Techniques de patch-clamp pour l’analyse d’une vésicule endolysosomale unique

Summary

Ce protocole détaille une méthode permettant de mesurer directement l’activité des canaux ioniques sur les vésicules intracellulaires à l’aide d’un système manuel de patch-clamp endolysosomal. Nous illustrons la méthode qui consiste à agrandir les endolysosomes et à isoler manuellement ces vésicules. Cette approche permet aux chercheurs de reproduire et d’appliquer avec précision la procédure.

Abstract

Les canaux ioniques endolysosomales sont essentiels à l’homéostasie des ions endolysosomales et du pH, à la régulation du potentiel membranaire et au trafic vésiculaire. Cependant, l’accès électrophysiologique à ces canaux dans de petites vésicules intracellulaires a été un défi. Le développement de techniques de patch-clamp endolysosomal a permis de surmonter cet obstacle, permettant de mesurer directement l’activité des canaux ioniques dans les membranes endolysosomales.

Par rapport aux techniques de patch-clamp planaire existantes, le patch-clamp endolysosomal peut enregistrer simultanément plusieurs cellules et se combiner facilement avec d’autres méthodes de mesure. Le fonctionnement manuel offre l’avantage de visualiser des vésicules ciblées. Il aborde également la limitation de la présence indispensable de Ca²⁺ d’un côté de la membrane endolysosomale, augmentant ainsi la flexibilité de la conception expérimentale. L’utilisation de techniques de patch-clamp endolysosomal permet de mesurer et d’analyser directement l’activité des canaux ioniques dans les endolysosomes.

Étant donné le lien étroit entre la fonction aberrante des canaux ioniques endolysosomales et des maladies telles que les maladies neurodégénératives et les troubles métaboliques, l’étude et la modulation de ces canaux pourraient révéler de nouvelles cibles médicamenteuses. En rétablissant l’équilibre ionique intracellulaire, nous pouvons soulager ou guérir les maladies associées. Par conséquent, cette technique est essentielle pour découvrir de nouvelles cibles médicamenteuses et développer des médicaments pertinents.

Introduction

Les canaux ioniques jouent un rôle crucial dans de nombreux processus physiologiques. Alors que les canaux ioniques de surface ont fait l’objet d’une attention considérable, l’importance des canaux intracellulaires, en particulier ceux à l’intérieur des endolysosomes, est progressivement reconnue. Le système endolysosomal est composé d’organites multifonctionnels liés à une membrane spécialisés dans les fonctions cellulaires fondamentales, notamment les endosomes de recyclage (RE), les endosomes précoces (EE), les endosomes tardifs (LE), les lysosomes (LY) et les organites hybrides avec à la fois des caractéristiques endolysosomales et d’autres caractéristiques de compartiment, tels que les phagosomes et les autophagosomes.

L’EE, également connue sous le nom d’endosomes de tri (SE), est l’une des premières destinations des matériaux internalisés à partir de la membrane plasmique (PM). Les EE sont des compartiments critiques responsables du tri de la cargaison dans diverses voies endocytaires, telles que la voie de maturation vers l’EL/LY pour la dégradation, la voie de recyclage rapide vers le PM et la voie de recyclage lente impliquant le compartiment de recyclage ou l’ER périphérique. Les corps multivésiculaires (MVB) dérivés des endosomes sont des compartiments sphériques entourés d’une membrane limitante, qui peuvent être remplis de vésicules intraluminales (ILV)¹. Pour maintenir le fonctionnement normal de ces organites, ils ont besoin de canaux ioniques membranaires pour réguler le pH vésiculaire, l’osmolarité et la transduction du signal. Cependant, il n’est pas simple de mesurer l’activité de ces canaux.

Pour les canaux ioniques situés sur la membrane plasmique, la technique du patch-clamp développée dans les années 1970 a longtemps été la méthode de référence². Cependant, l’accès électrophysiologique aux canaux à l’intérieur de petites vésicules intracellulaires est resté un défi. L’application de l’étalon-or pour la mesure des canaux ioniques sur la membrane plasmique à celle des organites intracellulaires est confrontée à trois défis principaux. Tout d’abord, la taille des endolysosomes est généralement très petite (moins de 1 m de diamètre), ce qui les rend difficiles à observer et à isoler au microscope et plus petite que le diamètre d’ouverture des micropipettes en verre typiques, ce qui rend l’expérience inopérante. Deuxièmement, isoler les endolysosomes directement des cellules cibles tout en maintenant l’intégrité des organites nécessite des compétences particulières. Troisièmement, en raison de l’absence de cytosquelette dans les organites intracellulaires, il peut être difficile de former un joint sur la membrane endolysosomale à l’intérieur de la pipette patch, puis de la rompre pour obtenir une configuration endolysosomique entière, car elle compromet l’intégrité structurelle de l’organite³.

Plusieurs méthodes ont été développées pour surmonter ces problèmes, notamment l’enregistrement des bicouches lipidiques, la modification des séquences de ciblage lysosomale et les techniques d’électrophysiologie membranaire à support solide (SSM ou SSME). La méthode d’enregistrement des bicouches lipidiques consiste à reconstruire des membranes phospholipidiques synthétiques avec des canaux ioniques purifiés, ce qui permet une étude électrophysiologique détaillée de la fonction des protéines membranaires dans des conditions contrôlées ^4,5. La modification des séquences de ciblage lysosomale sur les canaux ioniques implique la redirection des canaux ioniques endolysosomales vers la membrane plasmique pour la mesure à l’aide des méthodes conventionnelles de patch-clamp⁶. Les techniques d’électrophysiologie membranaire à support solide (SSM ou SSME), également connues sous le nom de méthode endolysosomale planaire patch-clamp, utilisent des copeaux de verre planaire à substrat solide avec de petites ouvertures (<1 μm de diamètre) dans des copeaux de borosilicate planaires microstructurés. Ces éclats de verre à petite ouverture permettent d’analyser de petits endolysosomes, même natifs, à l’aide d’un système de contrôle de pression-aspiration (Nanion). Cependant, dans les deux premières méthodes, les canaux ioniques ne sont pas dans leur environnement physiologique naturel. Les tentatives d’enregistrement des canaux lysosomales exprimés sur la membrane plasmique ou reconstitués en bicouches lipidiques ont largement donné des résultats incertains et contradictoires.

Bien que les techniques de patch-clamp planaire aient permis de résoudre efficacement la problématique des interférences artificielles et offrent l’avantage de mesures à haut débit, les solutions utilisées sont également limitées par cette méthode. La technique du patch-clamp endolysosomal présentée dans cet article permet d’enregistrer simultanément plusieurs cellules et de se combiner facilement avec d’autres méthodes de mesure. Le fonctionnement manuel offre l’avantage de visualiser les vésicules cibles. Il permet également de surmonter la limitation inévitable du Ca²⁺ dans la solution d’un côté de la membrane endolysosomale, augmentant ainsi la liberté de conception expérimentale³. Récemment, les techniques de patch-clamp endolysosomal ont joué un rôle clé dans la recherche sur le développement de médicaments. Par exemple, dans les maladies neurodégénératives, cette technique a permis d’identifier de nouveaux médicaments ciblant les canaux ioniques endolysosomaux associés aux maladies d’Alzheimer et de Parkinson ^7,8. Les chercheurs peuvent également utiliser cette technique pour explorer le rôle des canaux ioniques endolysosomales dans les cellules tumorales⁹, contrôlant ainsi la croissance et la prolifération tumorales. En ce qui concerne les maladies métaboliques, des études endolysosomales par patch-clamp révèlent des composés qui régulent les canaux ioniques endolysosomaux, offrant de nouvelles approches de traitement du diabète et de l’obésité. La technique du patch-clamp endolysosomal aide à comprendre le dysfonctionnement endolysosomal et à trouver des thérapies potentielles⁶, améliorant considérablement notre compréhension des fonctions des canaux ioniques endolysosomales et favorisant la découverte de nouvelles cibles médicamenteuses.

Protocol

1. Configuration de l’instrument

1. Matériel
   REMARQUE : Voir la figure 1 pour une configuration standard de l’appareil d’électrophysiologie.
   1. Protégez l’installation des interférences externes à l’aide d’une table et d’une cage de Faraday.
   2. Utilisez un microscope inversé avec un micromanipulateur pour positionner la microélectrode de manière stable.
   3. Installez un amplificateur pour collecter et amplifier les signaux acquis.
   4. Utilisez un numériseur pour convertir les signaux analogiques en signaux numériques.
   5. Utilisez un logiciel d’acquisition et d’analyse de données pour mettre en place des protocoles expérimentaux et extraire des résultats significatifs et analysables des données recueillies.
2. Électrodes
   1. Utilisez deux électrodes : une électrode de bain et une électrode de pipette.
      REMARQUE : Le platine et le chlorure d’argent ont les meilleures propriétés de polarisation. Les électrodes de chlorure d’argent sont constituées de fils ou de pastilles d’argent qui ont été chlorés, ayant ainsi une couche d’AgCl sur la surface externe du fil ou de la pastille (Figure 2).
3. Préparation des pipettes
   1. Tirage
      1. Installez le tube capillaire dans l’extracteur.
         REMARQUE : Les paramètres utilisés ci-dessous pour la fabrication des pipettes sont spécifiques à l’instrument. L’instrument que nous avons utilisé dans cet article est mentionné dans la Table des matériaux.
      2. Dans des conditions expérimentales (température ambiante de 22 °C, filament chauffant en forme traversante, verre borosilicaté avec filament) qui ne brûlent pas le filament chauffant, exécutez un test RAMP sur l’extracteur pour déterminer la valeur calorifique (HEAT) nécessaire pour faire fondre le capillaire en verre.
      3. Concevez un nouveau programme de traction avec six cycles de traction distincts à l’aide des paramètres HEAT, vitesse (VEL) et temps (TIME) (Tableau 1).
         REMARQUE : HEAT fait référence au paramètre qui chauffe le filament de l’appareil de chauffage, permettant au filament de verre de fondre. La vitesse indique la vitesse à laquelle l’extracteur tire le filament dans les deux sens. Le temps représente la durée de l’intervalle entre chaque cycle.
      4. Appuyez sur le bouton vert Pull du clavier.
      5. Desserrez le bouton de serrage et retirez les pipettes de l’extracteur.
      6. Inspectez les pointes de pipette sous l’oculaire de la microforge pour déterminer le diamètre, la netteté et la géométrie de la pointe. Assurez-vous que le diamètre de la pointe est de 0,5 à 0,9 μm.
         REMARQUE : Comme le filament est utilisé plus fréquemment, la valeur thermique nécessaire pour faire fondre le capillaire en verre changera.
      7. Si la taille de l’embout ne répond pas aux attentes, ajustez les paramètres HEAT et VEL. Des températures plus élevées et des vitesses plus rapides produiront des pointes plus fines et plus longues, et vice versa. Ajustez la CHALEUR par incréments de 5 degrés et la vitesse par incréments de 3.
   2. Polissage
      1. Placez les pipettes à patch tirées dans le support de microforge.
      2. Inspectez les pointes de pipette à l’aide d’un objectif 35x (combiné à un oculaire 15x, ce qui permet d’obtenir un grossissement de 525x ).
      3. Utilisez le micromanipulateur pour rapprocher les pipettes patch du filament.
      4. Réglez le cadran de température sur 80.
      5. Utilisez la pédale pour allumer le chauffage et appliquer une brève impulsion de chaleur (1 à 2 s), en surveillant le processus de polissage à travers l’oculaire à microforge.
      6. Répétez le processus jusqu’à ce que toutes les pipettes soient polies.
      7. Placez les pipettes terminées dans une boîte scellée pour empêcher la poussière de pénétrer.
         REMARQUE : L’objectif est de faire fondre rapidement la pointe afin que le verre reforme la géométrie finale de la pointe sans la rendre trop tranchante. Cela empêche la pipette de pénétrer dans la membrane vésiculaire contre laquelle elle est pressée et favorise efficacement la formation d’un joint. Après le polissage final, le chemin intérieur de la pointe de la pipette doit être très étroit, droit et linéaire.
         Les meilleures pipettes d’enregistrement ont généralement une résistance de 5 à 8 MΩ après polissage au feu. Le diamètre de l’ouverture de la pointe doit être de 2 μm. Une pipette patch parfaitement polie est essentielle pour une formation réussie du gigaseal, car il s’agit de l’une des techniques clés cruciales pour le succès de la procédure.

2. Préparation de l’échantillon

1. Culture cellulaire (en utilisant HEK293 comme exemple)
   1. Cultivez les cellules dans un incubateur humidifié standard à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   2. Cultivez les cellules HEK293 dans du DMEM à faible teneur en glucose complété par du sérum de veau fœtal inactivé à 10 % (FBS), de la pénicilline à 100 U/mL et de la streptomycine à 100 mg/mL.
   3. Placez des lamelles de 12 mm recouvertes de poly-L-lysine dans une plaque à 24 puits.
2. Élargissement des organites
   1. Ajoutez 1 μM de vacuoline-1 aux cellules HEK293 dans la plaque à 24 puits (à partir de l’étape 2.1) et incubez à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant la nuit jusqu’à ce que des vésicules élargies commencent à se former.
      REMARQUE : La taille des endolysosomes hypertrophiés peut atteindre 1 à 10 μm, selon l’outil, le composé, le temps d’incubation et le type de cellule (figure 3 et tableau 2).
3. Préparation de la solution
   REMARQUE : La préparation de la solution standard vise à simuler les concentrations ioniques à l’intérieur de la cellule et des organites. Par exemple, les solutions standard pour mesurer les canaux ioniques sur les lysosomes sont les suivantes :
   1. Préparer la solution pour le bain (en mM) : 140 K-méthanesulfonate (MSA), 5 KOH, 4 NaCl, 0,39 CaCl₂, 1 EGTA, 10 HEPES. Ajustez le pH à 7,2 avec du KOH. Ajustez l’osmolarité à 300 mosm/L avec du glucose.
   2. Préparer la solution de pipette (en mM) : 140 Na-MSA, 5 K-MSA, 2 Ca-MSA, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 10 MES. Ajustez le pH à 4,6 avec MSA. Ajustez l’osmolarité à 310 mosm/L avec du glucose.
      REMARQUE : Passez la solution à travers un filtre de 0,2 μm, préparez des aliquotes de 45 mL dans des tubes coniques de 50 mL et conservez-les à 4 °C jusqu’à 2 à 4 semaines.

3. Isolement des organites

1. Retirer une lamelle avec des cellules traitées (voir rubrique 2) de la plaque à 24 puits, la transférer dans la chambre du microscope et ajouter 1 mL de solution de bain.
   REMARQUE : Les cellules ne doivent pas être stockées dans la solution du bain pendant >1 h pour les expériences de patch-clamp endolysosomal entier qui impliquent l’isolement, le scellement et l’enregistrement de l’endolysosome. Après 1 h, les endolysosomes hypertrophiés rétrécissent, adhèrent à la pipette et deviennent difficiles à isoler.
2. Utilisez une aiguille de remplissage en plastique faite maison pour remplir la pipette d’isolement avec la solution de pipette et installez la pipette à l’extrémité avant de la configuration patch-clamp.
3. Réglez l’angle de mouvement diagonal du micromanipulateur pour qu’il soit proche de 30° (valeur d’usine par défaut).
4. Au microscope (objectif 40x et oculaire 10x), examinez les cellules à la recherche d’endosomes suffisamment agrandis ou de lysosomes situés près du bord de la membrane cellulaire pour l’isolement. Déplacez la pipette d’isolement à proximité de la cellule sélectionnée.
5. Abaissez la pipette d’isolement à l’aide du micromanipulateur jusqu’à ce qu’elle touche le bord de la membrane plasmique (Figure 4). Déplacez rapidement la pipette d’isolement horizontalement pour arracher un petit morceau de la membrane plasmique.
6. À l’aide de la même pipette, appuyez sur la cellule du côté opposé pour extraire l’endosome/les lysosomes à une distance de ~2 μm de la cellule.
   REMARQUE : S’il y a une membrane cellulaire résiduelle sur l’organite, cela peut empêcher la formation d’un gigaseal.
7. Examinez l’endolysosome isolé au microscope.

4. Formation gigasseal

1. Remplissez une pipette patch fraîchement polie avec la solution de pipette appropriée et installez la pipette à l’extrémité avant de l’amplificateur.
2. Appliquez une pression positive de 20 à 50 mbar sur la pipette (ou utilisez 0,03 à 0,05 mL d’une seringue de 1 mL pour le contrôle de la pression) et maintenez cette pression (verrouillez la valve).
   REMARQUE : 1 mbar (millibar) = 0,001 bar = 0,1 kPa (kilopascal) = 1 hPa (hectopascal) = 1 000 dyn/cm2.
3. En déplaçant la pointe de la pipette dans la solution du bain, au centre du champ de vision, confirmez que la pression est suffisamment élevée pour voir le liquide s’écouler dans la solution du bain.
4. Appliquez des impulsions de courant répétées (+5 mV ; 5 ms) pour déterminer la résistance de la pipette, la résistance d’étanchéité et la résistance série. Surveiller la taille de la pointe de la pipette, la formation du joint et l’établissement de la configuration endolysosomale entière.
5. Déplacez rapidement la pipette près du haut de la vésicule cible. Approchez la pipette de la vésicule jusqu’à ce que celle-ci se déplace ou roule en raison de l’écoulement du fluide de la pipette (Figure 5).
6. Réglez la tension de décalage de la pipette à 0 mV. Relâchez immédiatement la pression positive. Idéalement, la vésicule sera attirée vers la pipette et se connectera à la membrane, formant un gigaseal (1-20 GΩ) en 1 s.Recherchez une diminution à <10 pA de l’amplitude du courant évoquée par l’impulsion de tension de 5 mV, ce qui indique une formation réussie de gigaseal.
   REMARQUE : Une pression positive stable est essentielle pour la formation de gigaseal. Parfois, des fuites dans le tube peuvent empêcher la formation de gigaseal. Il est recommandé d’utiliser un manomètre pour s’assurer qu’il n’y a pas de fuites. Si une fuite est détectée, rattachez le tube ou appliquez une petite quantité de vaseline sur les coutures pour améliorer l’étanchéité.

5. Mesure du courant

1. Bris de membrane
   REMARQUE : Selon les besoins expérimentaux, le contact électrode-membrane peut être classé en quatre modes : mode attaché à la cellule, mode cellule entière, mode intérieur-extérieur et mode extérieur-extérieur (Figure 6).
   1. Pour l’enregistrement de la vésicule entière, utilisez une impulsion courte à haute tension (impulsion ZAP) de 200 μs ou 500 μs pour briser la membrane au point de contact entre la pipette et l’organite. Réglez la tension de -500 mV à -1 200 mV, en diminuant de 100 mV à chaque fois jusqu’à ce que la membrane soit rompue.
   2. Pour le mode intérieur-extérieur (enregistrement monocanal), après avoir formé le gigaseal, retirez la pipette de l’organite, en arrachant un petit morceau de la membrane, exposant le côté qui faisait à l’origine face à la lumière de la vésicule.
   3. Pour le mode extérieur-extérieur, après avoir formé le gigaseal et être passé au mode vésicule entier, retirez la pipette de l’organite, en arrachant un petit morceau de la membrane tout en conservant une petite structure vésiculaire.
2. Enregistrement en cours
   1. Enregistrez le courant à travers la membrane endolysosomale lorsque la tension d’entrée varie dans les expériences endolysosomales.
      1. Contrôler ces tensions par paliers de tension ou rampes de tension ; utiliser une large gamme de tensions d’entrée (par exemple, -100 mV à +100 mV) dans des expériences de pince de tension endolysosomale.

Results

Ce qui suit décrit les formes actuelles observées lors d’expériences de patch-clamp endolysosomale. Si la forme actuelle n’est pas celle attendue, cela peut être dû à un mauvais contact ou à une fuite. Un mauvais contact peut se produire si l’électrode de référence n’est pas complètement en contact avec la solution du bain ou si l’électrode de la pipette est sur le point de se rompre. Une fuite peut se produire s’il y a un espace entre la chambre et la lamelle permettant au fluide de s’écouler sur la lentille de l’object...

Discussion

Les dispositifs expérimentaux électrophysiologiques ont quatre exigences principales pour les laboratoires : i) environnement : méthodes pour maintenir l’échantillon en bonne santé ; ii) optique : méthodes de visualisation de l’échantillon ; iii) mécanique : méthodes pour positionner de manière stable la microélectrode ; et iv) l’électronique : méthodes d’amplification et d’enregistrement du signal.

Pour réaliser avec succès des expériences de patch-clamp endo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
INSTRUMENT DE SUTTER	EN VERRE BOROSILICATE	BF150-75-10	D.E. :1,5 mm, D.E. 0,75 mm 10 cm de longueur, avec filament
Digidata 1140A	Axon Instruments
Microscope inversé IX73	OLYMPUS
MODEL P-97 Extracteur de micropipettes	SUTTER INSTRUMENT
MPC-200	INSTRUMENT
MultiClamp 700B	Axon Instruments
POLISHER
Chambre de dégagement rapide	Warner instruments	641943	QR-40LP, pour lamelles de 25 mm