$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Conception de la scène et du poteau d’étirement (Figure 1)
- Concevoir un poteau d’étirement dont les dimensions correspondent à la taille de la scène/aux supports et à la configuration de l’objectif. Les deux poteaux d’étirement spécifiques sont illustrés sur la figure 1A,D.
REMARQUE : Les fichiers FreeCAD fournis dans ce protocole (dossier supplémentaire 1) sont compatibles avec les microscopes et platines Nikon suivants : Eclipse Ni-E vertical équipé d’une platine NI-SH-E et Eclipse Ti-E/B inversé équipé d’une platine TI-S-ER, Figure 1D. Le tenon peut être imprimé en trois dimensions (3D) mais peut se déformer après une utilisation répétée ; Les poteaux à base d’aluminium ne souffriront pas de cet inconvénient. Assurez-vous d’anodiser les poteaux à base d’aluminium pour éviter l’oxydation. La configuration verticale permet une plus grande amplitude de mouvement. De plus, une configuration verticale permet une imagerie directe de l’échantillon sans interface, ce qui est optiquement favorable dans le cas du substrat de membrane PDMS déformable. Au lieu de cela, dans une configuration inversée, le faisceau d’éclairage traverse la membrane PDMS (Figure 1F) ; Étant donné que lors de l’application par étirement, la membrane PDMS se déplace, le milieu d’immersion pour l’objectif doit être soigneusement choisi (types d’immersion dans l’eau recommandés, à l’air ou au glycérol ; l’immersion dans l’huile n’est pas recommandée en raison de l’incompatibilité avec les substrats PDMS). Les supports commerciaux peuvent être modifiés à l’aide de trous de vis supplémentaires ; attention à l’utilisation de vis en plastique ou à base de téflon pour éviter la poussière lors du vissage. Il peut être pratique de concevoir un support qui permette de monter le poteau d’étirement sur le dessus de la scène, comme le montre la figure 1E. Le fichier FreeCAD fourni dans ce protocole est compatible avec la platine d’un microscope droit Eclipse Ni-E.
- Concevoir des anneaux d’étirement (Figure 1C) de taille compatible avec le poteau d’étirement (Figure 1A,B). Les fichiers FreeCAD fournis dans ce protocole sont compatibles avec les poteaux correspondants (pour couvrir les anneaux lors de la manipulation des échantillons, leur diamètre peut être choisi pour être compatible avec la taille d’une boîte de Pétri).
REMARQUE : L’anneau peut également être à base d’aluminium (anodisé) ou imprimé en 3D. Inclure des joints d’étanchéité de diamètres adéquats pour sceller sous vide le poteau d’étirement et les anneaux.
- Facultatif : Fabriquer un contrôleur de vide. Une carte électrique du boîtier de commande du vide utilisé dans ce protocole est fournie dans les informations supplémentaires (voir le dossier supplémentaire 2). Il permet de contrôler manuellement le niveau de vide appliqué au dispositif d’étirement.
REMARQUE : Les contrôleurs de vide commerciaux peuvent également fournir des fonctions similaires et peuvent généralement être accompagnés d’un logiciel de contrôle permettant l’application d’une variété de types de signaux (sinusoïdal, triangulaire, etc.) (Fluigent, Cobalt).
2. Fabrication de la membrane extensible
- Concevoir des plaques circulaires (matériau recommandé : polyméthacrylate, PMMA). Assurez-vous que ces plaques sont plus larges que les anneaux et qu’elles sont de la même taille que celle de la machine à revêtir (Figure 2A). Voir le tableau 1 pour les dimensions suggérées et le dossier supplémentaire 3.
REMARQUE : Pour le poteau 1, un diamètre de 12 cm a été utilisé ; pour le poteau 2, un diamètre de 18 à 21 cm. Avant et entre chaque utilisation, les plaques doivent être soigneusement nettoyées à l’aide de lingettes non tissées et d’éthanol à 96 %. Il est important d’éviter l’accumulation de PDMS dans les plaques, ainsi que sur les bords et en dessous.
- Préparez le PDMS 1:10 et mélangez bien pour obtenir une émulsion très homogène (utilisez les cuillères à mélanger recommandées).
REMARQUE : Pour 12 cm, préparez 4,5 g par assiette ; Pour les assiettes de 18 cm, 8 g par assiette. Pour la préparation de plusieurs plaques, préparez des PDMS supplémentaires, par exemple 10 ml de plus que nécessaire pour 10 plaques. Pour 10 assiettes de 12 cm, préparez 50 g du composant A et 5 g du composant B. Il est pratique d’utiliser de grands réceptacles pour pipeter facilement. La prise ne doit pas contenir de poussière ou toute autre saleté qui pourrait entraver l’essorage et le durcissement corrects du PDMS. Utilisez des gants en matériau compatible (évitez le latex ; les gants en vinyle sont appropriés) pour assurer le durcissement PDMS.
- Dégazer pendant au moins 1 h à l’aide d’une chambre à vide.
REMARQUE : Alternativement, le PDMS peut être centrifugé à 0,2 × g pendant 5 min à l’aide d’un tube de 50 mL, mais attention qu’il est compliqué d’aspirer le mélange PDMS d’un tube avec la seringue distributrice (nécessaire pour l’étape 2.4). Ne pas dégazer trop longtemps (pas plus de 2 h) à la lumière directe pour éviter de pré-durcir le PDMS.
- Revêtement de centrifugation PDMS sur le dessus des plaques PMMA
- Distribuez 4,2 ml ou 7,5 ml de PDMS dégazé sur les plaques de PMMA.
- Essorez les plaques en utilisant les réglages recommandés suivants :
- Essorage pendant 5 s à 500 tr/min avec une accélération de 100 tr/min.
- Essorage pendant 1 min à 500 tr/min avec une accélération de 300 tr/min.
REMARQUE : Il peut être pratique de marquer le centre de la plaque PMMA sur sa face inférieure pour assurer le centrage des plaques pendant la filature et la filature homogène. L’étape 2.4.2.1 n’est pas obligatoire, surtout si le paramètre d’accélération ne peut pas être ajusté ; il aide à répartir le PDMS avant de tourner. Ce protocole permet d’obtenir des membranes PDMS d’une épaisseur d’environ 140 μm (mesurée par interférométrie ; voir la figure supplémentaire 1 et le tableau 2). Des étalonnages doivent être effectués avant les expériences au cas où le modèle ou les paramètres de l’enducteur de spin conduirait à des caractéristiques de membrane différentes.
- Conservez chaque plaque dans une boîte de Pétri pour éviter l’accumulation de poussière et polymérisez pendant la nuit à 65 °C à l’intérieur du four.
REMARQUE : Attention à l’utilisation de plats résistants à la température. La condition de durcissement affectera la déformabilité du PDMS pour un niveau de vide donné appliqué.
3. Prise en sandwich de la membrane en anneaux
- Conception du matériel de montage.
- Concevoir des anneaux en PMMA de diamètre interne/externe pour poser la membrane circulaire PDMS à revêtement par centrifugation (Figure 2A). Voir les dimensions proposées dans le tableau 1 et le dossier supplémentaire 3.
- Concevez un support de montage (Figure 2B) sur lequel l’anneau s’adaptera, et la hauteur déterminera également le pré-étirement lors du montage de la membrane dans l’anneau.
REMARQUE : Le support de montage peut être une solution simple basée sur du matériel de laboratoire existant (par exemple, une boîte de Pétri). Une solution plus élégante consiste à imprimer en 3D le support (voir le fichier FreeCAD de cette pièce fourni dans ce protocole, voir le dossier supplémentaire 3), car la hauteur peut être définie par l’utilisateur et facilement modifiée (une hauteur de 10 mm a été utilisée dans ce protocole pour les petits anneaux). La hauteur de la partie centrale du support doit être plus petite que la hauteur de la demi-bague afin que le substrat PDMS ne touche pas le support lors du montage (voir utilisation ultérieure à l’étape 3.4.2). Une imprimante 3D utilisant des filaments d’acide polylactique (PLA) (voir tableau des matériaux) convient à cela. Un anneau coupant peut également être conçu, imprimé en 3D, pour servir de guide au scalpel (Figure 2A).
- Concevoir et fabriquer des poids en laiton de taille compatible pour exercer un poids sur l’anneau lors du montage de la membrane (Figure 2C) et permettre une pré-tension reproductible.
REMARQUE : Les fichiers FreeCAD fournis ici (voir Dossier supplémentaire 3) correspondent aux dimensions de l’anneau présentées dans ce protocole.
- Retirez la membrane PDMS de la plaque PMMA.
- Préparez des anneaux en PMMA sur une feuille de papier blanc.
REMARQUE : Il est important que le banc et le papier restent à plat pour éviter que le papier ne touche la membrane PDMS pendant le montage.
- Faites soigneusement le tour du bord de la plaque à l’aide d’une lame (une ou deux fois), puis tracez le même bord à l’aide d’une pince à épiler tranchante pour vous assurer que le PDMS a une coupe nette sur toute sa circonférence (Figure 2A).
- À l’aide d’une pince à épiler, soulevez délicatement la membrane sur un bord. Ensuite, décollez doucement le bord de la feuille PDMS avec les pouces pour soulever la membrane uniformément sur le bord. Détachez le bord de la membrane de la plaque sur la moitié de la circonférence de la plaque (Figure 2A).
REMARQUE : Verser quelques gouttes d’éthanol à 96 % sous la membrane PDMS aidera à soulever la membrane sans la casser.
- Séchez la membrane PDMS.
- Essuyez de l’éthanol à 96 % sur toute la surface supérieure de l’anneau en PMMA préalablement préparé (étape 3.2.1), en utilisant les doigts pour l’étaler uniformément.
- Retirez délicatement la membrane PDMS, en la soulevant du bord précédemment soulevé (expliqué à l’étape 3.2.3), et placez-la symétriquement sur l’anneau en PMMA recouvert d’éthanol. Enlevez tous les plis du PDMS, mais assurez-vous de ne pas étirer la membrane ; seulement le redresser.
REMARQUE : L’application du pré-étirement à ce stade affectera la déformabilité du PDMS pour un niveau de vide donné appliqué.
- Une fois que l’éthanol est complètement séché, assurez-vous que la membrane PDMS est bien collée à l’anneau en PMMA.
- Assemblez l’anneau extensible.
- Prenez un autre anneau en PMMA vide. Placez-le sur l’anneau de montage et utilisez des clips métalliques pour les sceller ensemble, en prenant en sandwich la membrane PDMS entre les deux anneaux (sandwich de membrane PDMS, Figure 2B).
- Placez la moitié inférieure de l’anneau extensible sur le support de montage conçu à l’étape 3.1.2 (Figure 2B).
- Placez le sandwich d’anneau PDMS sur l’anneau extensible et poussez-le fermement vers le bas jusqu’à ce qu’il atteigne tout le bas. Le substrat PDMS ne touche pas le support de montage. Fixez le joint dans la bonne position (Figure 2B).
- Placez les poids circulaires en laiton sur l’échantillon (Figure 2C). Celle-ci applique une prétension fixe similaire à celle de toutes les bagues montées, assurant une reproductibilité supplémentaire lors de l’étalonnage du système.
- Placez la moitié supérieure de l’anneau d’étirement métallique sur le dessus, avec les trous de vis alignés, placez toutes les vis et serrez (Figure 2C).
REMARQUE : À ce stade, la membrane PDMS a des trous, donc n’essayez pas de démonter ou de revenir en arrière dans le protocole.
- Coupez doucement le PDMS autour de l’anneau à l’aide d’une lame (Figure 2C).
- Couvrir (p. ex., avec une boîte de Pétri) pour protéger la membrane de la poussière (figure 2C).
REMARQUE : Si le PDMS doit être fonctionnalisé avec un gel de polyacrylamide, passez à la section 5. Pour les mesures d’étalonnage initiales, passez à la section 6. Si l’anneau PDMS doit être utilisé pour l’ensemencement cellulaire, passez à la section 7.
4. Variante de la fabrication de la membrane PDMS : modèle une grille de référence
- Préparez une plaque de PMMA (avant le revêtement de centrifugation PDMS) « structurée » avec une grille à base de SU8 créée à l’aide de la photolithographie (Figure 2D). Pour cela, concevez un motif d’intérêt pour créer un film de photomasque (masque en acétate).
REMARQUE : Le fichier pdf fourni dans ce protocole (voir le dossier supplémentaire 4) crée une grille avec des numéros alternatifs ; voir Figure 2D. La grille peut être créée à l’aide d’un logiciel simple tel qu’Inkscape compte tenu de la taille du motif (ou d’alternatives telles que Clewin ou FreeCAD). Le design peut être imprimé par des sociétés externes sur des films photographiques (voir la table des matériaux).
- Protocole de photolithographie sur la plaque PMMA (voir Dossier supplémentaire 3 pour les propriétés optiques du PMMA).
- Effectuez un traitement plasma à l’oxygène des plaques PMMA pendant 20 min à 7 W avec un débit d’oxygène constant de 0,8 bar.
REMARQUE : Assurez-vous que la protection plastique possible des plaques est retirée et que les plaques PMMA sont complètement transparentes.
- Cuire au four pendant 5 min à 95 °C.
- Refroidissez la plaque de PMMA à l’aide d’un pistolet à azote, puis placez 4 ml de résine SU-8 2100 sur la plaque de PMMA de 12 cm (ajustez le volume si vous utilisez des plaques de différentes tailles).
- Essorez avec les paramètres suivants (ou ajustez les paramètres de rotation pour créer une couche d’environ 10 μm de haut) : 5 s à 500 tr/min avec une accélération de 100 tr/min suivie de 30 s à 4000 tr/min avec une accélération de 300 tr/min.
- Cuire au four pendant 2,5 min à 95 °C.
- Placez la plaque PMMA sur un aligneur de masque en présence du masque en acétate et utilisez les paramètres suivants : sans i-line. Exposition large bande (entre 260 et 460 nm), 25 mW/cm2, exposition de 7,5 s.
- Cuire au four pendant 3,5 min à 95 °C.
- Développer le motif pendant 1 min avec de l’acétate de monométhyléther de propylène glycol.
- Laver abondamment avec de l’isopropanol.
- Effectuez une vérification visuelle de la qualité du motif à l’aide d’un objectif à faible grossissement (2-10x) dans un microscope à fond clair.
REMARQUE : La silanisation de la plaque à motif PMMA augmente la longévité du motif pour une utilisation répétée. Pour cela, activez la plaque PMMA à motifs pendant 30 s avec un traitement au plasma d’oxygène, puis effectuez un traitement de 1 h avec du trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane sous vide dans un capot chimique.
- Utilisez la plaque PMMA à motifs comme aux étapes 2.2 à 2.5 pour appliquer une couche de mousse sur la membrane extensible PDMS.
REMARQUE : Le PDMS à motifs peut être visualisé dans un microscope à fond clair, comme mentionné précédemment, ainsi que dans un microscope électronique à balayage (Figure 2D). Attention quel côté du motif est orienté vers le haut lors du montage de la membrane PDMS dans l’anneau d’étirement pour obtenir le motif dans l’orientation souhaitée.
5. Fixation d’un gel de polyacrylamide (PAA) sur la membrane PDMS
REMARQUE : Cette étape peut être effectuée soit sur la membrane PDMS fixée à la plaque PMMA (voir section 2), soit sur les anneaux étirables précédemment montés (voir section 3). Travailler sous une hotte chimique ; pour les étapes impliquant le chauffage, il est pratique d’utiliser un petit four s’adaptant sous le capot chimique, voir le tableau des matériaux ; sinon, conservez les échantillons dans une boîte hermétique au four).
- Prérevêtement de la membrane PDMS (Figure 2E)
- Préparez la solution d’enrobage en mélangeant de l’éthanol à 96 % avec du triéthoxysilane à 10 % (3-aminopropyl)triéthoxysilane (APTES) dans un tube de microcentrifugation (p. ex., 20 μL d’APTES dans 180 μL d’éthanol).
- Activez les membranes PDMS avec un déchargeur de plasma corona pendant 1 min (ou activez-les pendant 30 s à l’aide d’un nettoyeur plasma d’oxygène).
- Placez 200 μL de la solution APTES/éthanol au centre de la membrane.
- Laissez la membrane à 65 °C à l’intérieur du four pendant 1 h.
- Laver deux fois avec du PBS. Pour le deuxième lavage, laissez le PBS pendant 10 min en secouant.
- Préparez la solution de glutaraldéhyde (GA) à 3 % dans du PBS. Placer 200 μL de GA par membrane sur la même région de la membrane traitée avec APTES.
- Attendez 25 min (pas plus de 30 min).
- Lavez deux fois avec du PBS, la deuxième fois en secouant.
- Aspirez le liquide et placez l’anneau en position inclinée, jusqu’à ce que le PBS soit totalement sec.
- Silanisation des lamelles
- Préparez 6 ml de Silane Repel et versez-le dans une boîte de Pétri.
- Placez soigneusement des lamelles carrées en verre de 18 mm dans le liquide, une par une.
- Incuber les lamelles pendant 5 min.
- Préparez deux béchers ; l’un contenant 96 % d’éthanol et l’autre de l’eau ultra-pure.
- Retirez la lamelle du Repel Silane à l’aide d’une pince à épiler et lavez-la d’abord à l’éthanol à 96 %, puis à l’eau ultra-pure (la lamelle doit ressortir « sèche » du lavage à l’eau).
- Laisser sécher 30 minutes supplémentaires au bord d’une boîte de Pétri.
- Fixation du gel de polyacrylamide (PAA) sur la membrane PDMS
- Disposez la moitié des lamelles traitées au Silane Repel au fond d’une boîte de Pétri.
- Préparez un mélange de gel PAA de la rigidité souhaitée 16,18.
- Déposer une goutte de 10 μL de mélange de gel sur chaque lamelle.
- Placez une autre lamelle traitée Repel Silane sur le dessus pour étaler le gel. N’alignez pas les deux lamelles. Assurez-vous qu’ils sont disposés en forme d’étoile pour faciliter la séparation. Appuyez doucement pour que le gel soit aplati mais ne dépasse pas la zone de la lamelle.
- Attendre 45 min à 1 h.
- Séparez délicatement les lamelles à l’aide d’une pince à épiler. Assurez-vous que le gel reste attaché à l’une des lamelles.
- Prenez la lamelle sur laquelle le gel est fixé et placez le gel en contact avec la zone PDMS précédemment traitée avec GA (Figure 2E).
- Appuyez avec deux doigts en partant du bas et du haut pendant 5 s.
- Incuber à 37 °C pendant la nuit.
- Le lendemain, remplissez l’anneau de PBS pendant 30 min.
- Détachez délicatement la lamelle supérieure à l’aide d’une pince à épiler.
- Tracez le périmètre du gel PAA avec un marqueur permanent de l’autre côté de la membrane PDMS. Cela permet de localiser l’échantillon dans les étapes suivantes.
- Aspirer le PBS.
- Effectuer une étape de fonctionnalisation pour faciliter la fixation de la protéine de la matrice extracellulaire souhaitée au gel15.
6. Fonctionnement du dispositif d’étirement, étalonnage de la déformation et évaluation de la résolution
- Préparez un anneau d’étirement PDMS avec des billes fluorescentes pour l’étalonnage de la déformation.
- Préparer une dilution 1:50000 d’une bille fluorescente de 0,1 μm ou 0,2 μm (voir le Tableau des matières) dans une solution saline tampon phosphate (PBS) par dilution en série (solution intermédiaire 1:500 de 1 mL dans du PBS avec 2 μL de la solution mère de billes suivie d’une dilution finale de 10 μL de la solution intermédiaire dans 1 mL de PBS).
REMARQUE : Une densité de cordon élevée sur la membrane est optimale pour l’étape d’étalonnage ; Ne pas sonicer la solution, car les amas de billes facilitent l’opération pendant l’étalonnage.
- Placez une goutte de 10 à 30 μL au centre du PDMS.
REMARQUE : Le support de montage peut être conçu de manière pratique avec un dépôt d’échantillon croisé à centre
- Laisser sécher à une température ne dépassant pas 40 °C pour éviter les problèmes de confusion post-durcissement.
- Préparez un anneau extensible PDMS avec des billes fluorescentes pour l’évaluation de la résolution.
- Suivez le protocole de Cole et al.19 pour préparer la solution de billes en utilisant des billes dont le diamètre est inférieur à la limite de diffraction, généralement des billes de 0,1 m de diamètre.
(voir Tableau des matériaux). Soniquez soigneusement les solutions de cordon à chaque étape intermédiaire.
- Utilisez le traitement corona au centre de l’anneau pour activer le substrat PDMS.
- Étalez immédiatement 20 μL de la solution de billes sur la zone centrale du PDMS traité et laissez-la sécher.
REMARQUE : Dans ce cas, la solution de billes est fortement diluée et incubée sur le PDMS hydrophile pour assurer un étalement étendu et obtenir des billes de 0,1 μm isolées isolées adsorbées sur le substrat.
- Montage de l’appareil d’étirement sur le support de platine de microscope (Figure 1F).
- Montez le poteau d’étirement dans le microscope.
- Appliquez généreusement du lubrifiant (vaseline) sur la zone circulaire du tenon (partie centrale, Figure 1D, F).
REMARQUE : L’utilisation du lubrifiant est obligatoire pour que le substrat PDMS surmonte les frottements et glisse sur le poteau, et il est nécessaire de rafraîchir le lubrifiant entre chaque échantillon. La vaseline est utilisée comme un lubrifiant très pratique dans la configuration présentée dans ce protocole.
- Montez l’anneau d’étirement préparé à l’étape 6.1 dans le poteau d’étirement et vissez le capuchon supérieur pour sceller l’ensemble.
- Connectez le contrôleur de vide à la source d’aspiration et au poteau d’étirement (Figure 3A).
- Connectez l’arrière du boîtier de commande de vide à la source de vide (Figure 3A).
- Connectez l’avant de la boîte au poteau d’étirement (Figure 1B, D, F).
REMARQUE : La source de vide peut être la ligne de vide disponible dans l’infrastructure du bâtiment. Un vide modéré est nécessaire pour un étirement suffisant, mais dépend du diamètre de l’anneau d’étirement (une déformation plus petite sera obtenue au même niveau de vide pour un diamètre plus petit). Alternativement, des pompes à vide sont disponibles dans le commerce (Fluigent ou Elveflow fournissent des pompes à vide autonomes) ; Dans ce cas, suivez les instructions du fabricant pour la connexion à la source d’aspiration. N’utilisez pas une alimentation en vide sans une source contrôlée par le vide (comme le boîtier de contrôle du vide sur mesure présenté dans ce protocole ou les systèmes disponibles dans le commerce)
- Calibrage de la déformation
- Choisissez un champ d’intérêt qui comprend une densité de billes élevée sur tout le champ de vision et des amas de billes reconnaissables pour l’utilisateur (voir Figure 3B).
- Acquérir une image « au repos » du champ de vision choisi (enregistrer la position).
- Appliquez l’étirement à un faible niveau de vide (dans cette configuration, -20 mbar). L’échantillon se déplacera dans toutes les directions (X-Y-Z).
- Refaites d’abord la mise au point dans le plan z.
- Déplacez la platine dans les directions x-y pour trouver la même région d’intérêt que celle imagée au repos, affinez la mise au point de l’image des perles à l’état étiré et acquérez une image.
REMARQUE : Si l’échantillon est très décentré, la région d’intérêt se déplacera considérablement, en fonction de l’amplitude de la déformation. Le déplacement sera plus important par rapport au centre, mais l’amplitude de la déformation est indépendante de l’emplacement de l’échantillon sur le substrat. Enregistrez des images sans binning, avec une résolution de 2048 x 2048.
- Relâchez la tension. Répétez les étapes 6.4.3-6.4.5 avec un niveau de vide plus élevé (-30 mbar, -40 mbar, etc.).
REMARQUE : À des fins d’étalonnage, revenez toujours à l’état de repos avant de réétirer (voir Figure supplémentaire 3A), car le PDMS a un comportement d’hystérésis lors de la déformation.
- Montez un deuxième anneau d’étirement et répétez les étapes 6.4.1 à 6.4.6. Effectuez ce calibrage pour au moins 3 bagues d’étirement différentes.
- Stockez les images acquises dans un dossier organisé par échantillon.
- Dans chaque dossier, nommez l’image de perle de référence acquise au reference_str1 de repos, et les images étirées à l’augmentation du vide stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3, etc.
REMARQUE : Cette étape constitue l’étalonnage de base du système. En fonction des besoins de l’utilisateur, un étalonnage supplémentaire à l’aide d’échantillons de billes similaires mais à l’aide d’autres protocoles d’application du vide doit être effectué. Appliquer un protocole de souche ressemblant à la souche appliquée à l’échantillon biologique (voir la section des résultats représentatifs).
- Utilisez le code Matlab pour quantifier la déformation20.
- Téléchargez l’intégralité du dossier Matlab en cliquant sur le lien suivant https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
REMARQUE : Le code principal à exécuter est nommé gel_strain et appelle d’autres fichiers de code Matlab qui doivent être conservés tels quels, stockés dans le même dossier que le code principal.
- Ouvrez Matlab et ouvrez le code gel_strain.
- Définissez les paramètres (voir le tableau 3 Code_Parameter pour les paramètres recommandés).
- Définissez les chemins d’accès aux dossiers parent et d’expérience comme indiqué dans le code.
REMARQUE : Si le dossier n’existe pas, le code affichera une fenêtre contextuelle d’avertissement ; Sélectionnez Ajouter au chemin d’accès et naviguez jusqu’au dossier expérimental où les images sont stockées.
- Exécutez le code gel_strain .
- Ouvrez stretched_str1 comme demandé par le code.
- Ouvrez reference_str1 comme demandé par le code.
REMARQUE : Il est pratique de traiter toutes les images étirées à différents niveaux de vide à la fois, comme indiqué dans ce protocole ; Tous les fichiers doivent être stockés dans le même dossier expérimental, mais le code ne demande qu’à ouvrir la première image étirée. Les noms d’images doivent se terminer par des noms strX, X étant des nombres incrémentiels 1, 2, 3, etc., comme indiqué au point 6.4.9 de ce chapitre.
- Vérifiez que le dossier des résultats apparaît avec les 4 sous-dossiers : Croppeddata contenant les données recadrées et alignées ; Déplacements contenant le fichier de déplacement de talon ; Images contenant le tracé des déplacements radiaux et de la déformation ; Déformations contenant la feuille de calcul de la matrice de déformation obtenue pour chaque niveau de vide.
- Calculez la médiane de la matrice de déformation pour chaque niveau de vide.
- Répétez l’opération pour chaque échantillon (3 minimum).
- Tracez la matrice de déformation médiane en fonction du niveau de vide pour les 3 échantillons afin d’obtenir la courbe d’étalonnage (Figure 3C).
REMARQUE : Quelques paramètres peuvent être modifiés dans le cas où l’image de la perle n’est pas correctement traitée à partir du code. Pour ce faire, ouvrez le fichier set_settings_stretch dans Matlab et modifiez Settings.Resolution et Settings.Overlap selon les recommandations des commentaires de code (voir également le tableau 3). En fonction des besoins expérimentaux, la déformation appliquée à l’échantillon biologique peut être variée (déformation cyclique, déformation plus importante, etc.) : un étalonnage de ces conditions est recommandé (voir exemples dans la figure supplémentaire 2 et la figure supplémentaire 3).
- Évaluation de la résolution (suivre le protocole de Cole et al.19)
- Montez l’anneau extensible préparé à l’étape 6.2.
- Imagez un champ de vision contenant des points de perles simples (imaginez une pile avec une distance de pas Z pertinente pour l’objectif utilisé).
- Utilisez MetroloJ (plug-in Fidji), comme indiqué dans Cole et al., pour caractériser la résolution X-Y-Z de la configuration d’étirement (Figure 3D et Figure supplémentaire 4).
7. Ensemencement et étirement des cellules
- Revêtement du PDMS avec une protéine d’adhésion cellulaire
- Stérilisez l’anneau PDMS en l’exposant à la lumière UV pendant 15 min (Figure 4A). Effectuez toutes les étapes ultérieures du protocole sous le biohood pour assurer la stérilité.
- Rincez la plaque sous le capot avec du PBS stérile.
- Incuber une protéine d’adhésion cellulaire 11,14,15 en déposant une goutte de 100 à 200 μL de la solution au centre du cycle (Figure 4A).
REMARQUE : Généralement, une solution de 10 μg / mL de fibronectine est appropriée11. D’autres protéines d’adhésion d’intérêt peuvent être utilisées pour enrober le PDMS (p. ex., laminine, kératine15 ; des traitements/protocoles spécifiques peuvent être nécessaires). L’incubation pour l’enrobage de fibronectine est recommandée pendant la nuit à 4 °C ; la méthode alternative est de 1 h à 37 °C.
- Tracez le périmètre de la chute avec un marqueur permanent à partir de la face inférieure de la membrane PDMS. Cela permet de localiser l’échantillon dans les étapes suivantes.
- Ensemencement cellulaire sur l’anneau PDMS (Figure 4A).
- Si nécessaire, transfectez les cellules d’intérêt avec une protéine fluorescente avant l’expérience d’étirement (pour les transfections transitoires, 1 à 3 jours avant l’expérience, selon la méthode de transfection et les caractéristiques) ou utilisez des protocoles spécifiques pour visualiser les marqueurs fluorescents d’intérêt.
REMARQUE : Pour les expériences initiales, il est pratique d’utiliser un marqueur de membrane plasmique tel que GFP-mem11,12 pour visualiser la réponse de la membrane cellulaire et les ruptures potentielles. Le marqueur est facile à transfecter, et il est conseillé d’étirer les cellules transfectées à des niveaux de déformation croissants pour évaluer le seuil de déformation qui conduira à la rupture de la membrane plasmique. Voir la carte plasmidique dans le dossier supplémentaire 5. Cela dépend du type de cellule et sera plus faible dans les expériences sur cellule unique par rapport aux monocouches cellulaires. Ce marqueur membranaire est compatible avec l’étirement cellulaire, contrairement à certains colorants d’insertion membranaire qui ont été observés pour entraîner une rupture de la membrane plasmique à de faibles niveaux d’étirement.
- Le jour de l’expérience, réchauffez les milieux cellulaires et préparez des milieux indépendants du CO2.
REMARQUE : Si le microscope dispose d’un contrôle du CO2 compatible avec le système d’étirement, les expériences peuvent être réalisées dans des milieux de culture cellulaire réguliers (ce serait une configuration nécessaire pour les échantillons délicats qui ne peuvent pas survivre dans des milieux indépendants du CO2). Il est recommandé de prendre un supplément indépendant du CO2 avec un agent anti-blanchiment (par exemple, pour les protéines GFP, un supplément de rutine21 à 10 mg/mL).
- Trypsinisez les cellules et comptez-les.
- Ensemencer un nombre approprié de cellules dans un petit volume (20-50 μL) avec un milieu cellulaire standard pour favoriser la fixation des cellules et les conserver dans un incubateur à humidité contrôlée en CO2.
REMARQUE : Pour les fibroblastes plats et grands et les expériences sur cellules uniques, 5000 cellules ; Les nombres dépendent du type de cellule et de l’expérience elle-même.
- Après une incubation de 20 à 30 minutes (vérifiez la fixation initiale de la cellule), ajoutez doucement un milieu de 500 μL sur les cellules. Remettez-le dans l’incubateur pour permettre une propagation supplémentaire des cellules.
REMARQUE : Le temps d’ensemencement dépend du type de cellule et des exigences expérimentales ; La formation d’une monocouche avec incubation pendant la nuit est également possible. Le volume des milieux de culture doit être ajusté en conséquence. Coloration cellulaire secondaire : une fois fixées, les cellules peuvent être colorées avec un colorant tel que SpyDNA (voir Tableau des matériaux) pour visualiser les noyaux (Figure supplémentaire 5) ou une autre coloration pour visualiser toute structure d’intérêt. Méfiez-vous toujours du fait que la coloration des cellules vivantes ou la surexpression des protéines par transfection peuvent affecter la réponse cellulaire à l’étirement, en particulier au niveau du cortex cellulaire, de la membrane plasmique ou des protéines/structures mécanosensibles.
- Passez à des fluides indépendants du CO2 et utilisez-les immédiatement dans l’appareil d’étirement.
REMARQUE : Maintenant, l’échantillon est prêt pour une expérience d’étirement.
- Expérience d’étirement cellulaire : exemple d’un cycle d’étirement-libération unique et imagerie de la membrane plasmique (PM) pour capturer le remodelage dynamique des fibroblastes.
- Montez la bague d’étirement sur la platine du microscope comme indiqué au chapitre 6, étape 6.2.
- Trouvez une cellule d’intérêt, notez sa position et prenez une image de la cellule pré-étirée (Figure 4B).
- Appliquez le vide souhaité qui, selon la courbe d’étalonnage, correspond à la déformation du substrat souhaitée.
- Pour trouver la cellule étirée, commencez par réorienter la mise au point en Z, puis déplacez-vous dans la direction X-Y pour trouver et recentrer la cellule dans le champ de vision.
- Enregistrez des images pendant la durée souhaitée (Figure 4B).
REMARQUE : Des expériences initiales sont généralement nécessaires pour déterminer la réponse cellulaire à la déformation en traction en fonction de son type (en moyenne). Étirez les cellules à différentes souches de substrat pour déterminer la charge d’extension maximale qu’elles peuvent supporter. La rupture de la membrane plasmique se produira, comme le montre le marqueur de membrane fluorescente de la membrane plasmique, si la tension est excessive pour la cellule.
- Pour la libération de la cellule, revenez à la position de la cellule au repos et activez le mode d’acquisition du microscope pour vous assurer que l’acquisition peut commencer dès que l’échantillon a été refocalisé.
- Relâchez l’étirement et refaites rapidement la mise au point manuellement en Z.
- Enregistrez des images de la cellule libérée pendant la durée souhaitée (Figure 4B). En raison de la nature flexible de la membrane PDMS, l’échantillon se défocalise facilement avec le temps. Par conséquent, ajustez manuellement la mise au point tout au long de l’acquisition de l’image.
REMARQUE : Pour réussir à refaire la mise au point pendant l’imagerie après le relâchement, les images doivent être visualisées assez souvent ; Une imagerie vidéo de 3 à 5 minutes toutes les 3 s est raisonnable. Le substrat PDMS n’est pas compatible avec le système de mise au point parfaite du microscope, de sorte qu’un réglage manuel par l’utilisateur pour une acquisition rapide est généralement nécessaire. La mise au point logicielle peut être réglée, mais méfiez-vous des erreurs possibles et des mouvements importants de la scène qui peuvent endommager l’objectif en heurtant une pièce de poteau d’étirement. L’utilisateur peut décider d’effectuer plusieurs étirements de l’échantillon en fonction de l’expérience.
- Post-traitement : Aligner les images à l’aide des Fidji
- Ouvrez les images au repos et filtrez.
- Utilisez la correspondance du modèle de plug-in Fidji et sélectionnez une région de la cellule à aligner (Figure 4C).
REMARQUE : Les déplacements relatifs de l’image de déformation alignée sont rendus par Fidji, et les images sont recadrées et alignées. Téléchargez le plugin template_matching à partir de ce lien : https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin
8. Ensemencement cellulaire sur un substrat pré-étiré
- Montez l’anneau étiré recouvert de la protéine d’adhésion dans le dispositif d’étirement.
- Étirez le substrat PDMS jusqu’au niveau de déformation souhaité.
- Ensemencez les cellules comme dans la section 7.
REMARQUE : Dans cette expérience, l’ensemencement n’est pas effectué dans des conditions stériles, de sorte que le protocole peut ne pas convenir à tous les types de cellules.
- Une fois que les cellules ont adhéré, remplacez le média par un média indépendant du CO2.
REMARQUE : Choisissez des cellules à adhérence rapide pour minimiser le temps d’adhérence.
- Après le temps d’incubation souhaité, relâchez l’étirement et imagez une cellule d’intérêt.
REMARQUE : Dans cette étape, il est difficile de trouver une même cellule après la libération de l’étirement, car la position de la cellule au repos est inconnue et le mouvement du substrat PDMS n’est pas facilement prévisible.
9. Fixation des cellules étirées ou détendues
- Fixer les cellules dans des états étirés (travail sous capot chimique)
REMARQUE : Le paraformaldéhyde (PFA) est un agent de fixation standard ; utilisez-le à chaud à 37 °C pour assurer une fixation rapide. Alternativement, la solution de glyoxal22 permet une fixation rapide de l’échantillon avec une bonne conservation de l’échantillon.
- Préparez l’agent de fixation.
- Grainez les cellules sur les anneaux en suivant l’étape 7.2.
- Montez le poteau d’étirement et le contrôleur à l’intérieur d’une hotte chimique et connectez-vous à l’alimentation en vide.
- Placez l’anneau avec les cellules ensemencées dans le poteau d’étirement.
- Pour corriger l’état étiré, étirez jusqu’à la déformation souhaitée. Retirer le milieu de culture cellulaire et fixer en ajoutant la solution de PFA à 4 % dans les cellules pendant 10 min à 37 °C. Ensuite, lavez avec du PBS, en tenant toujours l’étirement. Relâchez lentement l’aspirateur et lavez avec plus de PBS.
REMARQUE : N’oubliez pas de préparer un état de contrôle non extensible (pour cela, un petit morceau de PDMS peut être coupé et séché avec une petite quantité de solution d’éthanol à 96 % en dessous, sur une lamelle en verre). Pour imager l’échantillon fixe, il est recommandé d’étirer l’échantillon à la même amplité. Comme le PFA est toxique, des précautions adéquates doivent être prises à cette étape. Il est pratique d’utiliser un petit four qui peut être conservé sous le capot, voir le tableau des matériaux).
- Imagez l’échantillon, de préférence en appliquant à nouveau le vide, au même niveau que celui utilisé lors de la fixation, ce qui garantit la « réactivation » de l’échantillon (Figure 4D).
- Fixer la cellule après l’étirement (travailler sous le capot chimique).
- Étirez les cellules à la tension et au temps souhaités. Juste avant la libération par étirement, retirez la majeure partie du support sans sécher complètement l’échantillon et libérez la souche. Vous pouvez également appliquer un étirement cyclique d’une durée spécifique.
- Retirez rapidement le support et fixez-le immédiatement avec la solution fixative pendant 10 min. Laver avec PBS et image.
REMARQUE : L’échantillon peut également être ensemencé sur un substrat pré-étiré et, après un temps de semis défini par l’utilisateur, fixé après le démoulage post-étirement comme à l’étape 9.2.2.
- Immunofluorescence de l’échantillon fixé : suivre les protocoles standard d’immunofluorescence sur étiré ou relâché ; Le blocage avec de la gélatine de poisson est préférable au BSA17.
- Imagez l’échantillon (Figure 4E).
- Conservation des échantillons
- Préparez les supports de montage pour la conservation des échantillons (Mowiol ou Prolong).
- Retirez le PBS et ajoutez une goutte (environ 75 μL) de support de montage.
- Prenez une lamelle à l’aide d’une pince à épiler et placez-la délicatement sur le dessus (évitez les bulles, qui gêneraient la visualisation).
- Sécher pendant au moins 48 h à température ambiante (RT).
- Découpez autour de l’échantillon fixe PDMS et montez-le sur une autre lamelle en verre pour une imagerie ultérieure.
REMARQUE : Cette étape n’est pas compatible avec la post-imagerie de l’échantillon sur la membrane étirée car le montage de la membrane PDMS sur une lamelle avec le milieu de conservation implique la préservation de la membrane dans son état détendu uniquement.
10. Fixation avec la grille pour l’imagerie de la même zone d’échantillon dans différents modes - l’imagerie MEB à titre d’exemple
REMARQUE : Ce protocole peut être utilisé pour imager la même cellule unique dans deux microscopes différents, la microscopie à fluorescence et la microscopie électronique à balayage, comme présenté ici. L’imagerie corrélative nécessite un traitement d’image avancé qui n’entre pas dans le champ d’application de ce protocole. D’autres applications utiles peuvent être, par exemple, la visualisation de l’échantillon en mode vivant, la fixation supplémentaire sous le capot et la visualisation de la même cellule après immunocoloration (le protocole utilisé pour la figure supplémentaire 5).
- Préparez un anneau extensible à l’aide des plaques PMMA à motifs de la section 4.
- Ensemencez les cellules comme à l’étape 7.2.
REMARQUE : Sachez que la solution de revêtement doit être soigneusement appliquée pour assurer une couverture complète du PDMS, même dans les petits trous de la grille.
- Fixer comme décrit dans la section 8 mais en utilisant un fixateur approprié et un protocole compatible avec l’imagerie par microscopie d’échantillon et électronique.
REMARQUE : Si vous utilisez un mélange de PFA + glutaraldéhyde (par exemple, 2 % -2,5 %), méfiez-vous de l’autofluorescence provenant de la présence de réactif de glutaraldéhyde et effectuez éventuellement une étaped’extinction 23.
- Imagez l’échantillon en mode fluorescence et enregistrez la position de la cellule (imprimez la grille et notez la position avec une croix, par exemple).
- Une fois toutes les images prises, préparez l’échantillon pour l’EM en coupant d’abord le PDMS autour de l’échantillon (en retirant préalablement le lubrifiant).
- Traitez la membrane PDMS + l’échantillon pour la microscopie électronique à balayage (ce qui implique un protocole standard de déshydratation de l’échantillon et de pulvérisation de métal)12.
- Lors de l’imagerie au microscope MEB, trouvez les positions de la grille et recherchez les cellules précédemment imagées en mode fluorescent (Figure 4F,G).