Comparaison de l’accès rétropéritonéal transpéritonéal et de la ponction percutanée pour la modélisation de la dégénérescence discale lombaire chez le lapin

Résumé

Ce protocole a comparé les ponctions percutanées et trans-rétropéritonéales dans un modèle de dégénérescence discale intervertébrale (DIIV) de lapin. Les deux méthodes ont induit l’IVDD ; Cependant, l’approche trans-rétropéritonéale a entraîné des changements plus importants et une mortalité plus faible.

Résumé

Cette étude compare l’efficacité de deux méthodes pour induire la dégénérescence du disque intervertébral (DDIV) chez le lapin : la ponction percutanée et la ponction trans-rétropéritonéale de l’anneau fibreux. Quinze lapins blancs de Nouvelle-Zélande mâles en bonne santé ont été répartis au hasard en trois groupes : simulacre, ponction percutanée et ponction trans-rétropéritonéale. Une évaluation complète, comprenant les taux de mortalité, les évaluations morphologiques et histologiques, l’imagerie radiologique et l’analyse des biomarqueurs, a été réalisée afin d’assurer une comparaison précise et détaillée entre les deux méthodes. Les résultats démontrent que les deux techniques de ponction ont réussi à induire l’IVDD dans le modèle de lapin. Cependant, l’approche trans-rétropéritonéale a entraîné des changements dégénératifs plus prononcés dans les disques intervertébraux tout en maintenant un taux de mortalité significativement plus faible par rapport à la méthode percutanée. Ces résultats mettent en évidence les avantages de l’approche trans-rétropéritonéale dans la modélisation de l’IVDD. Cette étude fournit des informations précieuses sur l’établissement de modèles IVDD et jette les bases de recherches futures sur des stratégies de traitement efficaces de la lombalgie, améliorant ainsi les résultats pour les patients.

Introduction

Au cours des dernières décennies, la lombalgie (lombalgie) est devenue le trouble musculo-squelettique le plus important affectant la qualité de vie¹. La lombalgie est devenue un problème de santé publique de plus en plus important, imposant un fardeau économique substantiel à la société en raison de la perte de travail et des dépenses médicales supplémentaires ^2,3. Rien qu’aux États-Unis, les coûts directs et indirects associés à la lombalgie dépassent 100 milliards de dollars par an, y compris les dépenses médicales, les pertes de revenus et les pertes de main-d’œuvre⁴. La lombalgie est souvent causée par une dégénérescence du disque intervertébral (DDIV)5,6,7,8. Compte tenu de la prévalence élevée et de l’impact économique de la lombalgie, il est essentiel de modéliser avec précision l’IVDD pour explorer les stratégies de traitement.

Pour comprendre la physiopathologie de l’IVDD et évaluer les stratégies de traitement, divers modèles animaux précliniques in vivo ont été développés et utilisés⁹. De multiples méthodes ont été employées dans ces modèles pour induire la dégénérescence discale, y compris les lésions discales chirurgicales ou chimiques, le stress mécanique non invasif, la modification génétique et la présence naturelle¹⁰. Parmi ces méthodes, les lésions chirurgicales représentent jusqu’à 64,9 % de l’induction de l’IVDD, la ponction à l’aiguille étant la principale technique chirurgicale¹¹. Le modèle à perforation à l’aiguille se caractérise par sa facilité d’établissement et ses dommages minimes aux animaux de laboratoire. Les approches courantes de ponction à l’aiguille comprennent l’accès rétropéritonéal ouvert à l’espace discal lombaire et la ponction postérolatérale percutanée. La profondeur d’insertion peut être déterminée à l’aide d’une surveillance radiographique ou de la longueur de l’aiguille. Notamment, l’approche percutanée peut réduire les lésions tissulaires iatrogènes par rapport aux méthodes chirurgicales ouvertes, tandis que l’accès rétropéritonéal offre l’avantage d’une visualisation directe - caractéristiques qui n’ont pas été quantitativement comparées dans la littérature antérieure. Bien que des études aient examiné les effets de l’utilisation d’aiguilles de différents diamètres¹² et de la perforation de disques^{différents 10} sur l’induction de l’IVDD, les études comparatives portant sur différentes approches de ponction à l’aiguille restent limitées. Le modèle de lapin sélectionné est particulièrement utile pour les chercheurs qui ont besoin d’études longitudinales rentables avec des évaluations d’imagerie fréquentes, compte tenu de sa similitude anatomique avec les disques humains et de ses avantages par rapport aux modèles de rongeurs en termes de taille et de structure¹³.

Dans cette étude, des modèles de DIV lombaire chez le lapin ont été établis à l’aide de deux méthodes : l’accès rétropéritonéal ouvert pour ponctionner l’espace discal lombaire et la ponction postérolatérale percutanée. Un ensemble complet de mesures des résultats, y compris les changements morphologiques, histologiques et radiologiques, a été analysé.

Protocole

Les procédures d’expérimentation animale ont strictement respecté le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health et ont été approuvées par le Comité d’éthique des animaux d’expérimentation de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (numéro d’approbation éthique : 2021-23). Quinze lapins blancs de Nouvelle-Zélande en bonne santé, âgés de 4 mois, propres (2,25 kg ± 0,25 kg) ont été utilisés, dont sept mâles et huit femelles. Les animaux ont été logés dans un environnement avec une température ambiante de 23 °C ± 3 °C et une humidité d’environ 60 % ± 10 % pendant une semaine d’adaptation, avec un accès libre à l’eau et à la nourriture. Avant l’expérience, les 15 lapins ont été répartis au hasard dans l’un des trois groupes suivants : le groupe fictif (groupe A), le groupe de ponction percutanée de l’anneau fibreux (groupe B) et le groupe de ponction de l’anneau fibreux de l’espace trans-rétropéritonéal (groupe C), avec cinq lapins dans chaque groupe. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Etablissement d’un modèle d’IDIV de lapin par ponction percutanée de l’anneau fibreux

REMARQUE : Le modèle d’IDIV de lapin a été établi à l’aide de la méthode de ponction percutanée de l’anneau fibreux. La procédure a suivi la méthode de modélisation de la ponction décrite par Luo TD et ^al.14 et a été réalisée sous guidage par rayons X (Figure 1).

1. Préparez le lapin.
   1. Faites jeûner les lapins pendant 24 heures avant l’opération, en assurant l’accès à l’eau.
   2. Administrer l’anesthésie par injection intraveineuse de pentobarbital sodique à 3 % (1,3 mL/kg) dans la veine de l’oreille (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
   3. Confirmez la réussite de l’anesthésie en vérifiant l’immobilité, la relaxation des muscles, l’absence de réflexe cornéen et l’absence de réponse à la douleur.
2. Positionnez et marquez le lapin.
   1. Fixez le lapin en position couchée sur une planche de fixation.
   2. Rasez et préparez la zone chirurgicale, puis palpez les repères osseux.
   3. Palpez les repères osseux sur le dos lombaire du lapin. Localisez la côte la plus basse du lapin, qui correspond généralement à la vertèbre juste au-dessus de l’apophyse épineuse L1.
   4. Identifiez l’apophyse épineuse immédiatement sous cette vertèbre pour déterminer l’apophyse épineuse L1.
   5. Localisez les points les plus élevés des crêtes iliaques, à peu près au niveau de la vertèbre L6.
   6. Retracez à partir de l’apophyse épineuse L1 pour identifier séquentiellement chaque apophyse épineuse jusqu’à L7.
   7. À l’aide d’un marqueur, marquez clairement l’apophyse épineuse L1 sur le dos du lapin.
   8. Passez à l’apophyse épineuse suivante et marquez-la comme L2.
   9. Continuez à marquer chaque apophyse épineuse suivante comme L3, L4, L5, L6 et L7. Assurez-vous que chaque marque est distincte et dans l’ordre séquentiel pour une identification claire.
3. Localisez et marquez le site de ponction.
   1. Palpez les apophyses transverses et localisez le point médian entre les extrémités distales de L5 et L6.
   2. Marquez ce point et préparez-vous à insérer l’aiguille de ponction à environ 1 cm au-dessus.
4. Insérez l’aiguille de perforation.
   1. Tenez l’aiguille de ponction horizontalement et insérez-la vers le sol, brisant la peau.
   2. Avancez l’aiguille pour atteindre le corps vertébral L4 et vérifiez le bon positionnement sous guidage aux rayons X.
   3. Inclinez l’aiguille légèrement céphalique à un angle d’environ 20° vers le disque intervertébral L4-5. Perforer le disque et confirmer l’exactitude de la ponction lors de l’examen radiologique.
5. Effectuez des perforations discales.
   1. Percer avec précision l’anneau fibreux, en utilisant un guidage par rayons X si nécessaire.
   2. Répétez le processus de ponction pour les disques intervertébraux L2-3 et L3-4, en perforant chacun une fois.
   3. Maintenez une profondeur de perforation d’environ 5 mm avec un temps de séjour de 5 s pour chaque disque.
6. Soins post-procédure
   1. Désinfectez et bandez le site de ponction.
   2. Injecter la pénicilline par voie intramusculaire dans le grand fessier à une dose de 40 000 U par lapin par jour pendant 3 jours.
      REMARQUE : Ajustez l’approche si l’aiguille rencontre des tissus durs. Utilisez le guidage par rayons X pour une ponction précise. Surveiller la récupération du lapin et lui prodiguer les soins appropriés.

2. Etablissement d’un modèle IVDD de lapin par ponction trans-rétropéritonéale de l’espace fibrosus

REMARQUE : Le modèle d’IDIV de lapin a été établi à l’aide de la méthode de ponction trans-rétropéritonéale de l’anneau fibreux de l’espace¹² (figure 2).

1. Jeûnez les lapins pendant 24 h avant l’opération, en leur permettant d’accéder à l’eau.
2. Anesthésier le lapin en injectant par voie intraveineuse 3 % de pentobarbital sodique (1,3 ml/kg) dans la veine de l’oreille (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).
3. Assurez-vous que le lapin est immobile, avec des muscles détendus, pas de réflexe cornéen et pas de réponse douloureuse à la pression pour confirmer la réussite de l’anesthésie.
4. Fixez le lapin en position couchée sur une planche de fixation.
5. Rasez et préparez la zone chirurgicale.
6. Palper les points de repère osseux, en marquant les apophyses épineuses lombaires L1-L7 sur le dos lombaire du lapin avec un stylo de marquage.
7. Repalper les apophyses transverses du lapin pour déterminer l’emplacement de l’incision chirurgicale.
8. Placez un champ stérile et désinfectez la peau locale pour assurer des conditions d’asepsie.
9. Utilisez une approche rétropéritonéale postérieure pour disséquer le fascia et les muscles couche par couche, exposant ainsi l’aspect latéral du disque intervertébral lombaire.
10. Percer l’anneau fibreux à l’aide d’une aiguille de ponction sur une profondeur d’environ 5 mm et un temps de séjour de 5 s.
11. Perforez séquentiellement les disques intervertébraux L3-4, L4-5 et L5-6, en veillant à ce que chaque disque ne soit perforé qu’une seule fois.
12. Suturez les tissus couche par couche à l’aide d’un fil de suture de 0,25 mm de diamètre.
13. Désinfectez et bandez le site de ponction après le modélisme.
14. Injecter quotidiennement de la pénicilline par voie intramusculaire dans le grand fessier du lapin à une dose de 40 000 U par lapin pendant trois jours consécutifs.
    REMARQUE : Utilisez la pénicilline avec une spécification de 800 000 unités/flacon et le numéro d’approbation Veterinary Drug 140051251.

3. Sélection des modèles de DIV et évaluation des résultats

1. Évaluation de la mortalité et de l’état général des lapins
   1. Observez les lapins chaque semaine pour déterminer leur survie et noter leur état général, y compris l’état mental, les habitudes d’activité, la consommation de nourriture et d’eau, ainsi que le débit fécal et urinaire.
   2. Consigner les observations avec précision et noter tout changement de condition.
2. Suivi du poids des lapins
   1. Consigner le poids corporel des lapins avant et après l’établissement du modèle, ainsi qu’avant le prélèvement de tissus.
   2. Assurez-vous d’enregistrer le poids avec précision et notez tout changement important.
3. Évaluation radiologique
   1. Obtenir une imagerie par résonance magnétique sagittale pondérée en T2 de l’ensemble de la séquence d’explants vertébraux lombaires de chaque lapin blanc avant et 4 semaines après l’établissement du modèle.
   2. Observez l’étendue de la dégénérescence des disques intervertébraux.
   3. Effectuer une évaluation quantitative de la dégénérescence des disques intervertébraux à l’aide du système de classification modifié de Pfirrmann proposé par Griffith et ^al.15. Demandez à trois radiologues indépendants en aveugle d’évaluer les séquences d’IRM pondérées en T2 selon des critères établis : hauteur du disque, intensité du signal du noyau pulpeux et intégrité de l’anneau fibreux.
   4. Déterminer les notes finales par consensus lorsque les écarts dépassent un niveau scolaire. Effectuez toutes les évaluations à l’aide d’un logiciel de visualisation DICOM standardisé avec des paramètres d’affichage calibrés.
4. Évaluation histopathologique et notation
   1. Euthanasier les lapins 4 semaines après la modélisation à l’aide d’une surdose intraveineuse de pentobarbital sodique (selon les protocoles approuvés par l’établissement), puis prélever rapidement les disques intervertébraux L2-L3, L3-L4 et L4-L5 sur de la glace¹⁵.
   2. Fixez les disques L2-L3 dans du paraformaldéhyde à 4 % et stockez les échantillons restants à -80 °C.
   3. Immergez les disques fixes dans une solution détartrante, telle que 10 % EDTA, assurant une immersion complète. Changez la solution détartrante tous les 2-3 jours pour maintenir l’efficacité.
   4. Surveillez régulièrement le processus de détartrage jusqu’à ce qu’il soit complètement détartrant, ce qui peut prendre de plusieurs jours à une semaine, selon la taille et l’épaisseur du disque.
   5. Rincez abondamment les disques détartrés à l’eau courante pour éliminer toute trace de solution détartrante.
   6. Déshydratez les disques en les immergeant dans une série de solutions d’éthanol graduées, en commençant par 70 % d’éthanol et en augmentant progressivement jusqu’à 100 % d’éthanol. Effectuez chaque étape de déshydratation pendant 1 à 2 heures par niveau.
   7. Infiltrer les disques déshydratés avec de la cire de paraffine (point de fusion 56-58 °C) pendant au moins 2 h, en assurant une infiltration complète.
   8. Enfoncez les disques infiltrés dans un bloc de cire, en les positionnant pour le sectionnement. Laissez le bloc de cire refroidir et se solidifier complètement.
   9. Sectionnez les disques encastrés en tranches fines et uniformes (5-10 μm) à l’aide d’un microtome. Montez les coupes sur des lames de verre pour une analyse plus approfondie, telle que la coloration histologique ou l’immunohistochimie^12,13.
   10. Effectuez une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE), capturez des images au microscope optique et attribuez des scores de coloration HE à l’aide de l’échelle de classification histopathologique^{IVD 12}.
5. Dosage TUNEL
   1. Décaffinez et réhydratez des sections de tissu du disque intervertébral, puis effectuez la récupération d’antigène et la perméabilisation membranaire.
   2. Ajouter un mélange de réactif 1 (TdT) et de réactif 2 (dUTP) dans un rapport de 1:9 et incuber dans une chambre humidifiée.
   3. Lavez les sections avec un tampon PBS, appliquez la teinture DAPI et incubez dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 min.
   4. Capturez des images à l’aide d’un scanner panoramique entièrement automatisé et d’un logiciel de traitement.
6. Détection de cytokines
   1. Euthanasier les lapins d’expérience (étape 3.4.1) et prélever des échantillons de sang dans l’aorte abdominale.
   2. Centrifuger des échantillons de sang de lapin à 2000 × g pendant 10 min à 25 °C pour séparer le sérum des cellules sanguines. Prélevez soigneusement le surnageant (sérum), en vous assurant qu’aucun débris cellulaire n’est inclus.
   3. Suivez les instructions fournies dans le kit ELISA pour détecter l’expression du TGF-β dans les échantillons de sérum.
   4. Préparez les réactifs et les étalons comme indiqué dans le kit ELISA.
   5. Ajoutez des échantillons de sérum dans les puits appropriés de la plaque ELISA.
   6. Incuber la plaque à la température et à la durée recommandées selon les instructions du kit.
   7. Lavez la plaque comme indiqué pour éliminer les réactifs non liés.
   8. Ajoutez l’anticorps de détection et les autres réactifs nécessaires, en suivant le protocole du kit.
   9. Incuber à nouveau la plaque pendant le temps et la température spécifiés.
   10. Lavez soigneusement la plaque pour éliminer l’excès de réactifs.
   11. Ajoutez la solution de substrat dans les puits et incubez pendant la période recommandée pour permettre le développement de la couleur.
   12. Mesurez la densité optique (DO) à l’aide d’un spectrophotomètre à la longueur d’onde spécifiée dans les instructions du kit.
   13. Calculer les concentrations de l’échantillon en substituant les valeurs de DO dans l’équation fournie ou en utilisant la courbe standard générée à partir des concentrations connues des étalons.

4. Analyse statistique

1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce.
2. Exprimer les variables continues sous forme de moyenne ± d’écart-type.
3. Utilisez l’ANOVA à un facteur pour tester les différences entre les groupes.
4. Appliquez des tests LSD pour des comparaisons par paires.
5. Utilisez l’ANOVA à mesures répétées pour analyser les données de mesures répétées.
6. Effectuez une analyse de corrélation de Spearman pour évaluer la corrélation entre les variables.
7. Fixez le niveau de signification à α = 0,05 et considérez les valeurs P inférieures à 0,05 comme statistiquement significatives.

Résultats

Les interventions chirurgicales ont été réalisées sans complications. Un lapin du groupe B (groupe perforation percutanée) est mort après l’intervention. Tous les autres animaux ont repris des habitudes alimentaires et d’activité normales après l’opération et ont survécu tout au long de la période expérimentale. Aucun saignement prolongé ou infection n’a été observé sur les sites chirurgicaux.

Évaluation de la mortalité et de l’état général
Le taux de mortalité était de 0 %...

Discussion

Les résultats de cette étude indiquent que les approches de ponction percutanée et transrétropéritonéale sont efficaces pour induire la dégénérescence du disque intervertébral (DDIV) dans des modèles de lapin. Notamment, sur la base d’une évaluation complète de l’état général, de la mortalité, de l’évaluation histopathologique, du test TUNEL et des taux sériques de TGF-β, le modèle de ponction trans-rétropéritonéale a entraîné des changements dégénératifs plus étendus dans les disques in...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0.3 T Vétérinaire Mécanique Résonance (IRM)	NINGBO CHUANSHANJIA	CSJ-MR
Alcool médical	LIRCON	20230107
Benzylpénicilline potassique	Jiangxi Keda Animal Pharmaceutique	140051251
Pince hémostatique	SHINVA	20211239
Seringue d’injection	CONPUVON	20153151307
Lames de couteau	Hons Medincal	20210615
Medical boule de coton absorbante  ;	; Cofoe	20210006
Aiguille de suture médicale	Shanghai Xiaoyi Medical Devices  ;
Aiguille de médullo-ponction	Yangzhou Jiangzhou Medical Devices	20190902	Utilisé pour ponctionner le disque lombaire
Saline physiologique	NeilMed  ;
Povidone solution iodée	Sichuan IJIS Medical Technology  ;
de lapin Explorer			Neighbor quasi-microbalance
;	Zhenhua Biomedical	ZH-BXT-3Z
Rasoir	AUX
Analyse statistique softeare	IBM	SPSS
Gaze stérile	Cofoe	20202140675
Gants chirurgicaux	DR. LERSH	20172140028
Couteau chirurgical  ;	Hons Medinca	20210019
Pince à épiler	chirurgicale SHINVA	20210233
Ligne de transmission de données USB-C	KINI
, microscope de photographie en lumière blanche  ;	Nikon·s ;	Eclipse Ci-L