Formulation de nanomatériaux à base de zinc à partir de l’extrait d’écorce d’Eucommia ulmoides et de leur potentiel de cicatrisation

Résumé

Nous présentons ici un protocole permettant de synthétiser les nanoparticules d’oxyde de zinc (ZnO) à l’aide de l’extrait aqueux riche en polyisoprène obtenu à partir de l’écorce d’arbre Eucommia ulmoides . Le potentiel de cicatrisation des plaies présenté par les nanoparticules de ZnO synthétisées sur les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) a été évalué à l’aide d’un test de grattage, une méthode simple, rentable et efficace.

Résumé

L’extrait aqueux de l’écorce d’Eucommia ulmoides est une riche source de composés bioactifs avec de nombreux avantages pour la santé. Le protocole vise ici à explorer la préparation de nanoparticules d’oxyde de zinc (ZnO) à l’aide de l’extrait aqueux riche en polyisoprène médié par l’écorce d’Eucommia ulmoides . Pendant ce temps, le protocole proposé est associé à la préparation du matériel de cicatrisation des plaies en facilitant le processus. De plus, le potentiel de cicatrisation des nanoparticules synthétisées (Eu-ZnO-NPs) a été évalué à l’aide d’un simple test de grattage sur une monocouche de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC). Après 24 h de traitement avec des NP-Eu-ZnO, la prolifération cellulaire et la migration des cellules HUVEC ont été évaluées. À la fin de l’étude, une prolifération et une migration cellulaires ont été observées dans des monocouches rayées traitées avec différentes concentrations d’Eu-ZnO-NPs, tandis que de faibles taux de migration et de prolifération cellulaires ont été observés dans les cellules témoins. Parmi les concentrations choisies, 20 μg/mL de nanomatériaux Eu-ZnO ont montré une meilleure migration cellulaire et un potentiel de cicatrisation des plaies accru.

Introduction

Il a été démontré que les plantes médicinales et les composés dérivés de plantes présentent de nombreux avantages pour la santé¹. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) a indiqué que 80 % de la population mondiale dépend des plantes médicinales traditionnelles pour les soins de santé primaires. La Chine est bien connue et populaire pour ses pratiques de médecine traditionnelle chinoise (MTC). Les herbes médicinales chinoises ont été signalées pour traiter diverses maladies et utilisées pour leur potentiel biologique. Les plantes médicinales servent de réservoirs de composés bioactifs et de multiples rôles thérapeutiques. Des plantes médicinales ont également été utilisées pour traiter les blessures. Il existe plusieurs types d’approches appliquées pour traiter les plaies chroniques². Une enquête récente a révélé que les plantes médicinales étaient impliquées dans le processus de cicatrisation des plaies en fournissant des conditions favorables à la cicatrisation, exemptes d’infections, et en fixant la régénération des tissus³. Pendant ce temps, les propriétés antibactériennes et antifongiques des composés bioactifs présents dans les plantes médicinales peuvent aider à guérir les plaies et à accélérer l’efficacité de la cicatrisation des plaies⁴.

Les nanomatériaux à base de métaux attirent l’attention en raison de leurs propriétés biocompatibles et biodégradables. Eucommia ulmoides, communément appelé l’hévéa chinois, est une espèce originaire de Chine. Les feuilles et l’écorce de l’arbre sont utilisées dans les pratiques médicinales. Plus important encore, l’espèce végétale a été cultivée dans les provinces du centre et de l’ouest de la Chine⁵. Peng et ^al.6ont rapporté que les feuilles, les écorces et les fleurs staminées étaient comestibles avec un potentiel thérapeutique. De plus, E. ulmoides est la meilleure source de lignanes, de phénylpropanoïdes, d’iridoïdes, de flavonoïdes, d’acides aminés et d’oligo-éléments. De plus, l’écorce a été utilisée pour diverses applications biomédicales telles que le contrôle de la pression artérielle, la réduction des graisses et la promotion de l’antiostéroporose et de l’activité hypoglycémiante⁷. Par conséquent, il a sans aucun doute été prouvé que l’extrait d’écorce d’E. ulmoides a une longue histoire dans la médecine traditionnelle chinoise. Des rapports antérieurs suggéraient que le polymère naturel polyisoprène est riche en écorces d’Eucommia ulmoides⁸. Sur la base des informations ci-dessus, le présent travail vise à fabriquer des nanomatériaux à partir d’extraits d’écorce d’Eucommia ulmoides . La combinaison de zinc et d’extrait d’écorce est un choix attrayant pour la préparation de nanomatériaux. Dans l’ensemble, l’objectif ultime de la présente étude était de fabriquer un nouveau nanomatériau hybride pour des applications de cicatrisation des plaies.

Protocole

REMARQUE : Avant de préparer l’extrait, le matériau d’écorce obtenu a été lavé deux fois à l’eau déminéralisée et séché dans un endroit ombragé. Les écorces séchées à l’ombre ont été stockées dans un contenant hermétique.

1. Préparation de l’extrait d’écorce d’Eucommia ulmoides

1. Hachez l’écorce récoltée sur l’arbre Eucommia ulmoides en petits morceaux à l’aide de ciseaux.
2. Lavez les matériaux d’écorce hachés deux fois avec de l’eau distillée deux fois.
3. Faites sécher les morceaux d’écorce à moins de 37 °C pendant 24 h dans des conditions ombragées.
   1. Ajustez la durée du processus de séchage en fonction de la quantité d’écorce utilisée pour l’étude. Assurez-vous que les écorces sont complètement sèches avant de les couper en petits morceaux. Évitez la lumière directe du soleil.
4. Transvaser 20 g d’écorces séchées à l’ombre dans une fiole conique contenant 220 mL d’eau stérile double distillée et chauffer à 130 °C pendant 20 min.
   1. La couleur de la solution réactionnelle vire au jaune clair. Les changements de couleur de la solution se produisent après 10 min. Laissez la solution chauffer pendant encore 10 min. Ajustez le volume d’eau distillée deux fois en fonction de la quantité d’échantillon.
5. Conservez l’extrait brut contenant du polyisoprène à 4 °C pour une utilisation ultérieure. La formation d’une structure filiforme indique la présence de polyisoprène dans les extraits.

2. Biosynthèse de nanoparticules de ZnO médiées par l’écorce d’E. ulmoides

1. Ajouter 1 M de nitrate de zinc dihydraté Zn (NO₃)₂ à 50 mL d’eau désionisée dans une fiole conique de 500 mL. Agitez en continu à l’aide d’un brassage magnétique (60 tr/min). Le Zn (NO₃)₂ met 30 minutes à se dissoudre complètement.
2. Ajouter 15 mL d’extrait d’écorce d’E. ulmoides goutte à goutte à 20 mL de solution de nitrate de zinc dihydraté (Zn (NO₃)₂).
3. Placez le mélange réactionnel couvert sur un agitateur magnétique, allumez l’agitateur et faites-le tourner à (60 tr/min) pendant 3 h.
4. Ajouter 1 solution d’hydroxyde de sodium 1 N NaOH (3 mL) goutte à goutte au mélange réactionnel pour ajuster le pH à 9. Ajoutez du NaOH jusqu’à ce que le mélange de solution devienne blanc laiteux et que le pH ne dépasse pas 9. La solution prend une couleur blanc laiteux lorsque des nanoparticules de ZnO se forment.
   1. La préparation de 1 M de volume de solution de nitrate de zinc dihydraté Zn (NO₃)₂ peut varier en fonction des besoins expérimentaux. Assurez-vous d’utiliser les extraits d’écorce fraîchement préparés. Si le pH dépasse 10, cela entraînera une agrégation de nanoparticules.
5. Transvasez les Eu-ZnO-NPs synthétisés dans un tube à centrifuger de 50 mL et centrifugez-le à 100 x g pendant 5 min à 4 °C.
   REMARQUE : Les impuretés peuvent être évitées par un lavage immédiat.
6. Recueillir les Eu-ZnO-NPs lavés dans une plaque de verre et les faire sécher à 45-50 °C pendant 1 h dans un four à air chaud.
   REMARQUE : Si les Eu-ZnO-NPs sont conservés pendant plus de 30 minutes, cela peut affecter la nature physicochimique des nanoparticules

3. Confirmation de la taille à l’aide de la GDT

1. Préparez 1 mg/mL de nanoparticules dans du DDH₂O et chargez 5 μL d’échantillon Eu-ZnO-NP dans la grille de cuivre et attendez qu’il sèche complètement. Vortex l’échantillon avant de le charger sur la grille de cuivre.
2. Chargez la grille de cuivre contenant les Eu-ZnO-NPs sur le support d’échantillon TEM et acquérez des images à des grossissements de 50x et 100x.
   REMARQUE : Les grilles doivent être ramassées à l’aide d’une pince à épiler au cours de cette étape.

4. Évaluation de la cytotoxicité

1. Semez 1 × 10⁴ HUVECs dans chaque puits d’une plaque de 96 puits et placez-le dans un incubateur à 5 % de CO₂ 37 °C.
2. Ajouter 10 μL de différentes concentrations de 0, 10, 20, 30, 40 et 50 μg/mL d’Eu-ZnO-NPs dans les cellules confluentes à 90 % et incuber pendant 24 h.
3. Après l’incubation, retirer l’ancien milieu sans déranger les cellules, ajouter 10 μL de solution de CCK-8 dans chaque puits contenant 90 μL de milieu DMEM frais, et incuber dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C.
4. Mesurer l’absorbance des cellules traitées avec la solution de CCK8 à 450 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
   REMARQUE : L’absorbance a été mesurée immédiatement dans les 15 minutes pour éviter les changements d’absorbance.

5. Préparation des cellules HUVEC pour le test de grattage

1. Ensemencer une quantité appropriée (1 × 10⁵) de HUVECs dans des plaques de culture à 12 puits contenant le milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pen-streptocoque et l’incuber dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C.
   1. Avant d’effectuer le test de rayure, vérifiez la confluence à l’aide du microscope inversé.
      REMARQUE : Pour effectuer le test de rayure, 6 plaques de puits ou 12 plaques seront utilisées en fonction des exigences, et la densité cellulaire variera pour différentes plaques de culture. L’utilisation de cellules confluentes de 70 à 80 % est idéale et recommandée pour le dosage des rayures. Le volume du milieu DMEM peut varier en fonction des plaques de culture utilisées dans l’étude. Par exemple, les plaques à 6 puits nécessitent 1 à 1,5 mL de milieu de culture, et les plaques à 12 puits nécessitent 0,5 à 1,0 mL de milieu de culture.
2. Faites une égratignure délicate à l’aide d’une pointe de pipette stérile de 200 μL dans la plaie représentative d’une largeur de plaie de 200 μm.
3. Assurez-vous que la pointe utilisée pour faire des rayures sur la monocouche de cellules entre en contact avec la surface des cellules.
   REMARQUE : Chaque fois qu’une égratignure est faite, utilisez l’embout stérile.
4. Retirez le milieu complet et lavez la monocouche HUVEC à l’aide de 1 mL de 1x PBS pour retirer les cellules détachées.
   REMARQUE : Assurez-vous que les cellules monocouches détachées sont complètement retirées des puits respectifs. Confirmez qu’aucun dommage n’a été causé dans la zone créée par la plaie.
5. Pour évaluer le potentiel de cicatrisation des NP-Eu-ZnO synthétisés, ajoutez dans les puits des concentrations de 0 (contrôle), 10 et 20 μg/mL de nanoparticules d’Eu-ZnO combinées à un milieu complet contenant 10 % de FBS. Maintenir les plaques expérimentales à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ .
   REMARQUE : Ne dérangez pas la monocouche cellulaire lors de l’ajout du milieu frais et complet. Veiller à ce que les cellules monocouches ne soient pas perturbées pendant l’incubation.
6. Acquérir des microphotographies à 0 h et 24 h à l’aide d’un microscope inversé. Utilisez l’outil d’annotation pour mesurer la fermeture de la plaie à différents intervalles de temps.
   1. Calculez le pourcentage de fermeture de la plaie à l’aide de la formule suivante : Fermeture de la plaie ( %) = [(migration cellulaire (en μm) à 0 h - migration cellulaire (en μm) à 24 h)/ migration cellulaire (en μm) à 0 h] x 100.

Résultats

La présente étude vise à synthétiser des nanoparticules à l’aide d’écorces d’arbres Eucommia ulmoides . L’écorce a été complètement séchée dans un environnement ombragé (figure 1). Les matériaux écorciers ont été utilisés pour préparer l’extrait aqueux de brut à l’eau chaude en chauffant les échantillons à 130 °C pendant 20 min. Une légère altération de la température et de la durée peut perturber les phytocomposés et les rendre impropres à la préparation de l’extrait aqueux. Les extraits aqueux bruts d’écorce d’E. ulmoides ont été préparés et utilisés pour la synthèse de nanoparticules (figure 2). L’extrait préparé peut être utilisé immédiatement. L’extrait stocké pendant une période prolongée peut influencer le processus de synthèse. Par conséquent, un extrait fraîchement préparé est recommandé pour la préparation de nanoparticules.

La synthèse réussie des NP de ZnO médiées par des extraits d’écorce brute a été confirmée par l’apparition d’une couleur blanc laiteux et un changement du pH (Figure 3). Le pH est étroitement lié à la taille des nanoparticules, et un pH supérieur à 9 entraîne une agglomération et une taille inégale. La structure des nanomatériaux synthétisés a été confirmée à l’aide de l’analyse TEM, et les nanoparticules synthétisées ont affiché une taille de particule de 80 à 90 nm, comme le montre la figure 4. Le NaOH doit être ajouté goutte à goutte pour éviter un changement soudain du mélange réactionnel. Les nanoformulations à base de métaux sont adaptées, peu coûteuses et moins toxiques. Cependant, les nanomatériaux à base de métaux sont bien connus pour leurs fonctions biologiques.

La cytotoxicité des Eu-ZnO-NPs contre les cellules HUVECs a été déterminée par dosage CCK-8 avec exposition à différentes concentrations d’Eu-ZnO-NPs pendant 24 h. Les résultats ont indiqué que les Eu-ZnO-NPs ne présentaient aucun changement notable de cytotoxicité pour les cellules HUVEC à la concentration plus élevée de 50 μg/mL (figure 5). La quantité appropriée de cellules a été chargée et une taille uniforme de plaies a été réalisée à l’aide d’une pointe de pipette stérile de 200 μL. Le volume cellulaire dépassant la limite peut entraîner une modification du pH et un ralentissement du taux de prolifération. Les migrations de cellules et la fermeture de la plaie ont été observées dans le groupe de traitement après 24 h de traitement, alors qu’aucun changement similaire n’a été observé chez le témoin. Les résultats de l’activité de cicatrisation des plaies ont révélé que les Eu-ZnO-NPs synthétisés présentaient des propriétés cicatrisantes sur les lignées cellulaires HUVEC. Une concentration de 20 μg/mL de nanomatériaux Eu-ZnO favorise une migration cellulaire plus rapide et des propriétés de cicatrisation améliorées. Plus important encore, les nanoparticules Eu-ZnO synthétisées présentaient un mode d’action dépendant de la concentration. De plus, après 24 h de traitement, une prolifération et une migration cellulaires ont été observées dans les monocouches rayées et, tandis qu’un faible taux de migration cellulaire et de prolifération a été observé dans les cellules témoins (Figure 6). Le pourcentage de fermeture de la plaie était de 16 % pour le témoin, suivi de 51 % pour les groupes traités à 10 μg/mL et de 81,5 % pour les groupes traités à 20 μg/mL après 24 h (figure 7).

Figure 1 : Collection de morceaux d’écorce d’Eucommia ulmoides. Photo de l’écorce d’Eucommia ulmoides utilisée pour la préparation de l’extrait aqueux d’eau chaude. Avant l’extraction, les écorces doivent être soigneusement lavées pour éliminer les impuretés et complètement séchées à l’ombre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Préparation de l’extrait d’écorce d’Eucommia ulmoides : Photo des extraits d’écorce d’Eucommia ulmoides utilisés pour synthétiser les nanoparticules. L’extrait d’écorce d’Eucommia ulmoides de 200 mL a été préparé à partir de 20 g de morceaux d’écorce. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Synthèse de nanoparticules de ZnO médiées par l’écorce d’Eucommia ulmoides. L’image montre la formation de nanoparticules d’Eu-ZnO et la solution de couleur blanc laiteux représente la formation de nanoparticules d’Eu-ZnO. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse en microscopie électronique à transmission : L’image montre différents grossissements de nanoparticules de ZnO médiées par l’écorce d’Eucommia ulmoides (A) un grossissement de 100 nm et (B) un grossissement de 50 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Essai de viabilité cellulaire CCK-8. Les diagrammes à barres représentent la viabilité des cellules après avoir été traitées à différentes concentrations de 0 à 50 μg/mL, tandis que les cellules sans traitement servent de contrôle négatif. Les données représentent la moyenne et l’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Dosage des rayures pour l’évaluation de la fermeture de la plaie. Les cellules ont été traitées avec des NP EU-ZnO synthétisées (10 μg/mL et 20 μg/mL) et sans NP EU-ZnO (groupe témoin) et incubées pendant 24 h. Une prolifération et une migration cellulaires ont été observées dans les cellules traitées avec des NP EU-ZnO. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Pourcentage de fermeture de la plaie. Les graphiques à barres représentent le pourcentage de fermeture de la plaie sur la monocouche HUVEC avec et sans traitement EU-ZnO NP à 0 h et 24 h. Les données représentent la moyenne et l’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

On pense que l’écorce, les graines et les feuilles d’E. ulmoides présentent de nombreux avantages pour la santé. Nos résultats ont montré que la synthèse des nanoparticules EU-ZnO a été réalisée à l’aide d’une approche simple et rentable. L’extrait aqueux a été utilisé pour synthétiser les nanoparticules. Le chauffage de l’écorce à haute température peut entraîner la dégradation de certains phytoconstituants et réduire l’efficacité de l’extraction. Les phytoconstituants présents dans l’extrait aqueux de plantes peuvent réduire les ions métalliques pour former des nanoparticules. Le nitrate de zinc dihydraté est utilisé pour la préparation de nanoparticules de ZnO pour leurs propriétés biocompatibles et très stables⁹. L’utilisation d’éléments métalliques causant une toxicité minimale à élevée pour la synthèse ou la conception des nanomatériaux est risquée et ne peut pas être utilisée pour des allégations biomédicales. Cette synthèse peut être réalisée dans la journée (24 h). Cependant, les métaux non toxiques et les matériaux biocompatibles sont considérés comme sûrs et utilisés pour évaluer l’efficacité de la cicatrisation des plaies. La principale raison de l’agglomération des nanoparticules synthétisées est les liaisons phytochimiques. L’agglomération des nanoparticules était due à la nature attractive des interactions de Van der Waal et aux forces d’attraction entre les surfaces^10,11. L’agglomération des nanoparticules peut influencer les propriétés physiques et optiques. La taille et la forme des nanoparticules peuvent être modifiées à l’aide de la calcination et du recuit¹². La remise en suspension des nanomatériaux dans l’eau désionisée et la sonication peuvent aider à éviter l’agglomération des nanoparticules. La présence de composés bioactifs ou de groupes fonctionnels dans l’extrait aqueux est susceptible d’intervenir dans le processus de réduction. Le rendement en nanoparticules dépend uniquement du volume du mélange réactionnel utilisé pour le processus de synthèse. La synthèse de nanoparticules à grande échelle présente plusieurs limites, notamment l’agglomération et la taille non uniforme des particules.

À l’instar de nos résultats, Aydin Acar et ^al.13 ont rapporté que les nanoparticules de ZnO médiées par l’extrait de fleur de Calendula officinalis présentaient des propriétés cicatrisantes sur les cellules L929 avec une fermeture de la plaie de 69,1 %. De plus, les nanoparticules de ZnO médiées par les feuilles de Crotalaria verrucosa ont montré un potentiel de cicatrisation à une concentration de 5 μg/mL sur des lignées cellulaires HeLA avec une fermeture de la plaie de 40,45 %¹⁴. Zhang et ^coll.15ont signalé que les nanoparticules de ZnO synthétisées à l’aide d’Euphorbia fischeriana présentaient des propriétés cicatrisantes significatives à des concentrations de 10 et 15 μg/mL. Ces études ont prouvé que la nanoformulation synthétisée pourrait être utilisée comme agent cicatrisant. Les résultats de ces études ont montré que les composés synthétisés peuvent réparer la plaie et aider à la réépithélialisation dans les groupes de traitement.

L’hémostase et la migration cellulaire sont considérées comme des processus importants dans la cicatrisation des plaies. L’égratignure créée sur la monocouche des HUVECs a été réalisée à l’aide de pointes de pipette pour imiter les plaies artificielles. De plus, créer des plaies de la même largeur est assez délicat et compliqué. D’autre part, il s’agit d’une méthode moins coûteuse. Dans cet essai, il a été observé que les nanoparticules conçues présentaient d’excellentes propriétés de cicatrisation des plaies sur les HUVEC à des concentrations de 10 à 20 μg/mL par rapport au témoin. De plus, les Eu-ZnO-NPs synthétisés ont le pouvoir de réparer la plaie créée sur la monocouche cellulaire sans provoquer d’effets toxiques. Ces expériences in vitro pourraient être utilisées pour identifier l’efficacité des nanomatériaux synthétisés à base de polymères à l’aide de modèles animaux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque à 12 puits	NEST	703011	Utilisée pour la culture cellulaire et le dosage
Centrifugeuse	SCILOGEX	SC1406	Utilisée pour séparer les nanoparticules du mélange colloïdal
Tube à centrifuger &ndash ; 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	Pour centrifuger la solution synthétisée  ;
Tube à centrifuger &ndash ; 5 mL	Biosharp  ;	BS-50-CM-S	Pour stocker les nanoparticules
CO2 incubateur	Thermo scientific	3010	Pour cultiver les cellules HUVEC
Eau débruitée	Millipore	Sans objet  ;	Pour la préparation de l’extrait  ;
Milieu DMEM	Cytiva	SH30243.01	Utilisé pour les travaux de culture cellulaire
Entonnoir	Thermo scientifique	42600060	Pour maintenir le papier filtre pendant la filtration
Béchers en verre	Borosilicate  ;	1102-50	Utilisé pour la préparation de l’extrait aqueux
Four à air chaud	Genetimes	Sans objet  ;	Utilisé pour sécher les nanoparticules et les recueillir sous forme de poudre
Agitateur magnétique	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Utilisé pour la synthèse de nanoparticules
Microscope	Nikon Eclipse	Ts2	Utilisé pour la prise de microphotographies  ;
Boîte de Pétri	NEST	753001	Utilisée pour collecter les nanoparticules  ;
Pipette 1 mL	Lab Science  ;	YEA17AD0055580	Pour prendre/ajouter le volume spécifique de solution/extraire
Pointes de pipette 1 mL	SAINING  ;	3014200-T	Pour prendre/ajouter le volume spécifique de solution/extrait
PTFE Mélangeur magnétique Barres	d’agitation LAN RAN	Sans objet  ;	Utilisé pour le processus de synthèse de nanomatériaux
Hydroxyde de sodium	Sigma Alrich	71690	Utilisé pour ajuster le pH pendant la synthèse
Ciseaux en acier inoxydable	Deli	6034	Utilisé pour hacher les matériaux de l’écorce
Fiole de culture tissulaire T25	NEST	707001	Utilisé pour entretenir les cellules  ;
Balance de pesée  ;	Radwag  ;	AS220R2	Utilisé pour peser les produits chimiques  ;
Papier filtre Whatman n° 1	Newstar	GB/T1914-2017	Utilisé pour filtrer l’extrait pour la synthèse
Nitrate de zinc  ;	Sigma Alrich	13778-30-8	Utilisé comme précurseur de la nanoparticule. s