Isolement enzymatique des vésicules extracellulaires interstitielles du muscle squelettique

Résumé

Ce protocole vise à isoler et à purifier les vésicules extracellulaires interstitielles des muscles squelettiques (SkM-EV) des tissus musculaires des rongeurs par détachement mécanique, dissociation enzymatique, filtration et ultracentrifugation différentielle. Il fait preuve de cohérence et de fiabilité. Les SkM-EV isolés fournissent des informations sur l’homéostasie musculaire et les maladies, avec des applications potentielles en tant que biomarqueurs diagnostiques ou véhicules thérapeutiques.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules enfermées dans des lipides bicouches libérées par les cellules pour transporter des marchandises bioactives, telles que des protéines, des ARN et des ADN, pour la communication intercellulaire. L’étude de la diaphonie médiée par l’EV entre les cellules de l’homéostasie musculaire et des maladies offre un potentiel important pour améliorer notre compréhension du développement, de la régénération et de l’atrophie musculaires. Cependant, les protocoles actuels d’isolement des VE dérivés des muscles squelettiques (SkM-EV) rencontrent des défis pour atteindre une pureté et un rendement élevés, principalement en raison des difficultés à libérer les VE des tissus musculaires sans compromettre les membranes cellulaires. Cet article présente un protocole efficace pour l’isolement SkM-EV, comprenant le détachement mécanique, la dissociation enzymatique, la filtration et l’ultracentrifugation. Ces étapes sont optimisées pour améliorer la libération des VE par les tissus musculaires, ce qui permet d’obtenir des SkM-EV de haute pureté. Par la suite, la cytométrie en nanoflux, le dosage des BCA et le test Western blot sont effectués pour caractériser la quantité et la qualité des SkM-EV isolés. Ce protocole est prometteur pour l’établissement d’une plate-forme fiable permettant d’obtenir des VE dérivées de tissus pour faire progresser la recherche fondamentale, le diagnostic des maladies et l’administration de médicaments.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules de taille nanométrique, liées à une membrane, libérées par les cellules dans l’environnement extracellulaire. Ces VE transfèrent des acides nucléiques, des protéines et des lipides pour moduler plusieurs voies de signalisation lors de l’absorption par les cellules réceptrices. Plus précisément, les VE isolés du muscle squelettique (SkM-EV) ont été impliqués dans la dégénérescence, la régénération et la croissance musculaires en transférant des microARN régulateurs myogéniques ou des facteurs de transcription 1,2,3,4. Au fur et à mesure que notre compréhension des sous-populations et des caractéristiques de SkM-EV continue d’évoluer, ces vésicules semblent prometteuses en tant que biomarqueurs pour les diagnostics précoces ^5,6 et en tant que cibles thérapeutiques pour les troubles neuromusculaires. Ce domaine en expansion offre des opportunités passionnantes pour les investigations pathologiques et les applications cliniques.

Les recherches actuelles sur les SkM-EV se concentrent principalement sur celles obtenues à partir de surnageants de culture cellulaire après culture ex vivo ^2,7,8, soulevant des inquiétudes quant à la fidélité des lignées cellulaires cibles après des passages successifs et à la susceptibilité des caractéristiques des VE à l’altération dans des environnements artificiels. Cela souligne la nécessité d’isoler les SkM-EV directement des tissus musculaires afin d’éviter les influences de la culture ex vivo et de mieux représenter les conditions in vivo. Bien que plusieurs approches aient été mises au point pour isoler les VE des tissus musculaires ^9,10, les études varient encore considérablement dans les détails du protocole, ce qui a une incidence sur l’uniformité et la comparabilité. Il est urgent de mettre en place un protocole normalisé pour l’isolement et la caractérisation de SkM-EV afin d’assurer la fiabilité des études connexes.

Compte tenu des caractéristiques physiologiques du muscle squelettique, nous avons développé un protocole pour isoler et purifier les SkM-EV à partir d’échantillons de muscles squelettiques de rongeurs en utilisant le détachement mécanique, la dissociation enzymatique, la filtration et l’ultracentrifugation différentielle. Grâce à une analyse complète à l’aide de la cytométrie en nanoflux, du dosage des BCA et du dosage par transfert Western, nous avons constaté que ce protocole produit constamment des SkM-EV de grande pureté et en grande quantité dans un délai limité. Il peut être appliqué à des échantillons de muscles squelettiques dans diverses conditions, y compris les blessures musculaires aiguës et chroniques. De plus, avec des ajustements appropriés, cette méthode peut être adaptée aux tissus musculaires de patients humains ou d’autres modèles animaux. La normalisation du processus d’isolement SkM-EV est essentielle pour assurer la cohérence de la qualité SkM-EV, faciliter les comparaisons des caractéristiques des VE - telles que le rendement, la taille, la composition de la cargaison et la fonction - et faire progresser leurs applications potentielles en tant que biomarqueurs diagnostiques, ainsi que pour améliorer notre compréhension de leurs rôles dans divers processus physiologiques et pathologiques.

Protocole

Ce protocole isole les vésicules extracellulaires (VE) du tissu musculaire squelettique à l’aide du détachement mécanique, de la dissociation enzymatique, de la filtration et de l’ultracentrifugation différentielle. Il permet d’isoler les VE à partir de groupes musculaires individuels ou combinés de rongeurs, notamment le tibial antérieur (TA), l’extenseur des doigts longs (EDL), le soléaire (SOL), le gastrocnémien (GAS) et le quadriceps (QUA). L’utilisation des animaux a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Géorgie, et l’étude a été conforme aux directives des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux dans la recherche. Les animaux ont été hébergés dans les animaleries du Département des sciences animales et laitières de l’Université de Géorgie. Des souris mâles adultes de type sauvage (C57BL/6J) ont été utilisées dans cette étude, avec des tissus prélevés sur des souris sacrifiées à l’âge de 3 mois. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont fournis dans la table des matériaux.

1. Détachement mécanique des groupes musculaires de la souris

1. Euthanasier les souris avec du CO₂, suivi d’une luxation cervicale (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Rasez les deux membres postérieurs.
2. Fixez la patte de la souris dans une plaque stérile avec la face antérieure de la patte vers le haut (Figure 1A).
3. Faites une petite incision (5 mm) dans la peau du côté latéral de la cheville de la souris à l’aide de ciseaux de dissection.
4. Insérez soigneusement une lame des ciseaux dans l’incision, en la positionnant sous la peau mais pas dans le tissu musculaire sous-jacent. Ensuite, coupez la peau vers le haut vers le genou pour étendre la longueur de l’incision.
5. Saisissez la peau le long de l’incision à l’aide d’une pince à épiler à bout rugueux et élargissez l’ouverture jusqu’à ce que le muscle soit visible.
6. Localisez le muscle TA, qui s’étend du genou à la cheville sur le côté latéral de l’os du tibia¹¹, et utilisez une pince à épiler à bout pointu pour saisir et décoller la fine couche de tissu conjonctif recouvrant le muscle (Figure 1B).
7. Près de la cheville, identifiez les deux tendons à l’extrémité de l’AT, l’un directement relié au muscle TA et l’autre, le tendon EDL, qui est plus petit et situé à côté du tendon TA sur le côté latéral. Sectionnez les deux tendons à l’aide de ciseaux de dissection.
8. Saisissez les deux tendons à l’aide d’une pince à épiler à bout rugueux. Ensuite, utilisez une autre paire de pinces à épiler rugueuses ou à bout pointu pour séparer les tendons, séparant ainsi le TA de l’EDL (Figure 1C).
9. Soulevez le TA par le tendon fraîchement sectionné à l’aide d’une pince à épiler à bout rugueux. Ensuite, coupez le tendon TA près du genou à l’aide de ciseaux de dissection, enlevant ainsi le muscle. Répétez ce processus pour retirer l’EDL et stockez les deux muscles dans du PBS sur de la glace.
10. Relâchez la jambe et retournez la souris de manière à ce que la face postérieure soit tournée vers le haut.
11. Avec la peau de la jambe maintenant partiellement enlevée, coupez la peau près de la cheville à l’aide de ciseaux de dissection. Ensuite, utilisez une pince à épiler à bout rugueux pour saisir et peler la peau vers le haut vers l’arrière du genou, exposant le GAS.
12. Sectionnez le tendon du GAS près de la cheville à l’aide de ciseaux de dissection (Figure 1D).
13. Saisissez le tendon du GAS à l’aide d’une pince à épiler à bout rugueux et soulevez-le vers le haut pour exposer la face inférieure du GAS.
14. Localisez le petit tendon SOL sur la face inférieure du GAS près du genou (où le GAS est toujours connecté). Sectionnez le tendon du SOL à l’aide de ciseaux de dissection, ce qui fait que le SOL se contracte vers le haut (Figure 1E).
15. Saisissez le tendon SOL sectionné à l’aide d’une pince à épiler à bout pointu et soulevez-le doucement, détachant ainsi le SOL de la face inférieure du GAS.
16. Sectionnez l’extrémité du SOL à l’endroit où il s’attache à l’extrémité sectionnée du GAZ à l’aide de ciseaux de dissection, séparant ainsi les deux muscles. Conservez le SOL dans PBS sur glace.
17. Coupez l’extrémité du GAS près du genou et placez-le dans du PBS sur de la glace.
18. Après avoir retiré les quatre muscles énumérés sous le genou, retournez la souris de manière à ce que la face antérieure soit vers le haut.
19. Si nécessaire, pelez davantage la peau avec une pince à épiler à bout rugueux pour exposer le QUA. Positionnez la patte de la souris à un angle de 90° pour forcer le QUA à fléchir. Sectionnez le tendon le plus proche du genou à l’aide de ciseaux de dissection.
    1. Séparez le QUA du fémur en coupant entre le muscle et l’os jusqu’à ce que le QUA ne soit relié que par le tendon proximal (Figure 1E). Ensuite, sectionnez le tendon proximal et retirez le QUA. Placez le QUA dans PBS sur de la glace.
20. Assurez-vous qu’après les décollements musculaires, le tibia et le péroné sont clairement exposés (Figure 1F).
21. Rincez les muscles plusieurs fois avec du PBS pour éliminer les contaminants tels que la fourrure et le sang (Figure 1G). Ensuite, séchez doucement les muscles avec du papier absorbant. Utilisez une balance analytique pour mesurer le poids musculaire, qui sera utilisé plus tard pour calculer la VLE collectée par gramme de muscle.

2. Dissociation enzymatique des morceaux musculaires détachés

1. Retirez délicatement les tendons musculaires de l’échantillon musculaire à l’aide d’une pince à épiler à bout pointu, d’une pince à échardes, d’un scalpel ou de ciseaux (figure 2A).
2. Après l’ablation du tendon, coupez le muscle longitudinalement le long des fibres musculaires (de tendon à tendon) en morceaux de muscle de 1 mm d’épaisseur à l’aide de ciseaux ou d’un scalpel pour augmenter le rapport surface/volume (Figure 2B,C).
   REMARQUE : Essayez de limiter les dommages aux myofibres pendant la coupe. Pour les muscles plus gros tels que le TA, le GAS et le QUA, effectuez des coupes supplémentaires par rapport aux muscles plus petits comme l’EDL et le SOL pour assurer un rapport surface/volume à peu près égal dans tous les échantillons musculaires (Figure 2D).
3. Préparez 10 ml de tampon d’enzymes digestives (DEB) frais pour chaque souris et conservez-le sur de la glace jusqu’à utilisation.
   1. Pour préparer le DEB, mélanger 2 mg d’enzyme collagénase II par 1 mL de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec une solution de pénicilline-streptomycine à 1 %. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,2 μm après le mélange.
   2. S’assurer que le DEB a une activité enzymatique de plus de 250 unités. Agitez le DEB jusqu’à ce que la solution soit bien mélangée et que la poudre d’enzyme collagénase II ne soit plus visible.
4. Séparez le tissu musculaire en aliquotes contenant chacune 20 mg de tissu musculaire. Ensuite, ajoutez 1 mL de DEB à chaque aliquote pour la dissociation enzymatique.
5. Incuber le mélange DEB et musculaire sur un agitateur dans l’incubateur à 37 °C pendant 12 h à une vitesse d’agitation de 100 rotations par minute (tr/min) (figure 2E).

3. Filtration et centrifugation à basse vitesse pour enrichir le SkM-EV

REMARQUE : Réglez la centrifugeuse réfrigérée à 4 °C et faites-la fonctionner jusqu’à ce qu’elle atteigne la température réglée. Conservez tous les tubes et échantillons nécessaires sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi.

1. Après les procédures de digestion enzymatique, assurez-vous qu’aucun morceau musculaire discernable n’est visible (Figure 3A). Avant la centrifugation réfrigérée, extraire 10 μL de solution du mélange DEB-muscle et la transférer dans un tube de 0,2 mL pour tester la viabilité cellulaire si nécessaire.
2. Préparez et étiquetez les nouveaux tubes à centrifuger vides de 1,5 ml. Installez un filtre de 0,45 μm et une seringue de 5 mL en retirant le piston (ne pas jeter) et en vissant le moyeu dans l’extrémité supérieure du filtre de 0,45 μm. Positionnez le filtre de manière à ce que l’extrémité inférieure soit placée dans un tube vide nouvellement étiqueté (Figure 3D). Filtrez le 1x PBS à travers un filtre de 0,2 μm.
3. Centrifugez le mélange pendant 10 min à 1 000 x g et 4 °C pour granuler les débris (Figure 3B). Transvasez le surnageant (environ 1 mL) dans la seringue à l’aide d’une micro-pipette P200 (Figure 3C,E).
4. Réinsérez le piston de la seringue et poussez lentement le surnageant à travers le filtre, ce qui lui permet de passer à travers et de s’accumuler dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL nouvellement étiqueté (figure 3F).
5. Retirez à nouveau le piston et pipetez environ 200 μL de 1x PBS dans la seringue.
6. Réinsérez le piston et poussez lentement les 200 μL de 1x PBS à travers le filtre (Figure 3G) pour éliminer tout surnageant restant du filtre et dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL étiqueté.
7. Répétez le processus de filtration pour d’autres tubes, en utilisant un nouveau filtre pour chaque échantillon de tissu.
8. Après la filtration, assurez-vous que la solution est transparente et dépourvue de morceaux musculaires résiduels (Figure 3H).

4. Ultracentrifugation différentielle pour la purification SkM-EV

REMARQUE : Réglez la centrifugeuse réfrigérée à 4 °C et faites-la fonctionner jusqu’à ce qu’elle atteigne la température réglée. Gardez tous les tubes et échantillons nécessaires sur de la glace et prêts à l’emploi.

1. Transférez la solution filtrée dans des microtubes neufs de 1,5 mL (pouvant contenir jusqu’à 200 000 x g). Équilibrez tous les microtubes avec 1x PBS supplémentaire pour assurer un volume égal avant de les placer dans la micro-ultracentrifugeuse.
2. Après s’être assuré que le volume de tous les tubes est égal, fermez les tubes et placez-les dans le rotor de la micro-ultracentrifugeuse à équilibrer (Figure 4A).
3. Allumez la micro-ultracentrifugeuse et réglez-la pour qu’elle fonctionne pendant 1 h à 100 000 x g et 4 °C (Figure 4B).
4. Placez le rotor chargé avec les tubes dans la micro-ultracentrifugeuse, fermez le couvercle et allumez le vide (Figure 4C).
5. Une fois que le vide atteint le niveau 2, appuyez sur le bouton de démarrage et attendez que le processus de centrifugation soit terminé (Figure 4D).
6. Une fois le cycle de micro-ultracentrifugeuse terminé, cliquez sur le bouton de vide pour repressuriser la chambre avant de retirer le rotor et les tubes. Gardez les tubes sur de la glace et placez-les à la verticale pour éviter de déranger la pastille.
7. Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une micropipette P200, en évitant de perturber la pastille (figure 4E).
8. Éjectez l’embout, puis ajoutez 50 μL de 1x PBS dans le tube après avoir retiré le surnageant à l’aide d’une micropipette P200. Pour les échantillons de gaz et de qua, ajouter jusqu’à 500 μL de 1x PBS pour faciliter la dissolution (figure 4F).
9. Remettez la pastille en suspension en la pipetant doucement de haut en bas à l’aide d’une micropipette P20 (ou d’une micropipette P200 si 500 μL ont été ajoutés) jusqu’à ce qu’elle soit complètement brisée et qu’elle ne soit plus visible.
10. Fermez le tube et conservez-le à 4 °C pour un stockage à court terme (moins d’une semaine), à -80 °C pour un stockage à long terme, ou replacez le tube sur de la glace si l’échantillon doit être immédiatement caractérisé à l’aide de la cytométrie en nanoflux, du Western blot ou d’autres dosages.

Résultats

À la suite de ce protocole, des vésicules extracellulaires musculaires squelettiques (SkM-EV) ont été extraites avec succès de divers groupes musculaires, notamment le tibial antérieur (TA), le long extenseur des doigts (EDL), le soléaire (SOL), le gastrocnémien (GAS) et le quadriceps (QUA) de souris de type sauvage. La caractérisation ultérieure de ces SkM-EV a été réalisée par cytométrie en nanoflux, élucidant leurs caractéristiques distinctes telles que résumées dans le tableau 1. Remarquablement, à p...

Discussion

Le protocole commence par la dissection de groupes musculaires des membres postérieurs de souris ou l’acquisition de tissus musculaires humains post-mortem sur la base des protocoles disponibles¹⁶. Les procédures d’isolement des vésicules extracellulaires des muscles squelettiques (SkM-EV) suivantes comprennent trois sections principales : digestion enzymatique légère du tissu pour libérer les SkM-EV interstitiels, filtration et centrifugation à basse vitesse, et ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microtubes à centrifuger de 0,6 mL	ThermoFisher Scientific	05-408-120
Microtube de 1,5 mL (C)  ;	Eppendorf	5720411009
1,5 mL microtubes à centrifuger	ThermoFisher Scientific	3448	Transparent, gradué, non stérile
BD 5 mL Seringue	Becton Dickinson	14-827-52  ;	Pointe Luer-Lok
Lames de comptage de cellules, double chambre pour compteur de cellules	Bio-Rad	145-0011
Centrifugeuse 5430R	Eppendorf	22620667
Solution de nettoyage	NanoFCM Inc.
Collagénase II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
DPBS (10x) Liquide (-calcium,-magnésium)	Cytiva	SH30378.02	dilution finale utilisée est de 1x
DPBS/Modified (1x)	Cytiva	SH30264.02
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Genesee Scientific	25-500
E-POD Pure Distributeur d’eau à distance	Millipore Sigma	ZRXSP0D01
FA-45-30-11 Microcentrifugeuse Rotor	Eppendorf	05-401-503
Fisher Vortex Genie 2	ThermoFisher Scientific	12-812
NanoAnalyzer Flow	NanoFCM Inc.
Heratherm OGS60 Four à protocole général	ThermoFisher Scientific	51028112	Convection par gravité, 2,3 pi³ 120 V
MemGlow-488 Sonde	Cytoskeleton Inc.	MG01-02
Millipak Special Millipore Millipore	Millipore Sigma	TANKMPK02
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15070063
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Pointes de pipette ER LTS 1000µ ; L F 768G/8	Rainin	30808038
Pointes de pipette ER LTS 20µ ; L F 960G/10	Rainin	30807966
Pointes de pipette ER LTS 200µ ; L F 960G/10	Rainin	30807967
Perles de contrôle de la qualité	NanoFCM Inc.
S110-AT Rotor à angle fixe	ThermoFisher Scientific	45539	1,10,000 tr/min
S16 exo 65-155nm	billes NanoFCM Inc.
Ciseaux	SPI, USA
Sorvall mX 150+ Micro-Ultracentrifugeuse	ThermoFisher Scientific	50135641
TC 20 compteur de cellules automatisé	Bio-Rad	1450102
Trypan Blue Solution	Corning	25-900-CI
Pince à épiler	SPI, USA
VWR 15mL tubes à centrifuger	Avantor	89039-668
Whatman Puradisc 13 Filtres	Cytiva	6782-1304	0.45 µ ; m taille des pores
Souris sauvages C57BL/6J	Laboratory	stock #000664