Visualisation 3D des péricytes vasculaires rétiniens chez la souris par immunomarquage

Résumé

Les péricytes dans le système vasculaire rétinien ont été examinés par coloration immunofluorescente avec le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes β après injection rétro-orbitaire de lectine fluorescente de tomate. La rétine marquée a ensuite été traitée avec la méthode de nettoyage des tissus et montée entière pour visualiser les vues tridimensionnelles des péricytes entourant le système vasculaire rétinien au microscope confocal.

Résumé

Les péricytes rétiniens sont essentiels au développement vasculaire et à la stabilité de la rétine, jouant un rôle clé dans le maintien de l’intégrité du système vasculaire rétinien. Afin de fournir une vue détaillée des caractéristiques morphologiques des péricytes, cette étude a décrit une nouvelle approche combinant l’injection rétro-orbitaire d’un agent fluorescent, la coloration immunofluorescente et le traitement de nettoyage des tissus. Tout d’abord, la lectine fluorescente de la tomate a été injectée dans le sinus rétro-orbitaire de la souris vivante pour marquer le système vasculaire rétinien. Après 5 minutes, la souris a été sacrifiée et sa rétine intacte a été soigneusement retirée de la coupe rétinienne et colorée par immunofluorescence avec le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes β pour révéler les péricytes. De plus, la rétine colorée a été traitée avec un réactif de nettoyage des tissus et montée entière sur la lame de microscope. Grâce à ces approches, le système vasculaire rétinien et les péricytes ont été clairement observés dans la rétine transparente. Sous un microscope confocal, nous avons obtenu plus d’opportunités de prendre des images à haute résolution pour reconstruire et analyser davantage les caractéristiques morphologiques des péricytes le long de l’arbre vasculaire rétinien dans une vue tridimensionnelle. D’un point de vue méthodologique, ce protocole offre une approche efficace pour visualiser les péricytes dans le système vasculaire rétinien, fournissant des informations précieuses sur leur rôle dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Introduction

Les péricytes rétiniens sont intégrés dans la membrane basale le long de la face abluminale des cellules endothéliales vasculaires, affichant un motif en forme de maille de processus à courte portée enroulés autour des vaisseaux sanguins rétiniens¹. Ce contact intime entre les péricytes et le système vasculaire rétinien contribue au maintien de l’homéostasie environnementale de la rétine². Bien que de nombreuses études aient fourni des preuves morphologiques de la présence de péricytes dans le système vasculaire rétinien, la plupart de notre compréhension des caractéristiques morphologiques des péricytes rétiniens provient de techniques histologiques conventionnelles³.

Dans la lignée de ces études, nous avons conçu cette étude pour mettre en évidence efficacement plus de détails morphologiques des péricytes dans la microvascularisation rétinienne en combinant des techniques histologiques traditionnelles avec des méthodes scientifiques modernes de pointe. L’approche intègre ici trois techniques clés : l’injection rétro-orbitaire de lectine fluorescente de tomate chez des souris vivantes, la coloration immunofluorescente avec le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes β (PDGFR-β) et la stratégie de nettoyage tissulaire à base de solvant. L’injection rétro-orbitaire de lectine fluorescente de la tomate s’est avérée efficace et fiable pour l’observation du système vasculaire rétinien de souris in vivo et in vitro ^4,5. Le PDGFR-β sert de biomarqueur couramment utilisé pour la coloration immunofluorescente des péricytes⁶. Pour capturer des images haute résolution des péricytes dans les rétines plus épaisses et entières, la stratégie de nettoyage des tissus améliore la transparence histologique ^2,7,8.

Bien que chacune de ces techniques ait été appliquée individuellement dans des études rétiniennes, leur compatibilité combinée pour l’étude des péricytes dans le système vasculaire rétinien de souris reste incertaine. Étant donné que l’épaisseur moyenne de la rétine de la souris est d’environ 180-220 μm⁹, le marquage des anticorps et l’imagerie confocale sur ce tissu épais sans traitement d’effacement entraînent souvent des signaux de fond élevés, ce qui complique l’observation de la relation spatiale entre les péricytes et les vaisseaux sanguins¹⁰. Grâce aux approches décrites ici, nous visons à fournir une méthode simple pour visualiser les péricytes dans le système vasculaire rétinien dans une vue tridimensionnelle (3D) sous un microscope confocal. Cette information cellulaire améliorée des péricytes dans le système vasculaire rétinien pourrait améliorer notre compréhension de l’homéostasie environnementale rétinienne et souligner les stratégies potentielles de protection vasculaire, améliorant ainsi les résultats fonctionnels dans les troubles vasculaires rétiniens.

Protocole

Pour cette étude, trois jeunes souris mâles C57BL/6 (âgées de 8 à 10 semaines, pesant de 20 à 25 g) ont été utilisées. Ils ont été logés dans un cycle lumière/obscurité de 12 heures avec une température et une humidité contrôlées et ont eu libre accès à la nourriture et à l’eau. Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Institut d’acupuncture et de moxibustion de l’Académie chinoise des sciences médicales chinoises (approbation n° 2023-03-14-04) et menée conformément au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (National Academy Press, Washington, D.C., 1996).

1. Injection rétro-orbitale in vivo de lectine fluorescente de tomate

1. Injecter 50 mg/kg de pentobarbital par voie intrapéritonéale pour anesthésier la souris. Évaluez la profondeur de l’anesthésie en évaluant l’absence de réponse à un stimulus de pincement de l’orteil.
2. Placez la souris dans le décubitus latéral droit, la tête tournée vers la gauche.
3. Appuyez doucement deux doigts sur la zone péri-orbitaire pour exposer l’œil gauche de la souris afin de permettre l’administration la plus facile de l’injection dans le sinus rétro-orbitaire gauche de l’animal¹¹.
4. À l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 27 G, percez doucement le sinus veineux orbitaire d’environ 2 à 3 mm avec le biseau de l’aiguille vers l’avant à un angle de 45°.
5. Injectez 0,1 mL (1 mg/mL) de lectine de tomate fluorescente dans le sinus veineux orbitaire de la souris.

2. Perfusion et énucléation des yeux

1. A 5 min après l’injection rétro-orbitaire, injecter une solution de tribromoéthanol (250 mg/kg) par voie intrapéritonéale pour anesthésier profondément la souris. Par la suite, euthanasier l’animal par exsanguination et perfusion cardiaque. Une fois que la respiration s’arrête, ouvrez la cavité thoracique avec des ciseaux chirurgicaux¹².
2. Une fois que la respiration s’arrête, ouvrez la cavité thoracique avec des ciseaux chirurgicaux. Stérilisez les instruments chirurgicaux à l’avance et faites-les fonctionner dans une hotte. À l’aide d’une aiguille 24G, insérez-la à 2 mm dans le ventricule cardiaque gauche par l’apex ventriculaire gauche. Effectuer la perfusion à un débit de 3 mL/min avec 20 mL de solution saline physiologique à 0,9 % suivie de 20 mL de formaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate à 0,1 M (PB, pH 7,4).
3. Placez la souris sacrifiée sur le côté et retirez la peau qui recouvre les yeux avec des ciseaux. Énucléez les yeux avec des ciseaux et des pinces.
4. Coupez le nerf optique et les tissus environnants, puis soulevez l’œil et transférez-le sur une plaque à 12 puits pour une post-fixation dans du formaldéhyde à 4 % dans 0,1 M PB pendant 2 h.
5. Cryoprotéger le tissu en 25 % de saccharose dans 0,1 M PB (pH 7,4) à 4 °C jusqu’à ce qu’il coule au fond de la solution.
   REMARQUE : Étant donné que le tissu oculaire se déshydrate bien dans une solution de saccharose, la rétine peut être plus facilement et complètement détachée, facilitant ainsi des études complètes ultérieures.

3. Dissection des rétines

1. Transvasez les yeux dans une boîte de Pétri contenant 0,1 M PB (pH 7,4) à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique.
2. Percez le bord de la cornée avec des ciseaux bien aiguisés, coupez autour de la cornée et de l’iris et jetez-les.
3. Utilisez des pinces pour retirer le cristallin et l’humeur vitrée. Ensuite, éloignez la rétine en forme de coupe du centre de l’œil à l’aide d’une pince fine. Rincez la rétine avec 0,1 M PB (pH 7,4) dans une boîte de Pétri propre.

4. Coloration immunofluorescente et nettoyage des tissus de la rétine

1. Retirez délicatement la rétine en forme de coupe et incubez-la dans une solution Triton X-100 à 2 % dans 0,1 M PB (pH 7,4) pendant une nuit à 4 °C.
2. Transférez la rétine dans la solution bloquante (0,1 M PB + 1 % de Triton-X 100 + 0,2 % d’azoture de sodium + 10 % de sérum d’ânesse normal) et tournez à 72 tr/min sur l’agitateur pendant la nuit à 4 °C.
3. Transvaser la rétine dans la solution contenant les anticorps primaires de l’anti-PDGFR-β de chèvre (10 μg/mL) dans un tampon de dilution (0,1 M PB + 0,2 % de Triton-X 100 + 0,2 % d’azoture de sodium + 1 % de sérum d’ânesse normal) dans un tube de microcentrifugation et tourner sur l’agitateur pendant 2 jours à 4 °C.
4. Lavez les retina 2x avec un tampon de lavage (0,1 M PB + 0,2 % Triton-X 100) à température ambiante, puis conservez-les dans le tampon de lavage pendant une nuit à 4 °C sur le shaker.
5. Le lendemain, transvaser la rétine dans la solution mixte contenant l’anticorps secondaire de 1 mg/mL de l’âne anti-chèvre 488 et 0,2 ng/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) nucléaire fluorescent (DAPI) dans un tube de microcentrifugation et tourner à 72 tr/min sur l’agitateur pendant 5 h à 4 °C.
6. Lavez la rétine dans une plaque à 6 puits avec un tampon de lavage pendant 1 h, 2x, à température ambiante. Conservez la rétine dans le tampon de lavage sur l’agitateur pendant une nuit à 4 °C. Effectuez l’imagerie et l’analyse conformément à l’étape 5 pour obtenir les vues avant l’éclaircissement des tissus.
7. Transférez la rétine dans le réactif de nettoyage des tissus et faites-la tourner doucement à 60 tr/min sur l’agitateur pendant 1 h à 37 °C.
8. Après le traitement de nettoyage des tissus, rincez la rétine en forme de coupe avec 0,1 M PB (pH 7,4) dans une boîte de Pétri propre.
9. Faites 4 incisions radiales atteignant environ 2/3 du rayon de la rétine à l’aide de ciseaux à ressort pour créer une forme de pétale.
10. Aplatissez et montez la rétine sur une lame de microscope, puis retirez tout excès de PB avec un petit morceau de papier absorbant. Gardez l’intérieur de la rétine vers le haut sur la lame.
11. Encerclez la rétine montée à l’aide d’une entretoise et remplissez l’espace avec un réactif frais de nettoyage des tissus et une lamelle.

5. Imagerie et analyses

1. Obtenez les vues extérieures de la rétine avant (après avoir terminé l’étape 4.6) et après le traitement de nettoyage des tissus.
2. Numérisez les vues de montage de la rétine étiquetée avec le scanner panoramique de coupes de tissus. Utilisez un objectif 2x avec une ouverture numérique de 0,08.
3. Prenez des images à fort grossissement grâce à un système d’imagerie confocal équipé des objectifs suivants : objectif 10x avec NA de 0,40 et objectif 40x avec NA de 0,95. Réglez le sténopé confocal à 152 μm (objectif 10x) et 105 μm (objectif 40x). Réglez la résolution spatiale de la capture d’image à 1024 x 1024 pixels (objectif 10x) et 640 x 640 pixels (objectif 40x).
4. Capturez 50 images (Z-stack) dans des images de 2 μm à partir de la rétine étiquetée. Intégrez toutes les images en une seule mise au point en mode projection/topographie. Pour la configuration, cliquez sur Définir le plan focal de début > Définir le plan focal de fin > Définir la taille du pas > Choisir le motif de profondeur > la capture d’image > la série Z.
5. Capturez des images en utilisant les longueurs d’onde d’excitation et d’émission suivantes pour différents signaux de fluorescence : Signaux de fluorescence verts à 499 nm et 519 nm ; signaux de fluorescence rouge à 591 nm et 618 nm ; et des signaux de fluorescence bleus à 401 nm et 421 nm.
6. Reconstruisez les images dans le motif tridimensionnel en important des images confocales de la pile Z dans un logiciel d’analyse en sélectionnant Ajouter de nouvelles surfaces > Choisissez les paramètres de volume > Choisissez le canal source > Ajustez l’affichage > Ajustez l’angle de surface > l’instantané.

Résultats

Du point de vue extérieur de la rétine entière, la transparence tissulaire de la rétine intégrale a été augmentée en utilisant le traitement de clarification tissulaire par rapport à celle de la rétine sans nettoyage tissulaire (Figure 1).

Pour l’examen histologique de la rétine entière, le système vasculaire rétinien a été marqué en rouge avec de la lectine de tomate fluorescente par injection rétro-orbitaire, et les péricytes rétiniens sont représentés en vert avec PDGFR-β (Figure 2, Figure 3 et Figure 4). Bien que ce marquage ait pu être observé sur l’échantillon avant et après le nettoyage des tissus, à titre de comparaison, le bruit de fond de l’échantillon rétinien a été réduit par le traitement de nettoyage des tissus (Figure 2). Le traitement a également rendu les péricytes rétiniens et le système vasculaire marqués plus clairs sous le scanner panoramique de coupes de tissus (Figure 2) et le microscope confocal à balayage laser (Figure 3).

La distribution graduelle des péricytes rétiniens est également mise en évidence ici le long de l’arbre vasculaire rétinien (Figure 3). De la partie centrale de la rétine à sa région périphérique, les péricytes sont situés sur la membrane basale du système vasculaire rétinien, y compris le tronc vasculaire et les branches et les capillaires (Figure 3).

Sur la base de l’observation ci-dessus, la corrélation spatiale des péricytes et de la vascularisation rétinienne a été évaluée davantage à l’aide des images de la pile Z plus amplifiées de l’échantillon rétinien dégagé (Figure 4). À l’aide du système de traitement d’image, nous avons fourni les vues 3D pour démontrer que les péricytes étaient étroitement enroulés autour du système vasculaire rétinien de différents diamètres (Figure 4). La figure 4A0-D0 représente la ramification hiérarchique des vaisseaux rétiniens du plus haut au plus bas. Comme les péricytes sont plus abondamment répartis dans les capillaires, la coloration PDGFRβ de la figure 4D0 montre une intensité et un signal plus forts par rapport à la figure 4A0-C0.

Contrairement à la rétine de souris sans traitement de nettoyage des tissus (Figure 1A, Figure 2A, Figure 3A0-D0), la présente approche a efficacement réduit les signaux de fond rétiniens pour démontrer la relation spatiale entre les péricytes et les vaisseaux sanguins de la rétine entière (Figure 1B, Figure 2B, Figure 3A1-D1).

Figure 1 : Comparaison de la transparence optique de l’ensemble de la monture de la rétine sans et avec le traitement de nettoyage des tissus. (A, B) Les vues extérieures de l’ensemble de la monture de la rétine avant (A) et après (B) le traitement de nettoyage des tissus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Comparaison des caractéristiques de marquage des péricytes rétiniens et de la vascularisation de l’ensemble de la rétine montable sans et avec traitement de nettoyage tissulaire. (A, B) Des vues représentatives du montage de l’ensemble de la rétine monture avant (A) et après (B) le traitement de nettoyage tissulaire ont été prises dans le cadre du système de lames virtuelles. Le système vasculaire est en rouge (lectine fluorescente de la tomate), les péricytes sont en vert (PDGFR-β) et le noyau cellulaire est en bleu (DAPI). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Comparaison de la résolution d’imagerie des péricytes rétiniens de manière graduelle le long de l’arbre vasculaire rétinien avant et après le traitement de nettoyage des tissus. (A-D) Les images représentatives de la rétine marquée avant le traitement de nettoyage des tissus (A0-D0) et après le traitement de nettoyage des tissus (A1-D1) montrent la distribution des péricytes entourant le système vasculaire rétinien dans l’ordre du tronc vasculaire (A0, A1), les branches du premier ordre (B0, B1), les branches du second ordre (C0, C1) et le capillaire (D0, D1). Le système vasculaire est en rouge (lectine fluorescente de la tomate), les péricytes sont en vert (PDGFR-β) et le noyau cellulaire est en bleu (DAPI). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Corrélation spatiale des péricytes avec le système vasculaire rétinien de différents diamètres. (A-D) Images représentatives à haute résolution de la rétine marquée le long de l’arbre vasculaire rétinien montrant la distribution des péricytes entourant le système vasculaire rétinien dans différents diamètres, y compris le tronc vasculaire (A0, A1), les branches du premier ordre (B0, B1), les branches du deuxième ordre (C0, C1) et le capillaire (D0, D1). A1-D1 : Les images correspondantes des panneaux A0-D0 ont été reconstruites pour montrer la corrélation spatiale des péricytes avec le système vasculaire rétinien de différents diamètres dans les vues tridimensionnelles et démontrer davantage les vues agrandies des régions locales dans les panneaux A1-D1 (flèches) avec des inserts. Le système vasculaire est en rouge (lectine fluorescente de la tomate), les péricytes sont en vert (PDGFR-β) et le noyau cellulaire est en bleu (DAPI). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans cette étude, nous avons détaillé le processus technique de démonstration de la morphologie des péricytes dans le système vasculaire rétinien à l’aide de l’injection rétro-orbitale de lectine fluorescente de tomate, de l’examen immunofluorescent avec PDGFR-β et de l’éclaircissement des tissus à base de solvant. Les résultats montrent que ces techniques sont hautement compatibles pour mettre en évidence les péricytes dans la rétine entière. La combinaison de ces méthodologies offre une approche efficace pour visualiser les caractéristiques morphologiques des péricytes dans le système vasculaire rétinien d’un point de vue 3D détaillé.

L’une des techniques clés, l’injection rétro-orbitaire chez la souris, s’est avérée être une méthode simple et optimale pour administrer des agents de marquage vasculaire, surpassant les méthodes d’injection intrapéritonéale de la veine de la queue pour observer le système vasculaire rétinien de la souris^13,14. Bien que le principe et le mécanisme du marquage vasculaire par injection rétro-orbitaire ne soient pas entièrement compris, il est évident que cette méthode marque solidement le système vasculaire rétinien avec de la lectine de tomate fluorescente. Le marquage fluorescent reste stable à la fois grâce au traitement histochimique et à l’élimination des tissus. Par conséquent, au-delà de son utilisation en imagerie in vivo, l’injection rétro-orbitaire de lectine fluorescente de tomate marque efficacement la lumière des vaisseaux sanguins, offrant une vue claire du système vasculaire rétinien pour un examen histologique in vitro et ex vivo.

Pour marquer les péricytes rétiniens, nous avons utilisé une coloration immunofluorescente avec PDGFR-β¹⁵. Étant donné que la rétine colorée a subi un traitement supplémentaire avec un réactif de clarification tissulaire pour réduire la diffusion de la lumière tissulaire lors d’un examen morphologique microscopique, la rétine a été incubée dans la solution de coloration pendant une période plus longue pour améliorer la pénétration de l’anticorps^16,17.

L’ensemble de la rétine est relativement transparent, ce qui permet d’avoir une vue d’ensemble du système vasculaire rétinien¹⁸. Cependant, en raison de la diffusion de la lumière avec son épaisseur, il limite la pénétration de la lumière et l’imagerie haute résolution¹⁹. À l’aide de techniques de nettoyage des tissus, il est devenu possible de visualiser les péricytes de la rétine dans son ensemble d’un point de vue à haute résolution^19,20. Cependant, ces méthodes n’ont pas encore été largement appliquées à l’étude des péricytes rétiniens de souris. Dans cette étude, l’approche de clarification tissulaire à base de solvant a considérablement amélioré notre capacité à visualiser les péricytes dans le système vasculaire rétinien, ce qui nous a permis d’obtenir des images à haute résolution de la pile Z à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser.

Les péricytes, répartis le long de l’arbre microvasculaire, jouent un rôle essentiel dans la distribution spatiale et temporelle complexe du sang au sein du réseau capillaire rétinien²². Leur morphologie hautement plastique et leurs capacités contractiles adaptatives rendent les péricytes idéaux pour réguler le flux sanguin capillaire en réponse à l’activité neuronale locale dans des conditions physiologiques et pathologiques²³. En tant qu’acteur clé de la barrière hémato-rétinienne ou du couplage neurovasculaire rétinien, les péricytes rétiniens sont également attirés par le maintien de la néovascularisation, de l’angiogenèse et de la transmigration leucocytaire²⁴.

À titre de limitation technique, il convient de garder à l’esprit qu’en plus du PDGFR-β, d’autres marqueurs tels que NG-2 et CD13 ont également été utilisés pour identifier les péricytes 22,24,25. Par conséquent, la sélection d’un marqueur spécifique au péricyte approprié pour démontrer les péricytes sans ambiguïté reste un défi. Cette étude fournit des preuves supplémentaires que le PDGFR-β est un meilleur candidat pour révéler les caractéristiques morphologiques des péricytes.

En résumé, nous avons démontré que la combinaison de l’injection rétro-orbitale de lectine fluorescente de la tomate, de la coloration immunofluorescente et de l’éclaircissement tissulaire a permis l’acquisition d’images à haute résolution, révélant la morphologie détaillée des péricytes dans le système vasculaire rétinien de souris dans des conditions physiologiques. Ces résultats suggèrent que cette méthode pourrait être précieuse pour les recherches futures sur les altérations des péricytes rétiniens dans des conditions pathologiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571	Protéger de la lumière
Alexa Fluor 488 âne anti-chèvre IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A-11055	Protéger de la lumière
C57BL/6	souris Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK (Jing) 2021-0006
Système d’imagerie confocale	Olympus	FV1200
Chèvre anti-PDGFR-&beta ;	Recherche et Développement	AF1042	25 & micro ; g  ;
Logiciel Imaris	Oxford Instruments	v.9.0.1
Lycopersicon esculentum (Tomate) lectine, DyLight594	Thermo Fisher Scientific	L32471	1 mg
Tube de microcentrifugation	Axygen	MCT-150-C	1,5 mL
Sérum d’âne normal	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	10 mL
Scanner panoramique de tranches de tissus	Olympus	VS120-S6-W
Photoshop et  ; Illustration	Adobe	CS6
RapiClear 1.52 Solution	SunJin Lab	RC152001	10 mL
Plaque à six puits	Costar	3335
Ciseaux à ressort  ;	Fine Science Tools	15003-08
Superfrost Plus	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	25 mm x 75 mm x 1 mm