La médecine traditionnelle chinoise (MTC) représente un riche trésor d’options de traitement naturel et joue un rôle important pour répondre à divers besoins de santé dans le monde entier. Cette étude présente une étude expérimentale complète sur l’extraction, la séparation et les propriétés physicochimiques de la rutine, le composant actif clé de Flos sophorae immaturus.
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Article de méthode
Extraction et caractérisation de la rutine flavonoïde de la médecine traditionnelle chinoise Flos sophorae immaturus
Dans cet article
Résumé
Résumé
La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a longtemps servi de riche référentiel de solutions thérapeutiques naturelles, jouant un rôle central dans la réponse à divers besoins en matière de soins de santé dans le monde entier. Parmi les différentes herbes utilisées en MTC, Sophora flavescens est connue pour son large éventail de propriétés médicinales. Son application remonte à des siècles et continue d’être très appréciée dans la médecine moderne, notamment pour ses bienfaits thérapeutiques dans le traitement des maladies cardiovasculaires. La rutine, un composé flavonoïde bioactif, est largement distribuée dans le règne végétal, la plus forte concentration se trouvant chez Flos sophorae immaturus. Il a été rapporté que la rutine réduit la perméabilité et la fragilité anormales des capillaires et agit comme un agent protecteur pour les vaisseaux cardiovasculaires et cérébrovasculaires. Cette étude présente un protocole expérimental détaillé pour l’extraction, la séparation et la caractérisation des propriétés physicochimiques de la rutine dérivée de Flos sophorae immaturus. De plus, le protocole d’extraction des flavonoïdes de la MTC à l’aide de la méthode d’extraction alcaline et de précipitation acide est présenté et décrit.
Introduction
Flos sophorae immaturus (FSI), le bouton floral séché de Sophora japonica L., est une pierre angulaire de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) depuis des siècles. Ses principaux composants actifs comprennent la rutine, l’isoquercitrine, le Sophorae Flos et d’autres flavonoïdes et saponines. Ces constituants confèrent collectivement une variété d’effets pharmacologiques, tels que l’élimination de la chaleur et la détoxification, le refroidissement du sang et de l’hémostase, et l’abaissement de la pression artérielle. Dans la pratique clinique, le FSI est principalement apprécié pour sa capacité à protéger la perméabilité capillaire1, à maintenir la fonction du système cardiovasculaire2, à refroidir le sang, à arrêter les saignements et à réguler le feu du foie3. Ses propriétés thérapeutiques sont attribuées à une forte concentration de rutine (quercétine-3-rutinoside), un flavonoïde bioactif qui constitue jusqu’à 20 à 30 % de son poids sec4.
La rutine est un flavonoïde largement répandu dans les plantes. Son nom chimique est Que-3-O-rutine (C27H30O16) (Figure 1). À température ambiante, la rutine se présente sous la forme d’une poudre cristalline jaune clair à jaune-vert. Son point de fusion varie en fonction de la forme et de la pureté du cristal, se situant généralement entre 125 °C et 195 °C. La rutine présente des caractéristiques polaires prononcées : elle est légèrement soluble dans l’eau froide, très soluble dans les solvants organiques polaires tels que l’éthanol et le méthanol, et presque insoluble dans les solvants non polaires comme l’éther et le chloroforme. De plus, sa solubilité est sensible au pH et augmente considérablement dans des conditions alcalines en raison de la dissociation des groupes hydroxyles phénoliques formant des sels de sodium ou de potassium. Ces propriétés physiques sont étroitement associées aux groupes polyhydroxyle et glycoside de sa structure moléculaire5, influençant directement son processus d’extraction et ses applications en médecine, dans l’alimentation et dans d’autres industries6. La rutine, bien qu’omniprésente dans les plantes, est plus abondante dans le FSI et présente de multiples activités pharmacologiques, notamment la stabilisation capillaire7, l’anti-inflammatoire, l’antioxydant8, l’antimicrobien9 et les effets régulateurs métaboliques10.
Malgré son potentiel clinique11, la faible solubilité aqueuse et la stabilité de la rutine posent des défis pour l’extraction et la formulation5. Pour remédier à ces limitations, la méthode d’extraction alcaline-précipitation acide (AEAP) est apparue comme une alternative efficace, tirant parti du comportement dépendant du pH de ses groupes hydroxyles phénoliques.
Sur la base des propriétés physiques de la rutine, la méthode AEAP est devenue une technique standardisée pour isoler la rutine du FSI, en utilisant sa solubilité dans les solutions alcalines et la cristallisation ultérieure dans des conditions acides12. L’AEAP exploite l’ionisation commutable au pH des groupes hydroxyles phénoliques pour améliorer le rendement et obtenir une extraction à la rutine de haute pureté à partir de FSI. Dans des conditions alcalines (pH >10), les groupes phénoliques -OH se déprotonent pour former des ions -O- hydrophiles, permettant une solubilisation complète à partir des tissus végétaux tout en minimisant la dégradation oxydative. L’acidification à pH 2-3 inverse cette ionisation, précipitant les composés phénoliques cibles avec une co-précipitation minimale des impuretés polaires. En tant que polyphénol dont la solubilité dépend du pH, la rutine se dissout facilement dans les solutions alcalines (par exemple, l’hydroxyde de sodium) mais précipite dans des conditions acides en raison de la protonation du groupe hydroxyle. L’AEAP offre une alternative rentable, évolutive et respectueuse de l’environnement, qui s’aligne sur les principes de la chimie verte en évitant les solvants toxiques13. Il reflète une tendance plus large dans la chimie des produits naturels qui favorise les techniques de séparation basées sur le pH14. Des méthodes comparables sont employées pour isoler la curcumine (du curcuma) et la berbérine (de Coptis chinensis), en exploitant les changements de solubilité à des valeurs de pH spécifiques pour l’extraction sélective. La méthode AEAP est idéale pour la production de rutine à haut rendement à partir de sources riches en flavonoïdes comme le FSI, ne nécessitant que du matériel de laboratoire de base (p. ex., pH-mètres, centrifugeuses). Pour les matrices végétales à faible teneur en rutine ou les composés interférents complexes, un prétraitement par hydrolyse enzymatique pourrait être envisagé à l’avenir pour améliorer l’efficacité de l’extraction.
En conclusion, l’AEAP représente une approche pratique pour l’extraction de la rutine, équilibrant l’efficacité, l’innocuité et l’évolutivité. Son rôle dans la modernisation de la MTC met en évidence son potentiel à faire le lien entre les pratiques traditionnelles et les normes pharmaceutiques contemporaines.
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Protocole
La rutine est un flavonoïde contenant plusieurs groupes hydroxyles phénoliques et est soluble dans les solutions alcalines chaudes, suivies d’une acidification et d’une précipitation. Il peut être extrait en utilisant le procédé d’extraction alcaline-précipitation acide. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Préparation expérimentale
- Procurez-vous les matériaux suivants : Flos sophorae immaturus (20 g), borax (0,8 g), plusieurs béchers, poudre de chaux (1,5 g), acide chlorhydrique concentré, thermomètre et bandelettes de test de pH. Voir la figure 2 pour une version plus grande de cette image.
2. Extraction de la rutine
REMARQUE : Utilisez un rapport borax/eau de 0,8 g de borax pour 200 ml d’eau. Utilisez un rapport de lait de chaux de 1,5 g de poudre de chaux pour 10 ml d’eau. Ajustez le pH rapidement et avec précision. Reconstituez l’eau perdue au besoin.
- Extraction alcaline
REMARQUE : Filtrez à l’aide d’un papier filtre rond de 6 cm.- Ajouter 250 ml d’eau et 0,8 g de borax dans un bécher de 500 ml. Porter à ébullition, puis ajouter 20 g de Flos sophorae immaturus. Poursuivre l’ébullition pendant 2-3 min.
- Après ébullition, ajustez le pH à 8-9 avec du lait de chaux en remuant. Poursuivez le chauffage pendant 20 min. Filtrer à travers de la gaze à chaud pour obtenir un filtrat jaune-brun.
- Extraction par précipitation acide
- Ajustez l’extrait à pH 2-3 à l’aide d’acide chlorhydrique concentré et laissez-le se déposer. Le passage d’une solution claire jaune-brun à une solution trouble, ainsi que la formation progressive d’un précipité floculant jaune orangé au fond du récipient, indiquent une séparation efficace de la rutine.
- Après 6 h d’instation, soumettre le précipité à une filtration par aspiration à pression atmosphérique. Recueillir et sécher pour obtenir de la rutine brute.
REMARQUE : Coupez le film filtrant en fonction de la taille de l’entonnoir Brinell utilisée (150 mm de diamètre). - Lavez le précipité avec de l’eau jusqu’à ce qu’il soit neutre lors de la filtration par aspiration à pression atmosphérique.
3. Raffinage de la rutine
- Après une pesée grossière, recristalliser la rutine à l’aide d’eau chaude à un rapport de solubilité de 1:200. Faire bouillir la solution aqueuse pendant 30 min et filtrer à chaud. Assurez-vous que le volume final de la solution de rutine est de 210 ml.
- Filtrez les résidus. Laisser reposer le filtrat sans être dérangé, puis filtrer à nouveau et sécher sous vide dans un four à 60-70 °C pour obtenir de la rutine raffinée (Figure 3).
REMARQUE : Coupez le film filtrant en fonction de la taille de l’entonnoir Brinell utilisée (150 mm de diamètre).
4. Identification physico-chimique de la rutine
- Réaction chlorhydrate-sel de magnésium - identification des noyaux parents des flavonoïdes
- Dissoudre 1 à 2 ml de l’échantillon dans du méthanol et ajouter 50 mg de poudre de magnésium.
- Ajoutez quelques gouttes d’acide chlorhydrique concentré. Agitez doucement. La solution doit devenir rouge (Figure 4).
- Réaction de Molisch - identification des composés du sucre
- Ajouter une solution d’éthanol à 10 % de α-naphtol et agiter. Inclinez le tube à essai et ajoutez délicatement de l’acide sulfurique concentré goutte à goutte le long de la paroi intérieure.
- Observez la formation d’un anneau brun à l’interface (Figure 5).
- Réaction de verdissement zircone-acide citrique
- Ajouter 1 à 2 mL de solution de α-naphtol à 10 % à la solution d’éthanol de l’échantillon. Bien agiter. Ajouter lentement 10 gouttes de concentréH2SO4 le long de la paroi du tube sans secouer.
- Ajouter une solution de méthanol d’acide citrique à 2 %. La couleur de la solution doit s’éclaircir (Figure 6).
- Discrimination des couches minces
- Utilisez à la fois la rutine raffinée et la rutine standard.
- Utilisez du chloroforme :méthanol :acide formique (15:5:1) comme agent de développement, et une solution d’éthanol à 1 % d’AlCl3 comme agent chromogène. Observez la fluorescence sous une lampe UV à 365 nm.
5. Examen de la rutine par CCM
REMARQUE : Une méthode de chromatographie sur couche mince (CCM) a été utilisée pour évaluer la pureté de la rutine. Une plaque de gel de silice a été utilisée comme phase stationnaire.
- Repérez l’échantillon de rutine raffiné et l’étalon de rutine (1 mg/mL dans du méthanol) sur la plaque. Développer la plaque dans une phase mobile composée d’acétate d’éthyle :acide formique :eau (8:1:1, v/v/v).
- Après séchage, visualisez la plaque sous lumière UV à 254 nm.
- Calculez le facteur de rétention (Rf) du point d’échantillonnage et comparez-le à la norme.
REMARQUE : Un seul point avec une valeur Rf identique (environ 0,35-0,50 dans ces conditions) indique une grande pureté, tandis que des points supplémentaires suggèrent la présence d’impuretés.
6. Détermination de la pureté de la rutine par HPLC
REMARQUE : La pureté de la rutine a été analysée quantitativement par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Les conditions d’analyse étaient les suivantes : Colonne chromatographique (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) ; phase mobile-acétonitrile (A) et solution aqueuse d’acide acétique à 0,2 % (B). Programme d’élution à gradient linéaire : 0-15 min, 20 %-30 % A ; 15-30 min, 30 %-60 % A. Débit-1 mL/min. Volume d’injection-10 μL. Longueur d’onde de détection-355 nm. Température de la colonne-40 °C.
- Pesez avec précision 0,1 g de poudre d’échantillon de rutine et transférez-la dans un tube à centrifuger de 10 ml. Ajouter 5,0 ml de solution d’éthanol à 60 % et bien agiter.
- Réglez le bain-marie ou le four à colonne à température constante à 30 °C et ultrasonisez l’échantillon pendant 30 min.
- Centrifuger l’échantillon à 55 900 × g pendant 10 min à température ambiante. Utilisez le surnageant comme solution de test pour l’analyse HPLC.
7. Dosage de la rutine par LC-MS
REMARQUE : Les composés isolés ont été identifiés par chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse (LC-MS). Les conditions LC correspondaient à la méthode HPLC. La spectrométrie de masse a été réalisée à l’aide de l’ionisation par électronébulisation (ESI) en mode ions négatifs avec une tension capillaire de 3,5 kV. Température de désolvatation-350 °C ; Plage de balayage de masse-m/z 100-1000.
- Pesez 10 mg d’échantillon de rutine purifiée et transférez-le dans un tube de microcentrifugation de 2 ml. Ajouter 0,6 mL de DMSO deutéré à l’aide d’une pipette jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement dissous. Préparez des solutions étalons de rutine en utilisant la même procédure.
- Analyser les échantillons et les étalons traités à l’aide de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 1H).
- Traitez les données spectrales à l’aide d’un logiciel compatible15.
- Comparez les données spectrales avec la littérature ou les références de bases de données telles que NIST ou PubChem pour vérification.
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Résultats
Dans l’expérience d’identification physico-chimique de la rutine, la solution est devenue rouge après l’ajout de poudre de magnésium et d’une petite quantité d’acide chlorhydrique concentré, suivi d’une agitation, indiquant la présence d’un noyau parent flavonoïde. Dans la réaction de Molisch, un anneau violet s’est formé à l’interface, indiquant un résultat positif et la présence de fractions sucrées dans la structure moléculaire. La solution de l’échantillon est devenue jaune vif lors de l’ajout d’un réactif de chloro-...
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Discussion
L’extraction de la rutine est principalement basée sur la méthode6 de l’extraction alcaline par précipitation acide (AEAP), qui offre les avantages d’une configuration d’équipement simple, d’une facilité d’utilisation, d’un rendement élevé et d’un faible coût. Cette technique est souvent complétée par l’extraction assistée par micro-ondes (MAE)7 et l’extraction assistée par ultrasons (UAE)8, qui réduisent la consomma...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs de cet article déclarent par la présente qu’ils ont divulgué tous les conflits d’intérêts qui auraient pu survenir au cours de la réalisation de cette recherche et de la rédaction de cet article. Nous confirmons que nous n’avons aucune relation financière, personnelle ou professionnelle qui pourrait potentiellement biaiser notre interprétation des résultats ou des conclusions présentés dans ce travail. Plus précisément, nous n’avons aucun lien avec des sociétés pharmaceutiques, des institutions de recherche ou d’autres entités qui pourraient bénéficier des résultats rapportés ici. Enfin, nous affirmons que nos constatations et conclusions sont fondées uniquement sur les données et l’analyse présentées dans le présent document et qu’elles ne sont influencées par aucun facteur externe. Nous restons déterminés à respecter les normes les plus élevées d’intégrité académique et de conduite éthique dans toutes nos activités de recherche.
Remerciements
Nous tenons à exprimer notre profonde gratitude au Laboratoire de chimie pharmaceutique de l’Université de médecine chinoise de Pékin pour avoir fourni la plate-forme expérimentale. Leur soutien et leurs ressources ont été inestimables dans la conduite de nos recherches et de nos expériences. Nous apprécions profondément leur dévouement à l’excellence scientifique et leur engagement à favoriser le développement des jeunes chercheurs.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1-Naphthol | MACKLIN | C16245764 | |
| Acide acétique | MACKLIN | C12662811 | |
| Acétonitrile | MACKLIN | C16129374 | |
| Chlorure d’aluminium | MACKLIN | C16485922 | |
| Acide citrique | MACKLIN | C16429480 | |
| DMSO | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20230306 | |
| Éthanol | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20250102 | |
| Acétate d’éthyle | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20240318 | |
| Flos sophorae immaturus | Beijing Tongrentang | 10092026329782 | |
| Acide méthanoïque | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20150402 | |
| &zwnj ; MestReNova | Recherche Mestrelab | / | |
| Méthanol & nbsp ; | Innochem | C16365684 | |
| Gel de silice 60F254 | STEEMA | 20210222 | |
| Xcalibur | Thermo Fisher Scientific | / | |
| Octahydrate de chlorure de zirconyle | MACKLIN | C15350627 |
Références
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Réimpressions et autorisations
