Évaluation de gènes anormaux liés à la croissance de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques en combinant la technologie CRISPR/Cas9 avec le comptage cellulaire

Résumé

Ici, nous présentons un protocole qui intègre la technologie CRISPR/Cas9 avec le test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) pour identifier les gènes candidats qui sont cruciaux pour la capacité de prolifération anormale des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices.

Résumé

Les cellules souches hématopoïétiques possèdent la capacité de s’auto-renouveler à long terme et le potentiel de se différencier en divers types de cellules sanguines matures. Cependant, l’accumulation de mutations cancéreuses dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) peut bloquer la différenciation normale, induire une prolifération aberrante et, finalement, conduire à la leucémogenèse. Pour identifier et/ou évaluer les mutations cancéreuses, nous avons intégré la technologie CRISPR/Cas9 au test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) afin d’étudier un gène modèle Trp53, essentiel à la capacité de prolifération anormale des HSPC. Plus précisément, des cellules de moelle osseuse enrichies pour les HSPC de souris Cas9 ont été récoltées puis soumises à une transfection virale avec des ARN à guide unique (ARNg) ciblant un ou plusieurs gènes candidats pour introduire des altérations génétiques dans les HSPC. Ensuite, un test CCK-8 a été effectué pour étudier la capacité proliférative des HSPC transfectés. L’efficacité du ciblage de l’ARNsg a été confirmée par un test de suivi des indels par décomposition. Ces gènes identifiés pourraient jouer un rôle crucial dans la leucémogenèse et pourraient servir de cibles thérapeutiques potentielles.

Introduction

L’hématopoïèse, qui produit toutes les lignées de cellules sanguines tout au long de la vie, est maintenue par une petite population appelée cellules souches hématopoïétiques (CSH). Les CSH se maintiennent par auto-renouvellement et produisent divers progéniteurs engagés qui donnent naissance à des cellules sanguines fonctionnelles entièrement différenciées ^1,2,3. Ce processus est étroitement réglementé. Cependant, l’accumulation de mutations cancéreuses dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) entrave la différencia....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux menées dans le cadre de ce protocole ont été approuvées par le Comité de protection et de bien-être des animaux de l’Université de médecine chinoise de Pékin.

1. Construction de plasmides d’ARNsg ciblant les gènes candidats (4 - 5 jours)

1. Concevez le ciblage de l’ARNsg à l’aide d’outils de conception d’ARNsg en ligne. Entrez la séquence d’ADN génomique cible dans un outil de conception d’ARNsg en ligne (par exemple, https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). Sélectionnez les cibles d’ARNsg appropriées et commandez les oligonuc....

Résultats

Effet de l’inactivation de Trp53 sur la capacité proliférative des HSPC de souris
Ici, nous avons utilisé l’inactivation Trp53 comme exemple pour démontrer ce protocole. Pour étudier l’effet de l’inactivation de Trp53 sur la capacité proliférative des HSPC de souris, nous avons utilisé la transfection lentivirale pour introduire l’ARNsg Trp53 dans des cellules de moelle osseuse exprimant Cas9 enrichies pour les HSPC après un traitem.......

Discussion

La technologie CRISPR/Cas9 a été largement utilisée dans la recherche biomédicale en raison de sa nature conviviale et de sa grande efficacité, facilitant des applications telles que le dépistage de la fonction génique¹⁸, la modélisation de maladies¹⁹, l’immunothérapie²⁰ et le marquage et l’imagerie de cellules vivantes²¹. Des études récentes ont mené un dépistage CRISPR à grande échelle afin .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,45 &mu ; m membrane de microfiltration	Sartoriu	16533K-1
1,5 mL Tube EP	LABLEAD	MCT-150-CLD-1
Antenne parabolique de 10 cm	Corning	430167
15 mL Seringue
1 mL
Tube de 50 mL	LABLEAD	LXG5000
5-Fluorouracile	Sigma	F6627-1
Plaque 6 puits	Corning	3516
70 µ ; Tamis à cellules m	Falcon® ;	352350
Plaques à 96 puits	Corning	3599
Tampon de lyse ACK	Leagene	CS0001
Agar	BIODEE	DE0010
Ampicilline	Solarbio	A8180
Applied Biosystems Thermocycleurs pour PCR	Thermofisher
Kit de comptage de cellules-8	Bimake	B34304
Centrifugeuse	eppendorf	Centrifugeuse 5810R
CO2 Incubateur	Thermo SCIENTIFIC
DMEM	Gibco	C11995500BT
DNA Clean& Concentrateur-5	ZYMO	D4014
Dneasy Blood & Tissure Kit	Qiagen	69504
ESP3I (BSMBI)	NEB	R0580L
Sérum de veau fœtal	ExCell	FSP500
GraphPad Prism 9.3
HEK-293T	ATCC ; Virginie, États-Unis
HEPEs	Sigma	V900477
KOD-Plus-Neo	TOYOBO	KOD-401
lentiGuide-Puro	Addgene	52963	vecteur de squelette
LSL-Cas9 souris	Modèle Animal Centre de recherche of NANJING UNIVERSITY  ;
T002249 spectrophotomètre d’absorbance de microplaques	BIO-RAD	xMark&trade ;
Nacl	Rhawn	R019772
PBS	Solarbio	P1003
PEI	Proteintech	B600070
solution de pénicilline-streptomycine, 100x	Solarbio	P1400
pMD2.G plasmide	Addgene	12259
polybrene	Beyotime	C0351
Sel de sodium d’acide polyinosinique-polycytidylique	Sigma	P1530
psPAX2	Addgene	12260
QIAquick PCR Purification Kit  ;	Qiagen	28104
RecombinantMurineIL-3	Peprotech	213-13-10ug
RecombinantMurineIL-6	Peprotech	216-16-2ug
RecombinantMurineSCF	Peprotech	250-03-10ug
Agarose régulière	BIOWEST	BY-R0100
Crevette Phosphatase Alcaline (rSAP)	NEB	M0371S
Spectrophotomètre SpectraMax QuickDrop Ultra-Micro MOLECULAR	DIVICES
Stbl3 Cellules compétentes	BioMed	BC108-01  ;
T4 Polynucléotide Kinase	NEB	M0201L
T4-Ligase	Takara	2011B
TIANprep Rapid Mini Plasmide Kit	TIANGEN	DP105-03
Trypan Blue solution	LABLEAD	C0040-100ml
Trypsine-EDTA	Gibco	25200072
Tryptone	OXOID	LP0042
WEHI-CM	Nanjing Fuksai Biotechnology  ;
CBP50079 EXTRAIT DE LEVURE	OXOID	LP0021

stérile LABLEAD LXG1500 2x Accurate Taq Master Mix (colorant plus)Accurate Biology AG11010 Pour PCR de colonie