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Article de méthode

Visualisation de la sialylation intracellulaire avec la chimie clic et la microscopie à expansion

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DOI :

10.3791/67479

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7 février 2025

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1Univ. Lille, CNRS, UMR 8576 - UGSF - Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, 2Univ. Lille, CNRS, UMR 8520 - IEMN – Institut d’Electronique, de Microelectronique et de Nanotechnologie, 3Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, US 41 - UAR 2014 - PLBS

Dans cet article

Résumé

Ici, nous proposons un protocole simple combinant l’ingénierie des oligosaccharides métaboliques, la chimie click et la microscopie à expansion qui permet la bio-imagerie des N-glycoprotéines sialylées intracellulaires avec une résolution améliorée à l’aide d’équipements de microscopie de routine.

Résumé

Les techniques de marquage métabolique permettent l’incorporation de rapporteurs bioorthogonaux dans les glycanes, permettant la bioconjugaison ciblée des colorants moléculaires au sein des cellules par clic et chimie bioorthogonale. L’ingénierie métabolique des oligosaccharides (MOE) a suscité un intérêt considérable en raison du rôle essentiel de la glycosylation dans de nombreux processus biologiques impliquant la reconnaissance moléculaire et de son impact sur des pathologies allant du cancer aux troubles génétiques en passant par les infections virales et bactériennes.

Bien que la MOE soit mieux connue pour la détection des glycoconjugués de surface cellulaire, il s’agit également d’une méthodologie très importante pour l’étude des glycanes intracellulaires dans des contextes physiologiques et pathologiques. De telles études bénéficient grandement d’une haute résolution spatiale. Cependant, la microscopie à super-résolution n’est pas facilement disponible dans la plupart des laboratoires et pose des défis pour la mise en œuvre quotidienne. La microscopie à expansion est une alternative récente qui améliore la résolution de la microscopie en agrandissant physiquement les échantillons biologiques marqués avec des marqueurs fluorescents. En intégrant l’échantillon dans un gel gonflant et en le faisant se dilater isotropement par traitement chimique, les structures subcellulaires peuvent être visualisées avec une précision et une résolution accrues sans avoir besoin de techniques de super-résolution.

Dans ce travail, nous illustrons la capacité de la microscopie à expansion à visualiser les glycanes sialylés intracellulaires grâce à l’utilisation combinée de la MOE et de la chimie click. Plus précisément, nous proposons une procédure de marquage bioorthogonal et de microscopie à expansion qui utilise un rapporteur ciblant la sialylation, qui peut être associée à l’immunofluorescence pour les études de co-localisation. Ce protocole permet des études de localisation de la biosynthèse des sialoconjugués, du trafic intracellulaire et du recyclage.

Introduction

La microscopie à fluorescence, bien que largement utilisée pour le marquage et la visualisation de molécules spécifiques dans les cellules, est intrinsèquement limitée en résolution par la limite de diffraction de la lumière1 d’Abbe, qui limite la capacité de distinguer les objets situés à moins de 200-250 nm environ. Cette limitation provient de la nature ondulatoire de la lumière et de l’ouverture numérique de la lentille de l’objectif du microscope, ce qui pose un défi lors de l’imagerie des structures subcellulaires. Le dépassement de ces limites permet de mieux comprendre certains processus biologiques à l’échelle nanométrique.

Pour dépasser la limite de diffraction de la lumière, des techniques de microscopie à super-résolution telles que STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) et STED (Stimulated Emission Depletion) ont été développées 2,3. STORM repose sur l’activation stochastique des fluorophores, ne permettant d’imager qu’un sous-ensemble clairsemé à un moment donné. Cela permet de localiser avec précision les fluorophores individuels, ce qui permet la reconstruction d’une image à haute résolution. STED, quant à lui, améliore la résolution en utilisant un laser d’appauvrissement pour éteindre sélectivement la fluorescence autour de la périphérie du point d’excitation, réduisant ainsi efficacement la fonction d’étalement du point.

Ces approches contrastent avec la microscopie à champ large ou confocale, où tous les fluorophores sont détectés simultanément, ce qui donne une image qui combine tous les motifs de diffraction et empêche la distinction entre les fluorophores individuels proches, entraînant une perte de résolution. Cependant, ces méthodes de super-résolution nécessitent des sources lumineuses, des équipements, une préparation d’échantillons et/ou des fluorophores très spécifiques, ce qui rend ces technologies coûteuses, difficiles d’accès dans la plupart des laboratoires et difficiles à mettre en œuvre dans les expériences de routine. Ces contraintes ont conduit la communauté scientifique à rechercher des solutions alternatives pour obtenir une résolution plus élevée, qui seraient compatibles avec les équipements de microscopie facilement disponibles et les protocoles de coloration de routine. En 2015, Boyden et ses collègues ont mis au point une méthode permettant de contourner les limites de la microscopie optique en élargissant physiquement l’échantillon, appelée microscopie d’expansion (ExM)4.

ExM est une méthode en trois étapes qui fournit des détails à l’échelle nanométrique d’échantillons biologiques sans dépasser la limite de diffraction de la lumière (Figure 1). Au lieu de cela, il utilise des microscopes conventionnels limités par la diffraction pour imager des échantillons qui ont été physiquement agrandis de manière isotrope. La première étape, appelée gélification, consiste à intégrer l’échantillon biologique, généralement des cellules ou des tissus fixés, dans un hydrogel polyélectrolytique gonflant à base d’acrylate de sodium et d’acrylamide. L’échantillon biologique subit ensuite un traitement enzymatique pour dégrader partiellement certains composants tels que les protéines ou les membranes, et décomposer les structures cellulaires denses pour garantir l’expansion uniforme des cellules. Cette étape, appelée digestion, permet d’y parvenir en homogénéisant les composants structurels de l’échantillon en ce qui concerne les propriétés mécaniques, empêchant ainsi l’expansion différentielle qui pourrait entraîner une distorsion de l’échantillon. Enfin, dans la dernière étape, appelée expansion, l’échantillon enrobé d’hydrogel et digéré est placé dans de l’eau désionisée, ce qui le fait gonfler. Cette technologie permet à l’échantillon d’augmenter d’un facteur de grossissement linéaire d’environ 4 à 5x dans toutes les dimensions, ce qui permet de visualiser de fins détails cellulaires à l’aide de techniques de microscopie standard. Compte tenu de la nature isotrope de l’expansion, l’échantillon biologique agrandi à l’intérieur de la matrice de gel conserve ses détails géométriques tridimensionnels et les relations spatiales entre ses différents composants structurels. L’information spatiale est donc préservée lors du gonflement, tandis que la distance entre les marqueurs fluorescents ancrés dans le gel ou les biomolécules augmente uniformément dans toutes les directions. Cela permet une meilleure séparation des signaux, ce qui se traduit par une résolution améliorée.

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Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole ExM. (a) Gélification : L’échantillon biologique est ancré et noyé dans un hydrogel polyélectrolytique gonflant. b) Digestion : Les propriétés mécaniques de l’échantillon sont homogénéisées par l’utilisation d’enzymes et de détergents, décomposant les protéines et les membranes lipidiques qui, autrement, limiteraient l’expansion et créeraient des distorsions. (c) Expansion : L’hydrogel est immergé dans de l’eau déminéralisée, ce qui provoque une expansion isotrope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Depuis 2015, ExM a constaté d’importantes améliorations technologiques dans la préservation de l’information spatiale. En particulier, divers ancrages moléculaires ont été conçus pour fixer de manière covalente des biomolécules directement sur l’hydrogel gonflant 5,6. Dans ce protocole, nous avons utilisé le N-acryloxysuccinimide (NAS), qui réagit avec les groupes amines libres des biomolécules (généralement, les résidus de lysine ou les positions N-terminales des protéines) pour bioconjuguer un groupe acryloyle aux protéines de la cellule, y compris les glycoprotéines. Ce groupe acryloyle réagit ensuite avec d’autres monomères par des réactions de réticulation pendant la gélification, ancrant ces biomolécules directement au polymère.

ExM est compatible avec un large éventail de méthodes de marquage, y compris l’ingénierie métabolique des oligosaccharides (MOE). MOE est un outil puissant qui permet le marquage des glycanes en incorporant des analogues de précurseurs métaboliques équipés d’une poignée chimique bioorthogonale7. Ces analogues, connus sous le nom de rapporteurs chimiques, s’intègrent dans les voies métaboliques sans provoquer de toxicité. Dans l’approche MOE, les monosaccharides rapporteurs sont métaboliquement transformés en sucres nucléotidiques activés, puis transférés dans des glycoconjugués naissants. Nous nous concentrons principalement sur l’étude de la sialylation, en particulier la dynamique intracellulaire et le trafic des N-glycoprotéines sialylées, qui sont cruciales dans le contexte de la santé et de la maladie en raison de leur rôle dans les interactions cellule-cellule, la régulation immunitaire et le développement. La sialylation anormale est impliquée dans des maladies telles que le cancer 8,9,10,11, les maladies infectieuses12 et les troubles génétiques 13,14,15, ce qui en fait une cible clé pour le développement thérapeutique et la découverte de biomarqueurs. La compréhension de la sialylation permet de mieux comprendre la glycobiologie et les mécanismes de la maladie.

La sialylation peut être sondée à l’aide de MOE avec des analogues de l’acide N-acétylneuraminique (Neu5Ac), l’acide sialique le plus abondant chez l’homme, ou avec des analogues de la N-acétylmannosamine (ManNAc), un précurseur métabolique de Neu5Ac, portant une poignée bioorthogonale 8,16. Le ManNAc est converti en Neu5Ac dans le cytosol, puis activé en acide cytidine-5'-monophospho-N-neuraminique (CMP-Neu5Ac) dans le noyau. Une fois activées en sucre nucléotidique, les sialyltransférases dans l’appareil de Golgi transfèrent les unités Neu5Ac aux positions terminales des chaînes de glycanes en croissance (Figure 2). Suite à l’incorporation métabolique de dérivés non naturels de ManNAc, les glycanes sialylés marqués peuvent être liés de manière covalente à un fluorophore portant un groupe réactif complémentaire à la poignée rapporteure par chimie clic bioorthogonale. Cela permet l’observation directe des glycoconjugués in vivo ou ex vivo.

Pour la plupart des rapporteurs monosaccharides, une forme peracétylée est nécessaire pour traverser la membrane plasmique par diffusion passive. Cependant, il a été démontré que les rapporteurs peracétylés et non protégés sondent efficacement la sialylation16. Les rapporteurs de sialylation non protégés sont capables de pénétrer dans les cellules par des mécanismes de transport actifs, à savoir la pinocytose pour les analogues de Neu5Ac, et un transporteur encore non identifié pour ManNAc. Alors que les sucres non protégés nécessitent une concentration plus élevée (généralement 100-500 μM) pour obtenir des effets comparables, une fois à l’intérieur de la cellule, ils peuvent entrer directement dans la voie métabolique de l’acide sialique. En revanche, les sucres peracétylés doivent être entièrement désacétylés par des estérases non spécifiques intracellulaires avant de devenir métaboliquement actifs. Bien qu’ils puissent être utilisés à des concentrations plus faibles (généralement de 10 à 50 μM), une désacétylation incomplète peut interférer avec l’activité enzymatique ou conduire à l’incorporation d’analogues de l’acide sialique partiellement acétylés, ce qui peut fausser l’analyse en aval. De plus, la libération d’acide acétique peut affecter le pH localement, ce qui peut avoir un impact sur la fonction cellulaire. Chen et ses collègues ont également démontré que les sucres per-O-acétylés réagissent avec les résidus de cystéine libres dans les protéines via un mécanisme non enzymatique, conduisant à une incorporation hors cible et à une augmentation du signal non spécifique17,18. Dans le présent protocole, nous employons donc des reporters non protégés.

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Figure 2 : Ingénierie des oligosaccharides métaboliques et marquage des acides sialiques. UDP-GlcNAc est converti en ManNAc par le domaine UDP-GlcNAc 2-épimérase de GNE/MNK dans le cytosol. Le ManNAc est ensuite phosphorylé dans le cytosol par le domaine ManNAc 6-kinase de GNE/MNK pour former du ManNAc-6-phosphate. La N-acétylneuraminate synthase catalyse la condensation du ManNAc-6-P avec le phosphoénolpyruvate pour produire le Neu5Ac-9-phosphate, qui est ensuite déphosphorylé par la phosphatase de l’acide sialique pour produire le Neu5Ac. Neu5Ac peut également être fourni par la voie de récupération via l’endocytose et le recyclage lysosomal8. Après avoir été transporté vers le noyau, il est converti en CMP-Neu5Ac par la CMP-synthétase d’acide sialique. Dans l’appareil de Golgi, CMP-NeuAc est le substrat des sialyltransférases qui introduisent une fraction Neu5Ac aux positions terminales des glycanes sur les glycoconjugués en maturation, qui sont finalement exprimés au niveau de la membrane cellulaire ou sécrétés. Les rapporteurs chimiques ManNAz portant une poignée bioorthogonale peuvent pénétrer dans la cellule par le biais d’un transporteur actif non identifié et entrer dans la voie métabolique. Les unités Neu5Az marquées incorporées dans les glycanes après biosynthèse sont ensuite marquées par conjugaison médiée par CuAAC d’une sonde fluorescente. Abréviations : NAc = N-acétyle ; UDP-GlcNAc = N-acétylglucosamine de diphosphate d’uridine ; ManNAc = N-acétylmannosamine ; GNE = UDP-GlcNAc 2-épimérase ; MNK = ManNAc 6-kinase ; ManNAc-6-P = ManNAc-6-phosphate ; NANS = N-acétylneuraminate synthase ; PEP = phosphoénolpyruvate ; Neu5Ac = acide N-acétylneuraminique ; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-phosphate ; NANP = phosphatase d’acide sialique ; CMP = cytidine-5′-monophosphate ; CMAS = CMP-acide sialique synthétase ; ST = sialyltransférases ; ManNAz = N-azidoacétylmannosamine ; Neu5Az = acide N-azidoacétylneuraminique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Parmi les réactions bioorthogonales possibles, nous nous sommes intéressés à la cycloaddition d’azoture-alcyne catalysée par le cuivre (CuAAC)16,19. D’après notre expérience, CuAAC est la meilleure option pour marquer les glycanes intracellulaires dans les cellules fixes. Cette réaction est bien établie, étudiée en profondeur en chimie bioorthogonale, et a été normalisée pour une utilisation dans des environnements biologiques complexes, fournissant une base solide de connaissances et des protocoles optimisés. Sa cinétique rapide offre en effet une efficacité de réaction et une spécificité élevées, et il implique des groupes azides et alcynes faciles à synthétiser, stables, absents des systèmes vivants et inertes vis-à-vis des biomolécules natives, ce qui le rend idéal pour les applications à cellules fixes où la toxicité du cuivre n’est pas un problème. La cycloaddition d’alcyne-azoture (SPAAC)20,21, tout en évitant la toxicité du cuivre, a une cinétique plus lente et des sondes plus volumineuses, ce qui tend à conduire à un signal de fond plus élevé et à une diminution du rapport signal/bruit pour les applications intracellulaires en raison du piégeage hydrophobe, tandis que l’IEDDA (IEDDA)22,23, bien que rapide et sans cuivre, implique une synthèse de sonde plus complexe et nécessite des groupes rapporteurs plus volumineux qui n’ont pas encore été entièrement caractérisés dans les applications MOE. Étant donné que l’ExM nécessite exclusivement des cellules fixes, CuAAC offre une solution robuste et efficace pour le marquage bioorthogonal.

Cet article présente un protocole pour la visualisation des glycoprotéines sialylées intracellulaires dans les cellules, combinant le marquage métabolique, la chimie clic bioorthogonale et la microscopie à expansion. Dans les procédures expérimentales décrites dans cet article, nous utilisons la N-azidoacétylmannosamine (ManNAz) comme rapporteur chimique, et la ligature CuAAC de petits fluorophores organiques est effectuée avant la procédure d’expansion. Les glycoprotéines sont ancrées à l’hydrogel avec des NAS avant la gélification, la digestion et l’expansion. Le marquage MOE des acides sialiques peut être associé à des approches d’immunofluorescence pour l’évaluation de la co-localisation, comme illustré ici avec un anticorps primaire anti-GM130 de souris localisé dans l’appareil cis-Golgi. Ce protocole peut être appliqué à des cellules dans leur état physiologique, ou à des cellules qui ont été soumises à un traitement chimique. Pour illustrer cela, la chloroquine a été utilisée pour inhiber la fonction lysosomale, qui affecte le traitement et le trafic des glycoprotéines dans les cellules. La coloration nucléaire est utilisée comme point de repère, non seulement pour localiser les cellules, mais aussi comme indicateur de la qualité du processus ExM. Le facteur d’expansion peut en effet être mesuré en comparant la taille du noyau de pré-expansion (preExM) et de post-expansion (postExM).

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Protocole

1. Ensemencement cellulaire

REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire. Cette méthode peut être appliquée à n’importe laquelle des lignées cellulaires utilisées dans le présent travail (HeLa, MCF7, fibroblastes primaires), ou à la plupart des modèles de lignées cellulaires adhérents couramment utilisés dans la recherche 20,24,25.

  1. Cultivez des cellules dans un milieu à haute teneur en glucose DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) dans une fiole T75 à 37 °C sous une atmosphère à 5 % de CO2 .
  2. Une fois que les cellules ont atteint leur pleine confluence, retirez le milieu de culture cellulaire et lavez les cellules avec 4 ml de PBS.
    REMARQUE : Les solutions PBS utilisées dans cette étape et toutes les étapes de lavage ultérieures doivent être rendues stériles par filtration à travers une membrane PTFE de 0,2 μm avant utilisation.
  3. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C dans 2 mL de 1x solution de trypsine-EDTA contenant 0,5 g/L de trypsine, pour les libérer du fond du ballon.
  4. Ajoutez 8 ml de milieu à haute teneur en glucose DMEM contenant 10 % de FBS et mélangez soigneusement pour vous assurer que chaque cellule est détachée du fond du ballon.
  5. Transférez les cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifugez-les pendant 5 minutes à 200 × g. Entre-temps, ajoutez une lamelle de recouvrement (diamètre 12 mm, épaisseur 130-160 μm) à chaque puits d’une plaque à 12 puits.
    REMARQUE : L’épaisseur de la lamelle de recouvrement doit être ajustée pour correspondre aux exigences du microscope utilisé dans les étapes d’imagerie ultérieures.
  6. Retirer le surnageant après centrifugation et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu de culture cellulaire.
  7. Déterminer le nombre moyen de cellules/mL par hémocytométrie sur au moins deux mesures.
  8. Diluez la suspension cellulaire à une concentration de 300 000 cellules par mL dans un milieu de culture cellulaire et ensemencez 1 mL de la suspension dans chaque puits.
  9. Laissez les cellules reposer pendant 24 h dans un milieu riche en DMEM contenant 10 % de FBS à 37 °C sous une atmosphère de 5 % de CO2 avant les étapes suivantes.

2. Traitement à la chloroquine (facultatif)

REMARQUE : Les étapes 2.1 à 2.8 illustrent comment utiliser le protocole sur des cellules traitées avec un réactif externe (inhibiteur, effecteur, médicament), en utilisant la chloroquine comme exemple. Sautez ces étapes pour les cellules non traitées avec des réactifs externes.

  1. Peser la bonne quantité de sel de diphosphate de chloroquine (CQ) pour préparer un volume suffisant d’une solution mère de 10 mM.
    REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire.
  2. Solubiliser le CQ solide dans la quantité souhaitée d’eau déminéralisée pour une concentration finale de 10 mM.
  3. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,2 μm.
  4. Aliquote 1 mL de la solution mère de 10 mM dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et les stocker à -20 °C.
  5. Lavez l’échantillon de cellules préparé à l’étape 1.9 avec 1 mL de PBS.
  6. Ajouter 100 μL de 10 mM CQ dans 9,9 mL de milieu à haute teneur en glucose DMEM contenant 10 % de FBS, pour une concentration finale de 100 μM de CQ.
  7. Incuber des cellules pendant 8 h dans 1 mL d’un milieu complété par 100 μM de CQ à 37 °C sous une atmosphère à 5 % de CO2 .
  8. Lavez les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS.

3. Ingénierie des oligosaccharides métaboliques

  1. Préparez une solution mère de 5 mM de ManNAz (ou ManNAc pour la condition de contrôle négatif) dans un milieu DMEM à haute teneur en glucose contenant 10 % de FBS.
    REMARQUE : Cette solution mère doit être d’un volume suffisant pour que chaque puits puisse être traité avec 1 mL de solution analogue de sucre. Effectuez les étapes suivantes dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire.
  2. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm et la stocker dans des aliquotes de 1 mL à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
  3. Préparez un milieu complété par 500 μM de ManNAz ou de ManNAc en diluant une aliquote de solution mère de 1 mL préparée à l’étape 3.2 avec 9 mL de milieu à haute teneur en glucose DMEM contenant 10 % de FBS.
  4. Incuber les cellules préparées à l’étape 1.9 (pour les expériences sur des cellules non traitées) ou à l’étape 2.8 (pour les expériences sur des cellules traitées au CQ) dans 1 mL du milieu complété par 500 μM de ManNAz (ou 500 μM de ManNAc pour le groupe témoin) pendant 24 h à 37 °C sous une atmosphère à 5 % de CO2 .

4. Fixation et perméabilisation

REMARQUE : Toutes ces étapes sont effectuées sous une hotte.

  1. Lavez les échantillons avec 1 mL de PBS.
  2. Fixez les cellules sur chaque lamelle en ajoutant 500 μL de paraformaldéhyde à 5 %. Laissez reposer 15 min à température ambiante.
  3. Laver 3 fois avec 1 ml de PBS.
  4. Préparez une chambre humide personnalisée à l’aide d’une boîte opaque suffisamment grande (p. ex., une boîte en polystyrène) munie d’un couvercle. Placez un morceau de papier buvard humide au fond de la boîte, puis déposez une couche de parafilm dessus.
    REMARQUE : La chambre humide doit protéger complètement l’échantillon des sources de lumière extérieures lorsqu’elle est fermée.
  5. Placez les lamelles sur le parafilm, les cellules vers le haut.
    REMARQUE : Étiquetez à l’avance le parafilm avec le nom ou la référence des échantillons.
  6. Effectuer la perméabilisation cellulaire à l’aide de 200 μL de Triton X-100 à 0,5 % (v/v) dans du PBS pendant 15 min à température ambiante.
  7. Laver 3 fois avec 200 μL de PBS.

5. Marquage par fluorescence

  1. Marquage CuAAC des glycanes sialylés marqués
    REMARQUE : Le tampon de réaction CuAAC doit être fraîchement préparé avant utilisation, et les réactifs doivent être ajoutés dans l’ordre spécifié, l’ascorbate de sodium étant ajouté en dernier. Dans les solutions aqueuses oxygénées, les ions Cu(I) formés par la réduction de Cu(II) avec de l’ascorbate se réoxydent progressivement en Cu(II), entraînant une diminution de la concentration d’ascorbate au fil du temps. Pour maintenir la reproductibilité des résultats, le tampon ne doit pas être stocké plus de quelques jours à 4 °C et est utilisé de préférence le même jour.
    1. Pour marquer les glycanes sialylés modifiés à l’azoture étudiés dans la section 3, préparez un tampon de réaction CuAAC composé de 5 μM d’alcyne AlexaFluor 488 (AF488Alk), de 150 μM CuSO4, de 300 μM 2-(4-((bis((1-(tert-butyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)méthyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)acétique (BTTAA), 0,1 M K2HPO4 et 2,5 mM d’ascorbate de sodium dans de l’eau déminéralisée. Préparez suffisamment de solution pour appliquer 200 μL sur chaque lamelle.
    2. Ajoutez 200 μL de tampon CuAAC sur chaque lamelle pour amorcer la réaction. Assurez-vous que l’échantillon est recouvert de manière homogène avec la goutte et laissez-le réagir pendant 45 min à température ambiante, à l’abri de la lumière.
    3. Laver 3 fois avec 200 μL de PBS pour arrêter la réaction et éliminer l’excès de sonde et de réactifs.
  2. Coloration du noyau
    1. Pour le marquage nucléaire avec Hoechst 33342, diluer une solution mère de 10 mg/mL à 1:2000 dans du PBS.
      REMARQUE : Des contre-colorants nucléaires équivalents tels que le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) peuvent être utilisés au même effet.
    2. Couvrez les cellules avec 200 μL de cette solution et incubez pendant 5 à 10 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière.
    3. Laver 3 fois avec 200 μL de PBS.
  3. Coloration par immunofluorescence
    1. Préparez un tampon bloquant l’albumine sérique bovine (BSA) contenant 0,1 g de gélatine, 1 g de BSA, 1 mL de FBS et 49 mL de PBS pour 50 mL de tampon.
    2. Incuber les échantillons pendant 1 h à 4 °C dans 200 μL de tampon de blocage BSA. Protégez l’échantillon de la lumière.
    3. Pour la coloration par immunofluorescence de l’appareil de Golgi à l’aide d’un anticorps anti-GM130 de souris purifié (épitope reconnu : Rat GM130 aa. 869-982 | RRID : AB_398142), diluer l’anticorps primaire à 1:100 dans le tampon de blocage de la BSA préparé.
      REMARQUE : Cette étape peut être adaptée à la coloration par immunofluorescence ciblant d’autres organites en utilisant tout anticorps primaire pertinent, auquel cas le facteur de dilution doit être adapté conformément aux directives du fabricant.
    4. Ajouter 70 μL de la solution contenant l’anticorps dans les lamelles et incuber pendant 1 h à 4 °C, à l’abri de la lumière.
    5. Laver 3 fois avec 200 μL de PBS.
    6. Diluer l’anticorps secondaire fluorescent (Alexa Fluor 546 anti-IgG souris) à 1:600 dans un tampon bloquant BSA et ajouter 100 μL sur chaque lamelle.
    7. Incuber les échantillons pendant 1 h à température ambiante, à l’abri de la lumière.
    8. Laver 3 fois avec 200 μL de PBS.
    9. Transférez les lamelles dans une plaque à 6 puits. Conservez les échantillons dans 2 mL de PBS à 4 °C pendant quelques jours, à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : il est conseillé de toujours préparer une réplique exclusivement pour la visualisation préExM comme référence à des fins de comparaison avant et après l’expansion et pour s’assurer que le modèle d’étiquetage n’a pas été déformé après l’expansion.

6. Imagerie de pré-expansion des échantillons

REMARQUE : Les étapes suivantes dépendent de l’équipement de bioimagerie utilisé et peuvent devoir être ajustées aux exigences de l’appareil. Veuillez suivre les règles du laboratoire local ou de la plateforme de bioimagerie. Les étapes 6.1 à 6.13 sont effectuées sur un microscope confocal à balayage laser.

  1. Allumez le microscope et assurez-vous que les sources lumineuses (lasers) sont réchauffées. Ouvrez le logiciel d’acquisition de bioimagerie.
  2. Sélectionnez les longueurs d’onde d’excitation laser correspondant aux fluorophores pour créer les canaux (par exemple, 405 nm pour la coloration nucléaire, 488 nm pour les glycanes sialylés marqués AF488Alk et 546 nm pour le marquage par immunofluorescence). Activez les lasers en conséquence.
  3. Placez et fixez une lamelle de 32 mm de diamètre (130-170 μm d’épaisseur) dans un support adapté au microscope.
  4. Placer l’échantillon préparé à l’étape 5.3.9, cellules vers le bas, sur la lamelle de 32 mm. Ajoutez une goutte d’eau déminéralisée pour éviter que l’échantillon ne se dessèche.
  5. Sélectionnez un objectif approprié, ici un objectif à immersion dans l’huile 63x avec une ouverture numérique de 1,4 ou équivalent.
    REMARQUE : L’ouverture numérique la plus élevée offre la meilleure résolution. Lorsque vous utilisez un objectif à immersion dans l’huile, n’oubliez pas d’ajouter une goutte d’huile entre l’objectif et la lamelle.
  6. Placez le support sur la platine du microscope au-dessus de l’objectif.
  7. Utilisez le mode de fluorescence en fond clair ou à faible intensité laser pour localiser une zone d’intérêt dans l’échantillon.
  8. Définissez le focus.
  9. Visualisez les cellules du logiciel en mode fluorescence en direct . Réglez l’intensité du laser pour chaque canal. Commencez avec une faible puissance laser pour éviter le photoblanchiment. Augmentez lentement la puissance du laser et ajustez le gain et le décalage du détecteur pour amplifier le signal sans introduire de bruit excessif au besoin pour visualiser clairement la fluorescence sans surexposition.
    REMARQUE : Les paramètres doivent être ajustés pour minimiser à la fois le bruit de fond et éviter la saturation du signal. Il est crucial de maintenir des paramètres cohérents sur tous les échantillons dans une série d’expériences, y compris les contrôles négatifs.
  10. Définissez les paramètres de l’image tels que la taille du sténopé (par exemple, 1 unité Airy), la vitesse de balayage (par exemple, 8), le facteur de zoom (par exemple, 1), la plage de valeurs de luminosité ( par exemple, 16 bits) et le nombre de moyennes (par exemple, 2), le mode (par exemple, ligne) et la méthode (par exemple, moyenne) selon les besoins pour atteindre l’observation souhaitée.
    REMARQUE : Ces valeurs dépendent du système et de l’échantillon et doivent être optimisées avant l’acquisition. La taille du sténopé dépend de l’ouverture numérique, du grossissement et de la longueur d’onde : sa diminution peut améliorer la résolution au détriment du rapport signal/bruit. Il est conseillé de régler la vitesse de numérisation sur des valeurs rapides (correspondant à un petit temps de séjour par pixel) pour éviter le photoblanchiment.
  11. Effectuez l’acquisition et enregistrez les données dans le format souhaité avec les métadonnées appropriées pour référence future.
  12. Une fois l’acquisition terminée, remettez l’échantillon dans la plaque à 6 puits en ajoutant une petite quantité d’eau déminéralisée pour faciliter le transfert à l’aide d’une pince à épiler.
    REMARQUE : L’étape 6.12 n’est effectuée que si l’expansion de cet échantillon particulier est nécessaire. Sinon, jetez l’échantillon et utilisez d’autres répétitions pour les étapes suivantes.

7. Protocole de microscopie à expansion

REMARQUE : Les échantillons sont protégés autant que possible de la lumière pour éviter le photoblanchiment. Les étapes d’ancrage et de gélification s’effectuent sous une hotte.

  1. Ancrage
    1. Incuber les échantillons avec du N-acryloylsuccinimide (NAS) à une concentration de 3,2 mg/mL dans du PBS sur un agitateur mécanique pendant 1 h à température ambiante. Préparer une quantité suffisante de solution pour ajouter 500 μL de solution par puits (solution mère : 16 mg/mL de NAS dans le DMSO).
      REMARQUE : Les NAS réagissent avec les résidus de lysine et les N-terminus des protéines pour greffer un groupe acryloyle, ce qui permet aux protéines de s’ancrer à l’hydrogel lors des étapes suivantes.
    2. Laver 3 fois avec 1 ml de PBS.
  2. Gélification
    1. Préparez une solution monomère composée comme suit : dans 50 mL de 1x PBS (pH 7,4), ajoutez 5,843 g de NaCl, 1,25 g d’acrylamide, 0,075 g de bis-acrylamide et 4,313 g d’acrylate de sodium. Préparez suffisamment de solution pour appliquer 70 μL sur chaque lamelle. Congeler 1 mL d’aliquotes au moins 24 h avant la gélification.
      ATTENTION : Les monomères sont toxiques ; Ils doivent être manipulés avec précaution à l’aide d’un équipement de protection approprié et pesés sous une hotte.
    2. Sur un morceau de parafilm, une goutte de 70 μL de solution de monomère est placée, suivie de l’ajout de 1,4 μL de N,N,N′,N′-tétraméthyléthylènediamine (TMEDA), puis de 1,4 μL de persulfate d’ammonium à 10 % (p/v), qui sont mélangés à la goutte.
      REMARQUE : Les réactifs de réticulation doivent être ajoutés dans cet ordre spécifique, TMEDA d’abord, puis APS.
    3. Rapidement, placez soigneusement la lamelle sur la solution, les cellules vers le bas.
    4. Laisser la solution polymériser pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humide.
  3. Digestion
    1. Préparez une solution tampon de digestion composée de 1 tampon TAE, de 0,5 % (v/v) de Triton X-100, de 0,8 M de chlorhydrate de guanidine et de 8 U/mL de protéinase K.
      REMARQUE : Le tampon de digestion doit être fraîchement préparé et pré-incubé pendant 30 min à 37 °C avant utilisation.
    2. Ajouter 1 mL de tampon de digestion à l’hydrogel formé à l’étape 7.2. Laisser la digestion se poursuivre pendant 3 h à 37 °C sur un agitateur mécanique.
    3. Retirez le tampon de digestion et lavez doucement le gel 3x avec 2 mL d’eau déminéralisée.
      REMARQUE : L’hydrogel se dilatera légèrement et se détachera de la lamelle.
  4. Expansion
    1. Laisser l’hydrogel se dilater dans 3 mL d’eau déminéralisée pendant 2 h. Changez l’eau toutes les 30 min.

8. Imagerie post-expansion des échantillons

  1. Placez une lamelle de 32 mm de diamètre (130-170 μm d’épaisseur) et fixez-la sur un support.
  2. Découpez un morceau de l’hydrogel et placez-le sur la lamelle, avec les cellules au bas du gel.
    REMARQUE : Les morceaux excisés doivent être suffisamment grands pour offrir une surface d’observation adéquate, mais pas trop grands, car cela pourrait rendre la manipulation du gel difficile et augmenter le risque de casse (taille recommandée : 5 à 8 mm). Placez suffisamment de morceaux d’hydrogel pour couvrir toute la surface de la lamelle ; Cela aidera à fixer les pièces en place et à prévenir toute dérive pendant l’imagerie. En cas de problèmes de dérive, il peut s’avérer avantageux de pré-enduire les lamelles avec de la poly-D-lysine6.
  3. Placez le support sur la platine du microscope au-dessus de l’objectif.
  4. Effectuez l’acquisition d’image sur un microscope confocal à balayage laser avec un objectif à immersion dans l’huile comme décrit à l’étape 6.

9. Calcul du facteur d’expansion (EF) dans ImageJ

  1. Ouvrez les données d’imagerie dans le logiciel gratuit ImageJ ou équivalent.
  2. Si vous travaillez sur l’image de plusieurs canaux, divisez les canaux et travaillez uniquement sur le canal du noyau en accédant à Sélectionner l’image | Couleur | Canaux partagés.
  3. Pour mesurer le diamètre du noyau, mettez en surbrillance le signal correspondant au noyau en déterminant un seuil en cliquant sur Sélectionner une image | Ajuster | Seuil.... Choisissez une méthode dans le menu déroulant par défaut qui s’adapte le mieux à l’image (par exemple, Otsu) et ajustez le seuil jusqu’à ce que la forme du noyau soit clairement découpée de l’arrière-plan.
    REMARQUE : Le réglage du seuil doit être ajusté pour chaque image, car un paramètre peut ne pas convenir à toutes les images ou à tous les échantillons.
  4. Réglez la mesure pour déterminer le diamètre de Feret en cliquant sur Sélectionner analyser | Définir les mesures.... Dans le menu, sélectionnez Diamètre de Feret et ajustez la décimale si nécessaire.
  5. Pour commencer l’analyse de l’image, cliquez sur Sélectionner Analyser | Analyser les particules pour définir la taille des particules ; Pour le noyau, choisissez 5-Infinity μm² | Afficher les résultats | Ajouter au manager | Exclure sur les bords et la superposition. Lancez l’analyse.
  6. Au début de l’analyse, plusieurs fenêtres apparaissent. Dans les résultats de la fenêtre, recherchez le diamètre maximal de Feret de chaque noyau de la colonne Feret. Copiez-collez les données brutes dans une feuille de calcul et calculez la taille moyenne du noyau pour les échantillons préexpansés et expansés .
    REMARQUE : Assurez-vous que les régions d’intérêt (ROI) correspondant à chaque noyau suivent toute la périphérie du noyau.
  7. Calculez le facteur de dilatation (FE) comme suit :
    EF = figure-protocol-1
    REMARQUE : Le facteur EF détermine le degré d’expansion de l’échantillon.

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Résultats

L’application du protocole pour visualiser les glycoprotéines sialylées dans les cellules HeLa (Figure 3A) et les cellules MCF7 (Figure 3B), en omettant le traitement CQ (section 2 du protocole) et la coloration de co-localisation par immunofluorescence (étape 5.3 du protocole).

figure-results-1
Figure 3...

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Discussion

Le protocole actuel de marquage CuAAC n’inclut pas l’aminoguanidine dans le tampon de réaction. Puisqu’il vise à visualiser les glycoconjugués intracellulaires, il est réalisé sur des cellules qui sont fixées après l’étape d’incorporation métabolique, afin d’éviter tout problème de cytotoxicité et d’améliorer l’absorption du système catalytique. L’utilisation de l’aminoguanidine est généralement recommandée pour le marquage de la surface cellulaire des cellules vivantes afin de prévenir les réactions secondaires entre le...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions les installations de TisBio et la plateforme PLBS d’avoir fourni l’environnement technique propice à la réalisation de ces travaux. Ces travaux ont été soutenus par des subventions du CNRS et du ministère de l’Enseignement supérieur et de la Recherche. Nous tenons à remercier le Dr François Foulquier, le Dr Zoé Durin, Mme Dorothée Vicogne et Mme Céline Schulz pour les discussions stimulantes et pour nous avoir fourni la lignée cellulaire Fibroblast 533T et l’anticorps primaire GM130.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
(+) L-ascorbate de sodiumSigma Aldrich11140
Plaque de culture cellulaire à 12 puitsCorning3513
AcrylamideSigma AldrichA8887
Acide acrylique N-hydroxysuccinimide ester  ;Sigma AldrichA8060
Alexa Fluor 488 alcyne  ;Jena BioscienceCLK-1277-5
Alexa Fluor 546 chèvre anti-souris IgGInvitrogenA11003
Persulfate d’ammoniumSigma Aldrich9913
Bis-AcrylamideSigma Aldrich146072
BSASigma AldrichA7906
BTTAAJena BioscienceCLK-067-100
Tube de centrifugation 2 mLEPPENDORF30120094
Sel de diphosphate de chloroquineSigma AldrichC6628
Tube conique 15 mLFalcon352097
lamelles 12 mm #1eprediaCB00120RA120MNZ0
lamelles 32 mm #1eprediaCB00320RA140MNZ0
CuSO4Sigma Aldrich209198
DMEM milieu à haute teneur en glucose  ;DutscherL0104-500
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS)  ;DutscherL0615-500
Sérum de veau fœtalbiowestS1810-500
Fibroblaste 533T--Recueilli sur un individu sain
FIJI ImageJ 2.9.0--
GélatineBio-RAD170-6537
Guanidine HClSigma Aldrich50950
Cellules HeLaATCCCCL-2
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Imaris 10.2--
K2HPO4EuromedexPB0447-BMicroscopie confocale anhydre
LSM 780  ;Zeiss-MCF7
ATCCHTB-22
N-acétylmannosamine (ManNAc)BIOSYNTHMA05269
NaClCarlo Erba479687
N-azidoacetylmannosamine (ManNAz)BIOSYNTHMA46002
Objectif « Plan-Apochromat » 63x/1,4 Huile DIC M27Zeiss420782-9900-799  ;
Saline tamponnée au phosphate (PBS) 10xEuromedexET330
Proteinase KSigma AldrichP2308à partir de  ; Tritirachium album
souris purifiée GM130 anticorpsBD Bioscience61082250 µ ; g
Acrylate de sodium  ;Sigma Aldrich408220
T75 FlaconCorning430641
TEMEDSigma AldrichT9281
tris Acétate EDTA (TAE) 10xEuromedexEU0202-B
Triton X-100Sigma AldrichX-100
Trypan BleuDutscher702630
Trypsine-EDTA 1xDutscherN° L0930-100

Références

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  11. Ferreira, J. A., et al. Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics. Cancer Lett. 387, 32-45 (2017).
  12. Jennings, M. P., Day, C. J., Atack, J. M. How bacteria utilize sialic acid during interactions with the host: snip, snatch, dispatch, match and attach. Microbiology. 168 (3), 001157(2022).
  13. Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
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  15. Gilormini, P. A., et al. Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells. J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).
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