Systèmes de modèles de tissus organotypiques pour l’étude in vitro des interactions hôte-pathogène

Résumé

Le présent protocole décrit l’application de modèles tissulaires organotypiques pour étudier in vitro les interactions hôte-pathogène. Plus précisément, le système modèle décrit utilise un épithélium buccal multicouche exposé à des micro-organismes associés à des biofilms (plaque dentaire) dans le contexte de la santé buccodentaire par rapport à la maladie.

Résumé

La récapitulation de l’interface hôte-pathogène au niveau de la barrière épithéliale ou muqueuse in vitro reste une perspective difficile pour les biologistes des infections. Alors que les monocouches épithéliales 2D cultivées en interne ne sont pas représentatives de la situation in vivo , les modèles de tissus disponibles dans le commerce sont souvent négligés en raison de leur coût et de leur praticité. Cependant, avec une planification minutieuse, ces modèles fournissent des plates-formes reproductibles pour un large éventail d’applications différentes. Ici, nous rapportons l’utilisation de modèles épithéliaux qui peuvent être utilisés à des fins expérimentales très variées pour étudier les interactions hôte-pathogène dans diverses niches écologiques, telles que la cavité buccale, la peau et la muqueuse vaginale. Qu’il s’agisse de simples cellules planctoniques ou de co-cultures complexes de biofilms, des modèles épithéliales sont utilisés pour évaluer l’adhérence et l’invasion microbiennes, et pour évaluer la réponse de l’hôte au niveau transcriptionnel et/ou protéique, avec la possibilité d’un profilage plus détaillé à l’aide de différentes approches omiques. De plus, ces systèmes biologiques peuvent être utilisés comme bancs d’essai plus précis pour évaluer l’activité antimicrobienne conventionnelle et nouvelle dans un microenvironnement complexe hôte-pathogène in vitro. Les protocoles décrits dans le présent document documentent la façon dont les modèles sont manipulés à leur arrivée et préparés en laboratoire pour la stimulation en co-culture avec les communautés de biofilms. Les méthodes détaillent comment les résultats expérimentaux sont obtenus à partir des systèmes modèles, y compris le traitement des tissus, la configuration de la co-culture et la génération de données. Ces expériences comprennent l’expression des gènes de l’hôte par le biais d’analyses qPCR simples et multiplexes et la détection des protéines inflammatoires à l’aide d’ELISA. En conclusion, les modèles épithéliaux fournissent des systèmes in vitro utiles pour les études précliniques sur les interactions hôte-pathogène simples ou complexes.

Introduction

Les systèmes modèles in vitro offrent d’excellents bancs d’essai pour étudier les interactions hôte-pathogène. Ces systèmes organotypiques visent à récapituler le microenvironnement de différentes niches écologiques sujettes à des perturbations microbiennes. Un certain nombre d’articles de recherche ont été publiés à l’aide de modèles tissulaires EpiSkin (anciennement SkinEthic) pour évaluer les interactions hôte-pathogène dans la cavité buccale 1,2,3,4,5, la barrière cutanée ^{6,7,8,9,10,11} et la muqueuse vaginale ^5,12,13, entre autres^14,15. Contrairement à la culture cellulaire « bidimensionnelle » ou « 2D », qui repose sur l’utilisation de monocouches de lignées cellulaires épithéliales exposées à des micro-organismes, ces modèles disponibles dans le commerce sont constitués de plusieurs couches de cellules différenciées cultivées à une interface air-liquide. Bien qu’ils soient moins chers et souvent considérés comme plus reproductibles, les systèmes de culture 2D sont sujets à des dommages cellulaires lorsqu’ils sont cultivés avec des micro-organismes, ce qui ne représente pas toujours avec précision les barrières épithéliales ou muqueuses in vivo^16,17.

Des preuves récentes démontrent que les techniques de culture « tridimensionnelles » ou « 3D » deviennent de plus en plus populaires dans diverses disciplines scientifiques, notamment les sciences du cancer, la recherche sur les cellules souches et la découverte de médicaments^16,18. Dans le contexte de la biologie des infections, les modèles tissulaires 3D peuvent être utilisés pour étudier les interactions hôte-bactérie, fongique ou d’espèces mixtes à l’interface de la barrière épithéliale ou muqueuse au sein d’un microenvironnement contrôlé in vitro. Ces modèles présentent de nombreux avantages pour les systèmes de culture 2D, permettant d’évaluer la colonisation tissulaire et/ou l’invasion par des organismes pathogènes ou des communautés de biofilms complexes¹⁷, et d’évaluer les réponses de l’hôte à un niveau multi-composants pour différents biomarqueurs où les modèles 2D sont parfois limités par leurs profils transcriptionnels ou protéomiques 16,17,18. En fin de compte, les applications précliniques de ces systèmes 3D sont vastes, fournissant des données exploratoires importantes qui peuvent être utilisées dans des modèles in vivo ou des études cliniques.

Dans le contexte de la santé et des maladies bucco-dentaires, il est important pour les cliniciens de comprendre les voies inflammatoires impliquées à la surface de la muqueuse buccale, car cela peut orienter les modalités de traitement. Des études antérieures ont montré que les biofilms « associés à la santé » peuvent provoquer des réponses inflammatoires minimes 3,19,20,21. Cela peut résulter d’une charge microbienne plus faible associée à la santé bucco-dentaire ou de la composition du biofilm avec Streptococcus spp., largement considéré comme immunomodulateur ^22,23. D’autre part, les biofilms composés de micro-organismes associés à des maladies tels que Fusobacterium nucleatum et Porphyromonas gingivalis sont de nature pro-inflammatoire 3,20,24,25,26,27. Une revue réalisée par Mountcastle et al. en 2020 a décrit tous les modèles de co-culture pertinents qui existaient à l’époque pour le microenvironnement buccal¹⁷. Bien que ces modèles organotypiques soient nombreux, avec plusieurs produits depuis^28,29, il reste un certain nombre d’obstacles difficiles associés à la création de tels modèles 3D. Pour n’en nommer que quelques-uns, ces modèles nécessitent une optimisation significative et sont très gourmands en main-d’œuvre et en ressources ; La reproductibilité peut également être très variable à moins d’être soigneusement contrôlée^16,17. Les modèles disponibles dans le commerce contournent ces problèmes, en fournissant des plates-formes pour étudier les interactions hôte-pathogène dans la cavité buccale et dans d’autres niches écologiques du corps humain.

En résumé, le protocole actuel vise à décrire l’application de modèles de tissus organotypiques pour étudier les interactions hôte-pathogène in vitro dans le contexte de la santé buccodentaire et des maladies. Plus précisément, le système modèle décrit utilise un épithélium buccal multicouche disponible dans le commerce, exposé à une communauté de biofilm définie représentative de la maladie inflammatoire buccale, la gingivite.

Protocole

Le protocole suivant implique la préparation d’un biofilm multi-espèces représentatif de la gingivite, contenant un total de 7 espèces (spp.)^7,30. Trois Streptococcus spp., Streptococcus mitis (NCTC 12261), Streptococcus intermedius (DSM 20753) et Streptococcus oralis (NTCC 11427) sont inclus pour imiter la santé bucco-dentaire, agissant comme des colonisateurs initiaux de la pellicule salivaire. Quatre microorganismes anaérobies associés au passage de la santé buccodentaire à la maladie sont ensuite ajoutés : Veillonella dispar (NCTC 11831), Actinomyces naeslundii (DSM 17233) et deux Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) et Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii (DSM 19507). Toutes les étapes impliquées sont effectuées de manière aseptique, soit à la flamme, soit dans une enceinte de sécurité de classe II. Tous les milieux et les solutions salines tamponnées au phosphate (PBS) utilisés pour les préparations microbiologiques sont autoclavés avant d’être utilisés, et la stérilité est évaluée à intervalles réguliers au cours du protocole. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des communautés microbiennes pour la co-culture

REMARQUE : Ce protocole décrit la génération d’un biofilm multi-espèces représentatif de consortiums associés à une inflammation du tissu gingivite, également connue sous le nom de gingivite. Un tel modèle a été utilisé pour l’évaluation de la réponse de l’hôte en matière de santé buccodentaire et de maladie, comme décrit précédemment³.

1. Réanimer les trois espèces de Streptococcus sur des plaques de gélose au sang (base de gélose Columbia Blood contenant 5 % de sang de cheval défibriné stérile) à partir de stocks congelés de billes poreuses (obtenues dans le commerce) contenant les micro-organismes stockés à -80 ^°C. Ceci est réalisé en utilisant une boucle d’inoculation et la technique de la plaque striée.
   1. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO₂, puis isoler 3 à 4 colonies pour la propagation dans 10 mL de milieu de bouillon de soja tryptone. Cultiver les bouillons pendant 16-18 h à 37 °C, 5 % CO₂.
2. Pour les agents pathogènes intermédiaires, réactiver V. dispar, A. naeslundii, F. nucleatum et F. nucleatum subspp. vincentii en anaérobie sur une base de gélose anaérobie exigeante contenant 5 % de sang de cheval défibriné stérile pendant 48 h à 37 °C, avant la culture dans le bouillon de Schaedler pendant 24 à 48 h supplémentaires dans les mêmes conditions.
3. Après la croissance, les suspensions cellulaires de granulés sont centrifugées pendant 5 min, à 20 °C à 3000 x g, puis laveront les granulés dans 10 mL de PBS stérile (pH 7,2-7,6). Suspension des cellules de granulés par centrifugation pendant 5 min, 20 °C à 3000 x g, puis répétez les étapes de lavage une deuxième fois. Remettre en suspension les cellules lavées dans 10 mL de PBS stérile pour la normalisation.
4. Normaliser les trois espèces de Streptococcus individuellement à l’aide d’un spectrophotomètre à 550 nm. Des valeurs d’absorbance de 0,50 (plage de 0,45 à 0,55 acceptable) indiquent une numération cellulaire de ~1 x 10⁸ cellules/mL, telle que déterminée précédemment à l’aide de la technique de numération cellulaire de Miles et Misra³¹. Pour obtenir cette lecture d’absorbance, diluez davantage 10 mL de suspensions de cellules lavées dans du PBS stérile.
5. Après la normalisation, diluer tous les Streptococcus spp. 1:10 à 1 x 10⁷ cellules/mL dans un mélange 1:1 de bouillon Todd Hewitt (THB) et de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Ajouter 500 μL de suspensions cellulaires par pipetage sur une plaque de culture tissulaire de microtitration à 24 puits contenant un disque d’hydroxyapatite de 13 mm de diamètre. Laisser mûrir les biofilms pendant 24 h à 37 °C, 5 % CO₂.
   REMARQUE : Les biofilms multi-espèces peuvent être cultivés sur différents substrats pertinents pour la bouche tels que l’émail, la dentine³² et les surfaces prothétiques en poly(méthacrylate de méthyle)^33,34. Des milieux alternatifs peuvent également être utilisés pour ces modèles, tels que la salive artificielle ou synthétique, bien qu’une attention particulière doive être prise en fonction des consortiums de micro-organismes utilisés : des études ont montré que la sélection du milieu de croissance a des implications importantes pour la croissance du biofilm des communautés mixtes^35,36.
6. Le lendemain, normalisez les quatre micro-organismes anaérobies de la même manière que ci-dessus (étapes 1.2-1.4). Laver deux fois les suspensions de cellules de granulés, puis normaliser V. dispar à une absorbance de 0,50 (plage de 0,45 à 0,55) et les trois micro-organismes restants à une absorbance de 0,20 (plage de 0,18 à 0,22). Une fois normalisées, diluer davantage toutes les suspensions de 1:10 à 1 x 10⁷ cellules/mL dans un mélange 1:1 de THB et de RPMI.
7. Retirez soigneusement les cellules non adhérentes et les milieux usagés et jetez-les des biofilms de streptocoques par pipetage. Remplacer les puits de plaque de microtitration par 500 μL de suspensions normalisées de 1 x 10⁷ cellules/mL des quatre anaérobies. Cultiver des biofilms pendant 24 h dans des conditions anaérobies à 37 °C.
8. Après 24 h, retirer les cellules non collées et les milieux usés des biofilms de 7 espèces et les remplacer par 500 μL de mélange stérile 1:1 de milieu THB :RPMI. Les biofilms sont laissés à maturation anaérobie à 37 °C pendant 4 jours, les milieux étant retirés et réapprovisionnés quotidiennement (quatre changements de milieux au total).
9. Le 7e jour, le biofilm multi-espèces est complètement mature et prêt pour les expériences en aval. Laver deux fois les biofilms avec 500 μL de PBS stérile pour une utilisation en co-culture.
   REMARQUE : Les biofilms peuvent être profilés à l’aide d’une gamme de méthodologies biologiques telles que la qPCR (pour l’évaluation de la composition) et le profilage microscopique avec microscopie confocale ou électronique, comme décrit précédemment³.

2. Manipulation des tissus organotypiques et dispositif expérimental

REMARQUE : Le dispositif expérimental décrit ci-dessous implique un tissu d’épithélium oral humain (HOE) composé de cellules TR146 cultivées sur un filtre à membrane en polycarbonate inerte. D’autres modèles existent, notamment des modèles d’épiderme, d’épithélium vésiculaire, œsophagien, cornéen, gingival et vaginal. Tous les modèles sont manipulés et préparés d’une manière similaire à celle décrite ci-dessous pour étudier les interactions hôte-pathogène.

1. À l’arrivée, déballez et transférez les mouchoirs et les supports HOE dans une enceinte de sécurité de classe II. Ajouter un total de 1 mL de milieu d’entretien fourni avec le mouchoir dans des plaques à 12 puits.
2. Retirez les inserts en polycarbonate contenant la HOE avec une pince à épiler stérile des plaques à 24 puits et de la gélose nutritive utilisée pour l’expédition et transférez-les sur les plaques à 12 puits contenant le milieu, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne reste sous le tissu. Assurez-vous que tout excès de gélose fixé sur les côtés ou au bas des inserts est soigneusement retiré à l’aide d’une pince à épiler supplémentaire ou de papier de soie.
3. Incuber des modèles de tissus pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO₂ avant la configuration expérimentale pour s’acclimater aux conditions de laboratoire après l’expédition. Il convient de noter que des milieux d’entretien ou de croissance supplémentaires sont disponibles pour un entretien plus long ou une maturation ultérieure des modèles tissulaires.
4. Des expériences de co-culture peuvent maintenant être menées. Pour l’exemple fourni ici, retirez les biofilms de 7 espèces créés comme ci-dessus (étapes 1.1-1.9) de leurs substrats par sonication. Pour ce faire, retirez les disques d’AH contenant des biofilms du fond des plaques de 24 puits à l’aide d’une aiguille de 19 G et d’une pince à épiler, puis transférez un bijou contenant 1 mL de PBS Dulbecco stérile. Sonicate à 35 kHz pendant 10 min dans un bain d’eau de sonication.
5. Retirez avec précaution les inserts contenant les modèles de tissus à l’aide d’une pince à épiler de l’acclimatation pendant la nuit, et ajoutez 100 μL de suspension de sonicate de biofilm directement sur le tissu par pipetage. Utilisez des tissus témoins non stimulés à des fins de comparaison. Pour ces inserts de tissu de contrôle, ajoutez 100 μL de PBS stérile de Dulbecco sans la suspension du biofilm.
   REMARQUE : Des cellules planctoniques, des surnageants de biofilm usagés contenant des cellules dispersées ou des biofilms entiers peuvent être utilisés pour le modèle de co-culture à la place du sonicate de biofilm. Différentes applications de ces modèles hôte-pathogène utilisant différents stimulants microbiens sont schématisées dans la figure 1, comme documenté ailleurs 3,5,6,8,13,37,38.
6. Après l’ajout, transférez les inserts sur une autre plaque à 12 puits contenant 1 mL de milieu d’entretien frais, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air sous les inserts. Incuber des plaques contenant des modèles de tissus pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO₂ avant le traitement des tissus pour les applications en aval.
   REMARQUE : Les fournisseurs de tissus peuvent fournir des milieux supplémentaires pour soutenir la culture continue des tissus après une exposition à des agrégats soniqués ou à des biofilms. À cette fin, plusieurs modèles antérieurs portant sur l’inoculation prolongée d’un biofilm tissulaire ont été publiés 21,28,39. Pour obtenir des résultats similaires en utilisant le modèle organotypique actuel, sonicez le tissu (comme ci-dessus, étape 2.6) et laissez les micro-organismes se fixer pendant 24 h. Jeter toute suspension microbienne restante et poursuivre la culture à l’interface air-liquide pendant la durée expérimentale requise.

3. Traitement des tissus pour les résultats expérimentaux

REMARQUE : Après la co-culture, des modèles de tissus sont traités pour des résultats expérimentaux. Les étapes suivantes documentent comment l’ARN est extrait du tissu pour le profilage transcriptionnel et comment les milieux tissulaires usagés sont utilisés pour la détection des protéines. Le tissu peut également être fixé dans du formol, du paraformaldéhyde ou un fixateur similaire pour l’évaluation histologique, comme décrit précédemment ^3,6.

1. Tout d’abord, préparez 350 μL de tampon de lyse RLT dans des tubes à joint torique à bouchon à vis de 2,0 ml contenant 1 % de β-mercaptoéthanol et ~100 μL d’équivalent de billes de verre lavées à l’acide de 0,5 mm.
2. Retirez les inserts contenant le tissu du support à l’aide d’une pince à épiler et jetez toute suspension microbienne restante de l’insert. Ensuite, tenez, inversé, au niveau des yeux pour plus de facilité. À l’aide d’une aiguille de 19 G, coupez soigneusement le tissu et la membrane du bas de l’insert et transférez-les dans le tampon RLT.
   1. Homogénéiser le tissu à 30 s à l’aide d’un homogénéisateur de batteur à billes de paillasse, puis extraire l’ARN du lysat en suivant les instructions du fabricant de la trousse d’extraction d’ARN (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : L’ARN extrait est utilisé pour la synthèse de l’ADNc afin de profiler l’expression des gènes des cytokines et des chimiokines en tant que marqueurs de l’inflammation à l’aide de la PCR quantitative (qPCR) ou du séquençage de l’ARN. La qPCR est réalisée à l’aide de réseaux multiplexes tels que le réseau de profileurs de PCR RT₂ contenant des puits avec des amorces prêtes à l’emploi pour des gènes spécifiques, ou le réactif à base de SYBR green avec des séquences d’amorces conçues en interne et des ddH₂O³ sans nucléases.
3. Prélever les milieux tissulaires usagés restants (~850-900 μL) pour des analyses protéomiques à l’aide de méthodologies à faible et à haut débit telles que les ELISA, les immunoessais multiplex ou l’analyse multiplex des biomarqueurs protéiques⁷.
4. À l’aide des milieux tissulaires usagés, évaluez une gamme de marqueurs associés à l’inflammation au niveau des protéines. Les supports usagés peuvent être utilisés directement pour les méthodologies ci-dessus (étape 3.3) ou stockés à -20 °C ou -80 °C. Évitez plusieurs cycles de gel-dégel du milieu pour de telles analyses.
   REMARQUE : Le milieu peut avoir besoin d’être dilué 1:10 en fonction du stimulant tissulaire pour un profilage protéomique précis à l’aide d’ELISA.

Résultats

Dans cette expérience, HOE a été exposé à 7 espèces de biofilm contenant du sonicate, organisme représentatif du passage de la santé bucco-dentaire à l’inflammation des gencives (connue sous le nom de gingivite). Cette maladie résulte d’une inflammation du tissu épithélial gingival ou buccal due à des perturbations microbiennes dues à l’accumulation de plaque dentaire à la surface de la dent. Après la stimulation, les tissus et les milieux usagés sont utilisés pour les analyses transcriptionnelles et protéomiques, comme indiqué ci-dessus. Pour cette expérience, l’expression génique d’un panel de biomarqueurs inflammatoires a été détectée dans le tissu post-stimulation avec du biofilm sonicate (Figure 2). Cela a été réalisé en utilisant un réseau de profileurs PCR RT₂ sur mesure contenant 16 gènes différents, et l’expression génique a été démontrée comme un changement de pli par rapport au tissu non stimulé après normalisation au gène d’entretien GAPDH. La stimulation microbienne a augmenté l’expression de tous les gènes à l’exception de CXCL5, avec des différences statistiques observées pour NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF1A, IL1B et TLR4 (Figure 2A). Le changement de pliage le plus important a été observé pour CCL2, CXCL1 et CSF3, avec des augmentations de 16,9, 10,3 et 15,1, respectivement (figure 2B).

Des milieux HOE usagés ont été utilisés pour des analyses protéomiques afin de détecter les protéines produites et libérées par le tissu après stimulation. Ceci est utile pour déterminer si l’expression des gènes est corrélée à la production de protéines. Pour ce faire, l’expression du gène IL8 et la libération de la protéine IL-8 ont été évaluées dans des tissus témoins et des tissus stimulés par le biofilm-sonicate (Figure 3). L’expression génique a été évaluée à l’aide de la qPCR basée sur SYBR-green avec des amorces pour l’IL8 et le GAPDH, comme décrit précédemment³. L’expression de l’ARNm IL8 dans HOE a été multipliée par 8,67 après stimulation avec du sonicate de biofilm (Figure 3A). Au niveau des protéines, les niveaux d’IL-8 ont été quantifiés à l’aide d’un kit ELISA d’IL-8. La concentration d’IL-8 dans les milieux usés a été augmentée, passant de ~1,005 ng/mL dans le tissu témoin à ~4,245 ng/mL dans le tissu stimulé par le biofilm-sonicate (figure 3B).

Figure 1 : Différentes applications des modèles de co-culture de tissus organotypiques. Des suspensions normalisées de micro-organismes sont appliquées directement sur le tissu pour étudier les interactions espèces-hôtes (A). Ceux-ci sont souvent utilisés pour évaluer la colonisation microbienne sur une courte période de temps (p. ex., <24 h). Des biofilms complexes sont soniqués pour étudier les effets des cellules dispersées ou des agrégats de biofilms sur les tissus (B). Ceci est important car il a déjà été démontré que ces cellules ont des phénotypes uniques par rapport à leurs homologues planctoniques ou à biofilm ; à cette fin, des biofilms intacts peuvent être ajoutés directement aux tissus à l’aide d’inserts supplémentaires plus petits pour créer une exposition adjacente avec l’hôte (C). Enfin, des cellules planctoniques sont ajoutées aux tissus dans des milieux de culture appropriés pour évaluer la colonisation microbienne, la formation de biofilms et la dynamique de croissance sur le tissu (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Expression génique du tissu HOE après stimulation avec du biofilm sonicate de 7 espèces. Changement de pli d’expression de l’ARNm d’un total de 15 gènes inflammatoires normalisés au gène d’entretien, GAPDH, dans des échantillons de tissu HOE contrôlés, non stimulés et exposés à 100 μL de sonicate de biofilm de 7 espèces (A). Les trois gènes (CCL2, CXCL1, CSF3) présentant les changements les plus élevés dans l’expression de l’ARNm sont représentés en (B). Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’un test T paramétrique non apparié, les changements significatifs étant *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001, respectivement. Les données ont été tracées et analysées à l’aide de logiciels statistiques et graphiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Expression du gène IL8 et niveaux de protéine IL-8 produits par le tissu HOE. Changement du repliement de l’expression de l’ARNm de l’IL8 dans le tissu HOE, déterminé par qPCR (A) basé sur SYBR-green et les niveaux de protéine IL-8 quantifiés à partir de milieux tissulaires usagés à l’aide de la méthodologie ELISA (B). Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’un test T paramétrique non apparié, les changements significatifs étant *p < 0,05 et ****p < 0,0001, respectivement. Les données ont été tracées et analysées à l’aide de logiciels statistiques et graphiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ici, des méthodologies sont décrites pour produire un modèle complexe de biofilm multi-espèces représentatif de la gingivite pour la co-culture avec du tissu HOE afin d’évaluer la réponse de l’hôte après une stimulation microbienne. Ce protocole peut être adapté pour être utilisé dans l’étude des interactions hôte-pathogène entre les cellules planctoniques, les biofilms d’espèces uniques, doubles ou mixtes, ou les cellules dispersées par biofilm avec du tissu épithélial provenant de différentes niches écologiques du corps humain. L’utilisation de modèles tissulaires pour étudier les interactions hôte-pathogène constitue une avancée importante par rapport aux systèmes de co-culture précédents qui sont limités à des monocouches 2D qui ne récapitulent pas toujours vraiment la situation in vivo, où le tissu épithélial contient plusieurs couches cellulaires 16,17,18. De plus, les défis associés à la croissance in vitro de modèles de tissus multicouches sont nombreux, avec l’utilisation de plusieurs lignées cellulaires et/ou la croissance de couches cellulaires à une interface air-liquide sujette à la contamination. Les tissus disponibles dans le commerce fournissent une plate-forme reproductible avec des modèles de haute qualité constante qui sont comparables entre les répétitions et les lots, comme le montrent les publications précédentes ^3,7.

Pour la section « Préparation des communautés microbiennes pour la co-culture », l’inclusion de ces microorganismes dans le modèle de gingivite à 7 espèces a été choisie en fonction des commensaux et des agents pathogènes couramment identifiés associés au passage de la santé buccodentaire à la maladie. Comme pour tous les systèmes de modèles de biofilms complexes in vitro, l’inclusion de micro-organismes est dirigée par des études de microbiome relatives à la niche écologique saine ou malade particulière. À cette fin, nous et d’autres avons signalé l’utilisation d’un modèle de biofilm associé à la santé buccodentaire contenant des micro-organismes commensales (p. ex., Streptococcus et Rothia spp.)^{3, 40, 41}. De plus, d’autres agents pathogènes peuvent être ajoutés à ces modèles pour créer des biofilms associés à d’autres maladies. Par exemple, trois micro-organismes peuvent être ajoutés aux 7 espèces décrites ici pour créer un modèle de maladie associé à la parodontite³, tandis que l’agent pathogène fongique Candida albicans peut être ajouté pour augmenter la polymicrobialité ainsi que pour ajouter une couche de complexité interrègne³³. En effet, la promotion des interactions fongiques-bactériennes peut avoir d’énormes implications sur divers résultats expérimentaux utilisant de tels modèles de biofilms in vitro par rapport aux biofilms uniquement bactériens⁴². En fin de compte, il est fortement recommandé d’en tenir compte lors de la création d’un nouveau modèle de biofilm multi-espèces pour de telles études. Bien que les micro-organismes inclus devraient être facilement identifiables à partir de recherches documentaires approfondies, pour la plupart des niches et/ou des maladies, ils peuvent ne pas bien s’intégrer dans un modèle complexe in vitro pour différentes raisons. Voici d’autres considérations potentielles qui devraient être prises en compte :

Dynamique de formation des biofilms
La formation d’un biofilm in vivo implique souvent une colonisation précoce, intermédiaire et tardive par des micro-organismes particuliers. La formation de la plaque dentaire supra- et sous-gingivale est fortement caractérisée par l’attachement initial de la pellicule salivaire trouvée sur l’émail par des espèces pionnières (par exemple, les espèces Streptococcus ), avec des agents pathogènes intermédiaires et ultérieurs nécessitant ceux-ci comme échafaudage pour la colonisation⁴³. Un phénomène similaire a été proposé dans l’environnement vaginal au cours de la vaginose bactérienne, où Gardnerella vaginalis est considéré comme le colonisateur initial, suivi d’anaérobies ultérieurs⁴⁴. Cependant, il est important de noter que ce n’est peut-être pas le cas pour d’autres maladies dans d’autres niches écologiques.

Densité d’ensemencement pour chaque micro-organisme
Les micro-organismes auront des tailles et/ou des dynamiques de croissance différentes lorsqu’ils sont cultivés in vitro ; Par conséquent, il est important d’en tenir compte lors du processus de normalisation. Par exemple, C. albicans est 100 à 150 fois plus grand que les cellules bactériennes^45,46, par conséquent, il peut justifier un ajout à une concentration plus faible, par exemple, 1 x 10⁶ cellules/mL, à de tels modèles de biofilm.

Antagonisme entre espèces
Certains micro-organismes (y compris les mêmes espèces mais des isolats différents, des souches de laboratoire et/ou cliniques) utilisés pour ces modèles peuvent entrer en compétition avec d’autres lors de la formation du biofilm, entraînant une inhibition de la croissance de certaines espèces microbiennes⁴⁷. Une étude de Sadiq et al. a mis en évidence comment différentes combinaisons de micro-organismes peuvent influencer la biomasse du biofilm résultant d’une synergie (ou d’un antagonisme) ^{microbienne48}. Bien que l’étude de ces interactions dans un modèle de biofilm puisse intéresser les groupes de recherche (par exemple, tester un traitement prébiotique ou probiotique), d’autres peuvent ne pas tenir compte d’un tel antagonisme, ce qui pourrait avoir un impact sur la complexité multi-espèces lors de la création du modèle.

Durée de maturation du biofilm
Il est essentiel d’optimiser les délais de maturation des biofilms, car cela peut dépendre de la dynamique de croissance des micro-organismes inclus et du système modèle (y compris les substrats) utilisé pour la culture. Des temps de maturation plus longs pourraient entraîner une meilleure colonisation pour les agents pathogènes ultérieurs, mais une plus grande mort cellulaire dans les modèles, en particulier des colonisateurs précoces. À l’inverse, des temps d’incubation plus courts pourraient être importants si l’on veut étudier les effets de modèles de biofilms immatures sur l’hôte. Une étude de Brown et al. a décrit comment le même modèle de biofilm de plaie de 10 espèces avait des profils inflammatoires différents dans les cellules humaines THP-1 lorsqu’il était mature pendant 24 h, 48 h et 72 h, suggérant que moins le biofilm est mature, plus il est pro-inflammatoire⁷. Des résultats similaires ont pu être observés dans des modèles de tissus multicouches. Il est également important de noter que des changements quotidiens réguliers des milieux sont nécessaires pour minimiser la mort cellulaire dans le biofilm, bien que cela puisse être modifié en fonction des schémas thérapeutiques en cours, par exemple, si l’on évalue les effets d’interventions antimicrobiennes prolongées.

Pour le volet « manipulation des tissus organotypiques, montage expérimental et traitement des tissus », les délais d’incubation peuvent être ajustés en fonction des besoins du chercheur. Les interactions hôte-pathogène peuvent être étudiées à des moments plus précoces, par exemple de 1 à 12 h, à des points ultérieurs de 48 h et 72 h, selon la question de recherche. Deuxièmement, tous les milieux d’entretien contenant des antibiotiques sont fournis ; Par conséquent, il faut demander à l’entreprise de les retirer lors de la commande en fonction de la conception expérimentale. Bien que le milieu sous l’insert n’entre pas en contact direct avec la périphérie supérieure du tissu, à moins qu’une blessure ne soit infligée dans le modèle ^6,8, l’élimination des antibiotiques peut mériter d’être envisagée si l’on étudie l’invasion microbienne dans le tissu.

Le matériel microbien utilisé pour la stimulation de la co-culture peut également être modifié, comme nous l’avons vu ci-dessus, dans le but d’évaluer les incubations de planctoniques, de surnageants de biofilms usagés (filtrés et non filtrés), de biofilms entiers ou d’incubations de sonicates de biofilm avec le tissu. Par exemple, des preuves antérieures ont montré que des modèles tissulaires tels que ceux fournis par EpiSkin fournissent des modèles utiles pour étudier les interactions planctoniques fongiques-hôtes : il a été démontré que les cellules de C. albicans, Candida auris, Malassezia furfur et Trichophyton rubrum se fixent et interagissent avec les couches de tissus périphériques dans l’OHE, l’épiderme humain reconstruit (RHE) ou l’épithélium vaginal humain, certaines de ces études montrant une stimulation de la réponse de l’hôte suite à une infection fongique 1,5,6,11,12,49. Des publications similaires existent pour les interactions bactérie-hôte, par exemple, la formation de biofilm de Cutibacterium acnes, un agent pathogène commun associé au microbiote du cuir chevelu dans les pellicules, a été étudiée à la surface de l’HRE, lorsqu’elle est cultivée seule et avec l’organisme fongique de la peau, Malassezia restricta¹⁰. D’autres ont étudié la capacité de Staphylococcus spp. à se fixer à l’HRE, en mesurant les caractéristiques physicochimiques et microbiologiques de cette interaction bactérie-hôte⁵⁰. N’Diaye et les co-auteurs ont exploré comment le neuropeptide d’origine humaine, le peptide lié au gène de la calcitonine, a influencé la virulence de Staphylococcus aureus dans le modèle de tissu RHE⁵¹. D’autres ont étudié les effets protecteurs des interventions probiotiques sur l’infection à Pseudomonas aeruginosa de l’épithélium cornéen humain¹⁴. Pendant ce temps, d’un point de vue polymicrobien, différents groupes ont étudié les effets des biofilms d’espèces mixtes sur différents substrats tissulaires 2,3,7,13.

Dans l’ensemble, ces protocoles et études mentionnés ci-dessus documentent la vaste gamme d’applications des modèles de tissus organotypiques pour étudier les interactions hôte-pathogène. Bien que des études aient montré que les modèles EpiSkin, en particulier le modèle de peau RHE, ont une bonne applicabilité pour tester les produits cosmétiques pour la corrosion/irritation 52,53,54,55, il existe certaines limites entre ceux-ci et les explants de tissus ex vivo du monde réel ou d’autres fournisseurs de tissus disponibles dans le commerce^56,57. Une limitation évidente serait que tous les modèles de tissus disponibles dans le commerce sont générés à partir de lignées cellulaires dans un environnement stérile et « exempt de germes », ce qui signifie que le tissu n’a jamais été exposé à des perturbations microbiennes : cela peut exacerber toute réponse inflammatoire chez l’hôte, bien au-delà de ce qui serait observé in vivo ou après stimulation d’explants de tissus ex vivo ⁵⁷. À l’inverse, ces systèmes modèles de laboratoire ne contiendront pas de couches conjonctives ou de système vasculaire sous-jacentes que l’on associerait à des tissus in vivo, des caractéristiques qui peuvent être préservées lors d’une explantation de tissus ex vivo et des caractéristiques qui ont un impact sur les réponses inflammatoires. En effet, une récente revue systématique a souligné qu’il fallait envisager d’utiliser des modèles de tissus avec une vascularisation appropriée créée à l’aide de diverses technologies d’ingénierie, y compris les biomatériaux⁵⁸. Par exemple, une étude récente a utilisé une matrice à base de fibrine intégrée à des fibroblastes gingivaux et à des cellules endothéliales microvasculaires pour créer un équivalent de tissu gingival vascularisé. Les auteurs ont décrit une réponse inflammatoire différentielle dans le modèle après une exposition à des micro-organismes associés à la santé ou à des maladies⁵⁹. D’un point de vue commercial, des modèles plus complexes existent aujourd’hui, comme le « modèle T-Skin », qui contient un tissu de pleine épaisseur constitué d’un derme composé de fibroblastes superposés à l’épiderme. Il serait intéressant de voir comment des modèles aussi complexes se comparent aux systèmes uniquement de l’épiderme.

Bien qu’aucun modèle ne soit parfait, les modèles de tissus organotypiques représentent des alternatives prometteuses pour les essais précliniques, s’alignant sur le cadre décrit par les trois R, pour le remplacement, la réduction et le raffinement dans la recherche sur les animaux. À cette fin, bien que les modèles animaux fournissent des informations importantes sur la nature physiopathologique complexe des maladies humaines liées au biofilm, ils présentent des inconvénients évidents. Ces modèles 3D sont facilement manipulables, ce qui permet d’apporter des modifications importantes et subtiles aux enquêtes sans approbation éthique. La combinaison de ces modèles avec les systèmes de biofilms complexes existants décrits ci-dessus peut améliorer considérablement notre compréhension des interactions hôte-pathogène et mieux prédire le succès de nouvelles thérapies avant les investigations in vivo .

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Disques d’hydroxyapatite (HA) de 13 mm	Plasma Biotal Limited	n/a (sur commande)	Substrat pour la formation d’un biofilm buccal, imitant la surface de la dent
Aiguille de 19 G (40 mm)  ;	VWR	613-2028	Utilisé pour aider à l’élimination des disques HA des plaques et pour découper les tissus des inserts
24 plaques de microtitrage à fond plat bien traitées TC avec couvercles  ;	Fournitures de laboratoire scientifique	3524 (paquet de 100)	Plaques pour la culture de biofilms et les expériences de co-culture tissulaire
Perles de verre lavées à l’acide (425-600 &mu ; m)	Merck : Sigma-Aldrich	G8772	Pour la lyse tissulaire afin d’améliorer le rendement de l’extraction de l’ARN.   ;
Actinomyces naeslundii DSM 17233  ;	Institut Leibniz DSMZ	n/a	L’un des micro-organismes utilisés pour le modèle complexe de biofilm
Bead Mill 24 Homogénéisateur (ou équivalent)  ;	Fisher Scientific	15-340-163	Pour la lyse tissulaire afin d’améliorer le rendement de l’extraction de l’ARN.   ;
Bijoux  ; (7 ml)	Greiner Bio-One	189170 (700 par sac)	Utilisé pour la sonication du biofilm  ;   ;
Kit de synthèse d’ADNc (haute capacité)	Thermo Fisher Scientific	4368814 (pour 200 réactions)	Synthèse d’ADNc à partir de l’ARN tissulaire
gélose au sang de Columbia (CBA)  ;	Thermo Fisher Scientific	CM0331B (pour 500 grammes)	Utilisé pour préparer des plaques CBA pour la culture de micro-organismes aérobies
Défibriné Sang de cheval	E& O Laboratories	DHB	Utilisé pour compléter les plaques CBA et FAA pour la culture de micro-organismes aérobies et anaérobies
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (dPBS : sans CaCl2 et MgCl2)	Merck : Sigma-Aldrich	DB537	dPBS pour la co-culture cellulaire avec le sonicate de biofilm
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953	American Type Culture Collection	n/a	L’un des micro-organismes utilisés pour le modèle complexe de biofilm
Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii DSM 19507	Institut Leibniz DSMZ	n/a	L’un des micro-organismes utilisés pour le modèle complexe de biofilm
GraphPad Prism (Version 10)	GraphPad Software, Inc	n/a	Pour la création de graphiques et l’analyse de données  ;
Kit ELISA IL-8 humain (kit ELISA non revêtu avec plaques)	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	88-8086-86 (pour tests 10 x 96)	Kit ELISA et plaques pour l’évaluation des protéines des milieux tissulaires épuisés
Épithélium oral humain (HOE)  ;	Episkin	n/a (fabriqué sur commande)	Le tissu épithélial utilisé pour le système de modèle de co-culture
Boucles d’inoculation (jetables, 10 & micro ; L, ou équivalent)  ;	Fisher Scientific	12870155 (paquet de 1000)	Pour la culture microbiologique en milieux solides et liquides
MicroAmp Fast Reaction Plaques qPCR à 96 puits (0,1 mL)  ;	Thermo Fisher Scientific	4346907 (pour 10 plaques)	Pour le profilage de l’expression génique qPCR des tissus Billes de
microbanque	Pro-Lab Diagnostics	PL.170	Stockage et cyroconservation des micro-organismes  ;
Eau sans nucléase	Thermo Fisher Scientific	AM9935 (10 x 1,5 mL)	Eau de qualité RT-PCR pour les expériences qPCR  ;
Boîtes de Pétri (90 mm)	Fisher Scientific (Sterilin)  ;	11309283 (boîte de 500)	Utilisé pour la préparation de plaques de gélose pour la culture microbienne
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Thermo Fisher Scientific  ;	18912014 (boîte de 100 comprimés)	PBS pour la standardisation des micro-organismes et les étapes de lavage du biofilm
Mini kit Rneasy	Qiagen	74106 (pour 250 réactions)	Kit d’extraction d’ARN sur colonne pour les tissus  ;
Roswell Park Memorial Institute 1640 moyen	Merck : Sigma-Aldrich	R7755-10L (pour 10 L)  ;	Supports pour la culture du biofilm  ;
Réseau de profileurs RT2	Qiagen	330171 (sur mesure)	Réseau qPCR contenant des amorces prêtes à l’emploi pour le profilage de l’expression génique
gélose anaérobie Schaedler	Merck : Sigma-Aldrich (Millipore)	91019 (pour 500 g)	Utilisé pour préparer des plaques de gélose anaérobie Fastdious  ;
Bouillon anaérobie Schaedler	Thermo Fisher Scientific  ;	CM0497B (pour 500 g)	Milieu liquide pour la croissance de micro-organismes anaérobies
Bouchon à vis Beadbug O-Ring tube  ;	Fournitures de laboratoire scientifique	Z763837-1000EA (paquet de 1000)	Pour une utilisation dans l’homogénéisateur Bead Mill 24, pour lyser les tissus
Bain de sonication	Fisher Scientific (Fisherbrand)	n/a	Pour la sonication de biofilms à partir de disques HA  ;
Streptococcus intermedius DSM 20753  ;	Institut Leibniz DSMZ	n/a	L’un des micro-organismes utilisés pour le modèle de biofilm complexe
Streptococcus mitis NCTC 12261	Collection nationale de cultures types	n/a	L’un des microorganismes utilisés pour le modèle de biofilm complexe
Streptococcus oralis NTCC 11427  ;	Collection nationale de cultures types	n/a	L’un des micro-organismes utilisés pour le modèle complexe de biofilm
SYBR-green (qPCRBIO, SyGreen Mix, Hi-ROX)	PCR Biosystems	PB20.12	SYBR-green mix pour qPCR  ;
Bouillon Todd Hewitt	Merck : Sigma-Aldrich	T1438  ;	Supports pour la culture du biofilm  ;
Bouillon de soja tryptone (TSB) moyen	Merck : Sigma-Aldrich	22092 (pour 500 g)	Milieu liquide pour la croissance de micro-organismes aérobies
Pince à épiler (150 mm, acier inoxydable, dentelée)	RS-Pro  ;	545-187	Utilisé pour déplacer des disques d’AH et des inserts tissulaires/extraits de tissus
Tubes universels  ; (30 ml)	Greiner Bio-One	201150 (400 par sac)	Récipients pour la culture de micro-organismes en culture liquide  ;
Veillonella dispar NCTC 11831	National Collection of Type Cultures	n/a’L’un	des micro-organismes utilisés pour le modèle complexe de biofilm
&bêta ;-métacapthoéthanol	Merck : Sigma-Aldrich	M3148	Désactivation de la RNase dans des échantillons de tissus