380/FITC/TRITC). Les filtres FITC et TRITC sont sélectionnés pour GFP et mCherry/DsRed/mRuby, respectivement, pour les cellules surexprimant les plasmides ciblés ; sinon, sélectionnez Fura-2.
      NOTE: Évitez de sélectionner des cellules en mauvais état ou mortes, comme celles qui sont manifestement arrondies ou qui ont des protéines fluorescentes surexposées.
    3. Cliquez sur Acquérir des images, puis sur OK.
    4. Une nouvelle fenêtre apparaîtra ; Sélectionnez des cellules en cliquant sur l’outil Ovale , puis en cliquant sur la cellule.
    5. Sélectionnez les cellules souhaitées sous la fluorescence portée par la protéine cible (FITC ou TRITC). Sélectionnez les cellules de contrôle qui n’expriment pas la protéine cible dans les conditions de 380 nm.
    6. Annulez une région en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le cercle, puis en sélectionnant Supprimer la région.
    7. Sélectionnez un échantillon d’arrière-plan comme dernière région et enregistrez son numéro d’identification.
    8. Cliquez sur Enregistrer , puis sur Terminé.
  10. Soustraction d’arrière-plan
    1. Cliquez sur le bouton de menu Références.
    2. Indiquez le numéro de la région d’arrière-plan.
      NOTE: Si l’arrière-plan était la dernière région sélectionnée, la saisie d’un nombre très élevé passera automatiquement à la dernière région sélectionnée.
    3. Cochez la case Soustraire des références, puis cliquez sur OK.
  11. Données de journal
    1. Cliquez sur le bouton Enregistrer les données dans le panneau de configuration de l’expérience.
      NOTE: Les images ne sont sauvegardées que s’il y a un désir de rejouer l’expérience plus tard ; Normalement, il suffit de cocher la case des données.
    2. Assurez-vous qu’une invite s’affiche pour vous demander le type de fichier de données préféré. Sélection. Le format xlsx est recommandé.
    3. Une feuille de travail de type « .xlsx » s’ouvrira. Réduire la feuille de calcul l’empêchera d’occuper de l’espace à l’écran.
  12. Acquisition de données
    1. Dans la section Time Lapse du panneau de configuration, réglez l’intervalle d’acquisition des données sur 1 s.
      NOTE: Celui-ci peut être ajusté en fonction des besoins réels.
    2. Cliquez sur Zero Clock et Acquire dans le panneau de configuration de l’expérience pour démarrer l’expérience. Les lignes de base seront visibles sur un graphique indiquant chacune des régions de cellule sélectionnées.
    3. Effectuer une série de traitements sur les cellules selon les exigences expérimentales.
    4. Pour observer la réponse en température des cellules, chauffez le tampon dans le système de perfusion à une température appropriée à l’aide d’un régulateur de température.
    5. Pour observer les effets des médicaments sur les cellules, perfuser ou ajouter manuellement un tampon contenant du médicament et enregistrer les modifications cellulaires.
    6. Une fois l’acquisition des données terminée, cliquez sur Pause.
      NOTE: L’acquisition des données peut être interrompue et l’horloge peut être réinitialisée à tout moment pendant l’expérience.
    7. Enregistrez et analysez les données.
  13. Cliquez sur Fichier et fermer l’expérience pour terminer l’expérience, puis sélectionnez Non dans la boîte de dialogue pour enregistrer le protocole.
  14. Ouvrez une nouvelle expérience en cliquant sur Nouveau dans le menu, et répétez le processus.
  15. Arrêter
    1. Fermez le logiciel et transférez les données de l’ordinateur.
    2. Inversez la procédure de démarrage.
    3. Notez les heures sur la feuille d’inscription et nettoyez tout désordre.
  16. Analyse des données
    1. Représenter la concentration intracellulaire de Ca2+ par le rapport Fura-2 340/380 ou convertir en concentration de Ca2+ correspondante.

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Résultats

Détection de la réponse en température
Kératinocytes primaires
Les kératinocytes primaires ont été isolés chez des souris nouveau-nées et préparés selon les protocoles établis10. Ces cellules ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits contenant des lames de verre. Suite à la mise en charge de la sonde Fura-2, la mise au point a été ajustée au microscope à une longueur d’onde de 380 nm pour obtenir une visualisation claire de la morphologie cellulaire, comme i...

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Discussion

L’application des systèmes d’imagerie Ca2+ unicellulaire est vaste, permettant l’étude des signaux Ca2+ dans divers types de cellules, y compris les kératinocytes, les cellules souches16, les cellules hépatiques, les cellules cardiaques17, les podocytes18, les cellules immunitaires et les lignées cellulaires surexprimant les protéines cibles10,19

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Bailong Xiao de l’Université Tsinghua pour le partage du système d’imagerie Ca2+ à cellule unique et du système d’exploitation de contrôle de la température, ainsi que pour le soutien et l’assistance dans ce projet. Cette recherche a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32000705), le programme de parrainage des jeunes scientifiques d’élite de l’Association chinoise de médecine chinoise (CACM-(2021–QNRC2–B11)), les fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (2020–JYB–XJSJJ–026), (2024-JYB-KYPT-06).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Appareil photoNikon
CapsaicineSigma211275
CL-100 régulateur de températureWarner Instruments
Acide cyclopiazonique (CPA)SigmaC1530
DG-4 lumièreSutter Instrument Company
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)  ;Amresco231
DPBSThermofisher14190144
Logiciel d’imagerie par fluorescence (MetaFluor, Logiciel payant)  ;Dispositifs
Microscope à fluorescenceNikon
Fura-2/AMInvitrogenF1201
HBSS tamponGibco14175103
HEPES  ;SigmaH3375
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000008
Pluronic F-127  ; BeyotimeST501
poly-D-lysine  ; BeyotimeST508
SC-20 Appareil de chauffage/refroidissement à circulation de liquide  ;Harvard
Source de lumière blancheNikon
moléculairesAppareil de

Références

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Réimpressions et autorisations

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