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Article de méthode

Cartographie mécanique des sphéroïdes à l’aide de la spectroscopie de Brillouin

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DOI :

10.3791/67538

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12 décembre 2025

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1Centre for the Cellular Microenvironment, Advanced Research Centre, 11 Chapel Lane, University of Glasgow, 2LightMachinery Inc.

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit un protocole de caractérisation mécanique des sphéroïdes vivants au sein d’une matrice 3D à l’aide de la micro-spectroscopie de Brillouin. Cette méthode entièrement optique permet la visualisation des sphéroïdes avec une résolution à l’échelle microscopique et des propriétés mécaniques quantitatives. Cette approche a des implications pour le phénotypage mécanique ; par exemple, déterminer les états pathologiques des sphéroïdes tumoraux dans un microenvironnement 3D.

Résumé

La spectroscopie de Brillouin, une technique émergente suscitant un intérêt significatif en sciences biomédicales, permet aux chercheurs de recueillir des informations liées à la mécanique et à la structure en interrogeant les propriétés viscoélastiques et architecturales des échantillons de manière non destructive et sans contact. Cette approche évalue les propriétés mécaniques des échantillons 3D en mesurant l’interaction de la lumière visible avec les ondes/phonons acoustiques thermiquement induits. Les informations fournies par la spectroscopie de Brillouin ont un potentiel d’évaluation in vivo de la biophysique et de diagnostic potentiel des pathologies pathologiques. Un avantage significatif de la spectroscopie de Brillouin est la capacité d’évaluer la mécanique à l’échelle microscopique à l’intérieur d’un échantillon biologique ; d’autres techniques conventionnelles pouvant atteindre cette résolution, comme la microscopie à force atomique, ne peuvent sonder les échantillons qu’en 2D puisqu’elles nécessitent un contact direct. Ce travail décrit l’application de la micro-spectroscopie de Brillouin pour étudier la biomécanique des sphéroïdes vivants intégrés dans une matrice hydrogel 3D. L’encapsulation des sphéroïdes cellulaires dans un microenvironnement 3D établit un système sphéroïde qui récapitule de près l’interface entre les cellules et la matrice extracellulaire in vivo. Dans notre protocole, nous décrivons la préparation des échantillons sphéroïdes et les mesures des spectres de Brillouin par imagerie séquentielle par fluorescence. De plus, nous discutons des procédures d’analyse des données spectrales et des détails techniques concernant le système optique.

Introduction

La culture des cellules dans des modèles 3D est avantageuse par rapport aux méthodes typiques de culture cellulaire 2D, car elle récapitule mieux les structures tissulaires et les interactions cellulaire-cellule présentes in vivo. Les sphéroïdes sont des agrégats cellulaires 3D qui facilitent des interactions complexes entre cellules ; Ces interactions sont compromises dans les cellules cultivées en monocouche sur des cultures tissulaires plastiques. Les sphéroïdes peuvent être cultivés dans un échafaud qui imite le microenvironnement d’où la cellule est originaire. Par exemple, les hydrogels sont un biomatériau populaire utilisé pour cultiver des cellules/sphéroïdes car ils permettent un contrôle précis de paramètres tels que la rigidité, la dégradabilité, la taille des pores et l’intégration de facteurs de croissance1 (Figure 1A). Des indices mécaniques précèdent souvent les changements biochimiques dans les pathologies de la maladie telles que le cancer etla fibrose 2,3, par conséquent, l’acquisition de la signature biomécanique dans des modèles 3D cliniquement pertinents de la maladie est essentielle pour développer des interventions diagnostiques éclairant la pratique thérapeutique et comprendre la physiopathologiesous-jacente 4.

La microscopie de Brillouin (BM) est une technique d’imagerie qui permet de mesurer les propriétés mécaniques des matériaux biologiques dans des plans2D 5,6,7. La BM présente certains avantages clés par rapport à d’autres méthodes plus couramment utilisées, telles que la microscopie à force atomique (AFM) et l’élastographie. Il est bien documenté que l’AFM peut atteindre une haute résolution mécanique spatiotemporelle et que l’élastographie peut sonder la mécanique à l’intérieur des échantillons 8,9. La BM ne nécessite pas un contact direct avec le matériau étudié, ce qui en fait une technique idéale par rapport à l’AFM pour des échantillons/cellules difficiles d’accès, comme les sphéroïdes dans les hydrogels. Un autre avantage clé de la BM est qu’elle ne nécessite pas d’étiquetage des échantillons et peut fournir une résolution à l’échelle microscopique à l’intérieur des échantillons biologiques, ce que les méthodes d’élastographie couramment utilisées ne peuvent pasatteindre 7 ; Des techniques d’élastographie optique plus avancées peuvent fonctionner à la résolutionà l’échelle microscopique 10. Il convient de noter que la résolution effective précise dans l’imagerie de Brillouin d’échantillons biologiques hétérogènes n’est pas triviale à définir. Premièrement, pour une longueur d’onde d’illumination donnée, cela dépend des propriétés optiques décrivant la taille du point focal (ouverture numérique, NA, de l’objectif et de l’opacité de l’échantillon). De plus, la précision avec laquelle les propriétés mécaniques de l’échantillon peuvent être sondées, ainsi que la forme du spectre de Brillouin, sont influencées par les caractéristiques acoustiques du matériau (longueur d’onde phononique et longueur de propagation)11,12. Le phénomène sous-jacent à la spectroscopie de Brillouin est la diffusion de Brillouin, où la lumière laser monochrome incidente interagit avec des phonons acoustiques spontanés et thermiquement induits dans le milieu biologique. Cela entraîne une diffusion inélastique de la lumière et (décalage de fréquence de Brillouin, BFS) dans la Figure 1B , typiquement de l’ordre de plusieurs GHz ; selon que le photon perd ou gagne de l’énergie, les pics de Brillouin Stokes et anti-Stokes sont détectés respectivement dans le spectre de la lumière diffusée. Grâce à sa dépendance à la vitesse locale du son dans le milieu, le BFS est lié au module longitudinal élastique, qui est à son tour empiriquement corrélé au module deYoung 7,13 ; cependant, il faut faire attention lors de la comparaison entre ces modules car (i) ils ne sont pas directement liés entre eux, (ii) le module de Young se situe généralement dans la plage Pa-kPa pour les échantillons biologiques et la matière molle tandis que le module longitudinal obtenu à partir de Brillouin est dans la plage GPa, et (iii) des paramètres tels que les variations de l’indice de réfraction et la densité du matériau doivent être prisen compte 7. La largeur de raies de Brillouin (dans la Figure 1B) est une autre mesure obtenue à partir de BM. Il est lié au module de perte longitudinal, offrant des informations sur la viscosité de l’échantillon ; Ces propriétés peuvent être corrélées à la viscoélasticité14. Ainsi, BM permet d’évaluer les propriétés viscoélastiques, où un BFS plus grand implique un matériau plus rigide, et une plus grande largeur de raie implique un matériau plus visqueux (Figure 1B). Il convient de noter que la diffusion élastique (de Rayleigh), où les photons ne subissent pas de décalage de fréquence, a une probabilité de se produire nettement plus élevée que la diffusion de Brillouin. Par conséquent, les spectromètres de Brillouin doivent être équipés pour supprimer le signal de Rayleigh.

La BM a été utilisée pour caractériser les propriétés mécaniques de divers tissus, biomatériaux et modèles de culture cellulaire 3D. Par exemple, la smole a été utilisée pour différencier le mélanome du tissu sain environnant, montrant que le tissu non cancéreux était nettement plus mou que lemélanome 15. Rad et al. ont montré qu’augmenter la concentration polymère des hydrogels entraînait une augmentation du BFS et de la largeur de ligne. Aux concentrations de polymères les plus faibles, les hydrogels avec cellules ont montré des baisses plus importantes des variations de fréquence de Brillouin sur sept jours comparées aux hydrogels vides, ce qui était proposé comme étant dû à la remodelisation cellulaire de l’hydrogel. Cela n’a pas été observé à 10 % de concentration de polymère, ce qui soulignait un possible manque de viabilité cellulaire observé dans ceshydrogels.

Plus pertinent pour la présente étude, BM a été utilisé pour étudier les propriétés mécaniques dessphéroïdes 17,18,19,20. En particulier, l’effet du microenvironnement local sur la mécanique sphéroïde peut être détecté à l’aide de BM20. Comparés aux sphéroïdes tumoraux cultivés dans des hydrogels complissants, les sphéroïdes cultivés dans des hydrogels rigides présentaient un BFS plus élevé, ce qui indique un module élastiqueaccru 20. La variation spatiale des propriétés mécaniques au sein d’un sphéroïde peut également être caractérisée par BM. Par exemple, il a été observé que la BFS des sphéroïdes tumoraux augmente vers le noyausphéroïdien 20,21. De plus, une diminution du BFS est corrélée à une augmentation de l’invasivité des sphéroïdestumoraux 20. La BM a été utilisée pour étudier les modifications mécaniques des sphéroïdes tumoraux en réponse au chocosmotique 22. Dans l’étude, la croissance des sphéroïdes a été surveillée pendant 5 jours, constatant que les différences mécaniques initiales entre le cancer et les sphéroïdes sains observées avec la smose s’étaient dissipées avec le temps. Une autre étude a révélé une augmentation du BFS du sphéroïde après 7 jours, attribuée à une augmentation de la taille et du nombre de cellulessphéroïdiennes 16.

De plus, des études multimodales, utilisant la microscopie de Brillouin en parallèle de l’AFM et de la rhéologie, ont été menées pour étudier les propriétés mécaniques des cellules ethydrogels 16,23,24. Rad et al. ont utilisé la rhéologie pour contextualiser les tendances mesurées avec le BM, établissant une forte corrélation positive entre le module longitudinal et le module de cisaillement de stockage par rapport à la concentration polymère deshydrogels 16. La microscopie de Brillouin et la microrhéologie à la pince optique ont été utilisées pour mesurer la mécanique des cellules cancéreuses cultivées dans des hydrogels3D 23. Dans cette étude, une hétérogénéité mécanique diminuée a été observée entre les cellules des sphéroïdes par rapport aux cellules individuelles cultivées en suspension dans des hydrogels.

Dans ce travail, un protocole visant à étudier les propriétés mécaniques des sphéroïdes vivants intégrés dans les hydrogels avec un microscope Brillouin commercial est détaillé (Figure 1). Berghaus et al. ont décrit un protocole détaillant les étapes pour construire un spectromètre de Brillouin haute résolution et une méthode pour le calibrer avec des matériauxde référence 25. De plus, un protocole de Shi et al. décrit l’utilisation de la microscopie de Brillouin pour surveiller les changements dans les propriétés mécaniques du tissuembryonnaire 26. Nous utilisons des sphéroïdes des cellules souches mésenchymateuses (MSC) dans les hydrogels poly(éthylène) glycol (PEG)-maléimide pour imiter la niche de la moelle osseuse et étudier les propriétés mécaniques de cet environnement. Ce modèle 3D a le potentiel de révéler la signature mécanique des maladies de la moelle osseuse, notamment la leucémie, le myélome multiple et le cancer osseux secondaire. Le protocole est donc directement transférable aux modèles 3D d’autres maladies où la mécanobiologie perturbée peut jouer un rôle important dans la pathologie. La préparation des sphéroïdes et hydrogels, l’imagerie à fluorescence et la microscopie de Brillouin sont détaillées. Les procédures recommandées, les inconvénients possibles et les améliorations potentielles de la technique sont discutées. La description détaillée de l’installation expérimentale est présentée à la Figure S1 et dans la section Matériaux et méthodes supplémentaires liées à la mise en place expérimentale.

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Protocole

1. Culture cellulaire 2D

REMARQUE : Dans la mesure du possible, assurez-vous que tout le travail de culture cellulaire soit effectué dans un environnement stérile à l’aide d’une cagoule à flux laminaire standard pour culture tissulaire afin d’éviter toute contamination. Les MSC ont été utilisés dans le protocole actuel, mais d’autres types cellulaires peuvent être utilisés pour créer des sphéroïdes, selon les objectifs spécifiques de l’étude.

  1. Cultivez des MSC dans un milieu de culture cellulaire Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, avec un volume suffisant pour recouvrir les cellules, contenant 4,5 g/L de D-glucose, + L-Glutamine complété avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 100 μM de pyruvate de sodium, 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA), 1 % de pénicilline et de streptomycine. Incubez les cellules à 37 °C et 5 % deCO2.
  2. Les cellules de passage à 70-80 % de confluence sont en incubant avec 0,05 % d’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA) (le volume de trypsine ajoutée doit être un tiers du volume DMEM) pendant 3 minutes à 37 °C et 5 % deCO2 pour détacher les cellules de la plaque. Pour arrêter la réaction, ajoutez des milieux de culture contenant la FBS (au moins en correspondant au volume de trypsine ajoutée). Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

2. Préparation des sphéroïdes

REMARQUE : Dans la mesure du possible, assurez-vous que tout le travail de culture cellulaire soit effectué dans un environnement stérile à l’aide d’une cagoule à flux laminaire standard pour culture tissulaire afin d’éviter toute contamination. Dans cette étude, des plaques de micropuits ont été utilisées pour créer des sphéroïdes MSC. Ces plaques sont composées de 24 puits, chaque puits contenant 1200 micropuits de 400 μm de diamètre. Cela permet la préparation d’un grand nombre de sphéroïdes (Figure 2).

  1. Pour préparer la plaque micropuits, prétraiter les puits en ajoutant 500 μL de solution de rinçage anti-adhérence à chaque puits. Placez la centrifugeuse à 1 300 g pendant 5 minutes à température ambiante. Au microscope à un gros 20x, vérifiez s’il y a des bulles d’air présentes. S’il y en a, répétez l’étape de centrifugation. Retirez la solution anti-adhérence.
  2. Pour laver la plaque, ajoutez 1 mL de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) et aspirez. Faites cela deux fois pour vous assurer que la solution de rinçage a été complètement retirée.
  3. Déterminez le nombre de cellules par sphéroïde et le nombre de sphéroïdes par gel. Cela dépendra des questions de recherche individuelles. Par exemple, nous avons utilisé 100 cellules par sphéroïde et 100 sphéroïdes par gel. Par conséquent, pour ce protocole, un seul puits de la plaque du micropuits était nécessaire, ce qui crée au total 1200 sphéroïdes. Pour calculer le nombre de cellules nécessaires à un puits, nous avons effectué le calcul suivant : 1200 x 100 = 1,2 x 105. Calculez le volume de suspension cellulaire contenant 1,2 x 105 cellules. Centrifugez la suspension à 300 g pendant 5 minutes à température ambiante et retirez le surnageant.
  4. Resuspendez les cellules dans 1 mL de DMEM (+4,5 g/L D-glucose, + L-Glutamine) complété avec 100 μM de pyruvate de sodium, 1 % de NEAA, 1 % de pénicilline et de streptomycine. Ajoutez 1 mL de suspension cellulaire à un puits de la plaque du micropuits et pipetez doucement de haut en bas pour disperser les cellules uniformément dans tout le puits. Faites attention à ne pas introduire de bulles d’air. Centrifugez la plaque à 100 g pendant 3 minutes à température ambiante.
    REMARQUE : À ce stade, nous n’ajoutons pas FBS aux médias. Cela vise à empêcher les cellules de s’attacher au plastique de la culture tissulaire.
  5. Observez la plaque au microscope pour vous assurer que les cellules sont bien réparties et ont coulé au fond des micropuits. Incubez les cellules à 37 °C et 5 % deCO2. Observer la formation sphéroïde 24 heures plus tard.
    REMARQUE : Les sphéroïdes peuvent rester dans la plaque jusqu’à 48 heures, selon le type de cellule et la compacité souhaitée du sphéroïde.
  6. Pour prélever les sphéroïdes de la plaque, retirez d’abord lentement et doucement le support culturel, afin de ne pas déranger les sphéroïdes. Pour éviter que les sphéroïdes ne collent aux plastiques, enrobez les pointes et tubes de pipette avec du PBS avec un FBS à 1 %. Pour éviter que les sphéroïdes ne se coincent dans les pointes de la pipette, coupez la pointe pour élargir l’ouverture. Des embouts de récupération maximale peuvent être utilisés pendant ces étapes comme mesure supplémentaire pour éviter la perte des sphéroïdes. Ajoutez 500 μL de PBS à chaque puits de la plaque du micropuits et faites une pipette vers le haut et vers le bas pour déloger les sphéroïdes. Collectez le PBS avec des sphéroïdes suspendus dans un tube (Figure 2).
  7. Observez la plaque au microscope à un grossissement de 20x et répétez cette étape jusqu’à ce que la plupart des sphéroïdes aient été retirés avec succès.
  8. Pour compter le nombre de sphéroïdes dans la suspension, transférez 50 μL de la suspension dans un puits d’une plaque à 96 puits. Comptez le nombre de sphéroïdes dans les 50 μL. Pour faciliter le comptage, une croix peut être dessinée au fond du puits à l’aide d’un marqueur permanent. Calculez le nombre de sphéroïdes à l’aide de l’équation (1) :
    figure-protocol-1

3. Préparation des hydrogels PEG

REMARQUE : Dans la mesure du possible, assurez-vous que tout le travail de culture cellulaire soit effectué dans un environnement stérile à l’aide d’une cagoule à flux laminaire standard pour culture tissulaire afin d’éviter toute contamination. Dans cette étude, des hydrogels PEG-maléimide ont été utilisés, mais d’autres types peuvent également être utilisés. Les hydrogels PEG-maléimide ont été formés à l’aide de la réaction d’additionthiol-Michael 27. Les réticulateurs utilisés étaient un mélange de PEG-dithiol et de peptide dégradable par protéase, flanqué de deux résidus de cystéine (peptide VPM, GCRDVPMSMRGGDRCG). Les gels de la présente étude utilisaient 70 % de PEG-dithiol et 30 % de peptide VPM dégradable.

  1. Préparez une solution d’origine de 200 mg/mL de peptide VPM et ajoutez 2,4 μL de peptide par gel. Préparez une solution de 200 mg/mL de PEG-dithiol et ajoutez 5,6 μL par gel.
  2. Resuspendez les sphéroïdes dans le PBS avant de les mélanger avec les réticulateurs (Figure 2). Mélangez la suspension sphéroïde avec le PEG-dithiol (5,6 μL par gel) et le VPM (2,4 μL par gel). Cette solution est appelée solution B.
    REMARQUE : Dans ce protocole, 100 sphéroïdes ont été ajoutés par gel.
  3. Préparez une solution PEG-Maleimide à 250 mg/mL. Ajoutez 50 μg de fibronectine par gel. Mélangez la solution de PEG-Maleimide et de fibronectine ; cela s’appelle la solution A. Solution de pipette A (40,3 μL pour des gels de 100 μL) sur le fond d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Ajouter la solution B (59,7 μL pour des gels de 100 μL) à un rapport molaire de 1:1 maléimide :thiol pour assurer un réticulation complète ; Assurez-vous que la gélification se produise instantanément. Le volume final des hydrogels est de 100 μL.
  4. Incubez les gels pendant 30 minutes à 37 °C et 5 % de CO2 pour permettre la gélification. Ajoutez un milieu de culture complet (DMEM complété avec 10 % de FBS, 100 μM de pyruvate de sodium, 1 % de NEAA, et 1 % de pénicilline et streptomycine) dans le puits, afin de garantir que le gel est complètement immergé (Figure 2). Incubez le gel à 37 °C et 5 % deCO2 jusqu’à ce qu’il soit prêt à prendre des mesures au microscope Brillouin.
    REMARQUE : La durée de la culture sphéroïde dans les hydrogels avant les mesures de Brillouin dépendra du type cellulaire et de la question de recherche. Par exemple, dans cette étude, les sphéroïdes sont généralement cultivés dans des hydrogels pendant jusqu’à 7 jours, période durant laquelle ils sont surveillés par microscopie Brillouin. Les propriétés viscoélastiques des hydrogels avec ou sans encapsulation sphéroïde ont été caractérisées et ne montrent pas d’impact significatif des sphéroïdes sur la mécanique des gels (Figure S2).

4. Coloration par fluorescence et imagerie des sphéroïdes dans les hydrogels

REMARQUE : Dans cette étude, les noyaux cellulaires et les filaments d’actine composant le cytosquelette ont été colorés par fluorescence et imagés avant les mesures de Brillouin.

  1. Pour colorer l’actine, ajoutez la coloration vivante à l’actine dans le milieu de culture à 1 dilution sur 500, 3 h avant l’imagerie. Garde l’échantillon hors de la lumière en l’enveloppant dans du papier aluminium. Incubez le gel à 37 °C et 5 % deCO2.
  2. Pour colorer les noyaux, ajoutez 2 gouttes/mL de coloration nucléaire vivante au milieu de culture entourant le gel 40 minutes avant l’imagerie. Retournez les échantillons dans l’incubateur.
  3. Acquérez des images de fluorescence dès que possible après la fin du temps d’incubation de la coloration. Vérifiez que le chemin optique approprié (exposant la caméra du microscope) et la position correcte de la roue du filtre sont sélectionnés. Tamisez les lumières de la pièce et capturez l’arrière-plan. Allumez la source lumineuse à diode électrolumineuse (LED) et choisissez la longueur d’onde selon le protocole de coloration (ici, 385 nm était utilisé pour les noyaux et 621 nm pour l’imagerie à l’actine). Acquérez des images fluorescentes des sphéroïdes à un grossissement de 20x avec le logiciel préféré. Éteins la source LED une fois terminé.

5. Microscopie de Brillouin des sphéroïdes

  1. Allumage des dispositifs et émission laser
    1. Allumez les appareils : l’ordinateur, le spectromètre, les caméras du microscope, le microscope, le ventilateur de refroidissement laser et l’émission laser en activant la clé du contrôleur. Assurez-vous que cela est fait 15 minutes avant l’optimisation du spectromètre pour garantir que le laser a thermique. Vérifiez que la puissance laser émise est conforme à l’attente avec un wattmètre (100 mW dans notre expérience).
  2. Activez l’application de contrôle de température (voir Tableau des matériaux) et vérifiez que la température de l’étalon est optimisée en mesurant la puissance du faisceau après l’étalon. Si elle est significativement inférieure à l’attente (après avoir pris en compte le filtre à densité optique (OD) utilisé), changez la température cible de 1 °C et observez s’il y a une augmentation de puissance avec le temps. S’il y a une diminution, inversez la direction du changement. Une fois la puissance proche de l’attente, accordez par petits incréments (0,1 °C) jusqu’à atteindre le maximum.
  3. Régler le point focal objectif à l’intérieur du cube acrylique
    REMARQUE : La suppression de la diffusion élastique et du couplage entre le « tueur de pompe » et le spectromètre est optimisée avec un échantillon de matériau de référence rigide et homogène avant chaque expérience. Dans cette étude, un cube acrylique est utilisé.
  4. Ouvrez le logiciel SpectraLok et attendez que tous les appareils soient détectés. Sur le côté gauche de la fenêtre principale (Figure 3), sélectionnez la caméra spectromètre.
    1. Installez le cube acrylique sur le porte-échantillons du microscope, le côté transparent étant orienté vers la lentille objective. Baissez l’objectif autant que possible et centrez le cube en dessous. Assurez-vous que le chemin optique dans le microscope est choisi afin que la caméra spectrométrique soit exposée (réglez le sélecteur de port rotatif sur L).
      REMARQUE : Dans notre installation, le port L est connecté au circulateur confocal, tandis que R est connecté au port caméra du microscope.
    2. Dans la fenêtre de la caméra SpectraLok, réglez le temps d’exposition du capteur à 500 ms et le gain logiciel à 100. Le réglage de gain logiciel ne fait qu’améliorer le contraste à des fins de visualisation.
  5. Débloquez l’obturateur laser.
    REMARQUE : Pendant que l’émission laser est activée, veillez à ne jamais placer la tête ou les yeux sur le trajet du faisceau laser.
    1. Appuyez sur capture et déplacez l’objectif vers le haut. Il y aura une augmentation significative de l’intensité du signal, et un motif saturé (Figure 4A) apparaîtra. Cela est causé par une forte réflexion de la lumière laser à l’interface air-cube acrylique. Plus on remonte l’objectif, l’intensité du signal diminue et les pics de Brillouin deviennent apparents. Continuez à repositionner la lentille objective jusqu’à ce que l’intensité des pics de Brillouin soit constante (Figure 4B). Cela correspond au point focal situé entièrement à l’intérieur du cube acrylique.
  6. Optimisation de la pression étalon pour minimiser la lumière résiduelle diffusée élastiquement
    REMARQUE : Le but des étapes suivantes est de supprimer le signal de Rayleigh élastiquement diffusé afin que seule la lumière de Brillouin décalée en fréquence atteigne la caméra du spectromètre.
  7. Dans le logiciel SpectraLok, ouvrez la fenêtre de contrôle Pump Killer (PK) (Figure 5).
  8. Zoomez sur l’un des ordres Brillouin les plus brillants et ajustez la position de l’actionneur de pression par incréments de 100 μm en cliquant sur déplacer rel pour minimiser l’intensité maximale de Rayleigh. Si le signal de Rayleigh augmente, inversez la direction du changement en cliquant sur inverser. Ensuite, ajustez finement la pression de l’étalon par incréments de 10 μm.
    REMARQUE : Dans le cube acrylique, la lumière Rayleigh peut être complètement supprimée ; cela peut ne pas être le cas dans un échantillon biologique hétérogène.
  9. Optimisation de la superposition de bandes pour « déplier » les données spectrales
    REMARQUE : La procédure suivante garantit que les coordonnées pixels (x, y) du capteur de l’appareil photo sont correctement mappées à la longueur d’onde grâce à l’application de la table de recherche LUT.
  10. Dans la fenêtre de la caméra , zoomez sur l’un des ordres Brillouin.
  11. Appuyez sur s pour visualiser les bandes sur lesquelles la LUT est appliquée sur l’image de la caméra (Figure 6A). Ouvrez la fenêtre Paramètres et appuyez sur calibration rapide pour recalculer le décalage horizontal optimal des rayures. Si le capteur est saturé, réduisez le temps d’exposition avant cette étape.
    1. Dans la fenêtre de la caméra , vérifiez que les bandes violettes sont bien superposées à la région centrale des pics de Brillouin (Figure 6B).
  12. Optimisation du couplage du spectromètre PK
  13. Le réglage des axes de la lentille du collimateur permet de maximiser l’efficacité du couplage de la lumière entre la PK et le spectromètre.
  14. Ouvrez la fenêtre du spectre et cliquez sur déplier pour récupérer le spectre (Figure 7).
  15. Ouvre la fenêtre de contrôle PK . Avec des incréments de 0,0005°, ajustez itérattivement les axes collimateur 1 et 2 pour maximiser le signal de Brillouin. Si nécessaire, le contrôle de pression étalon peut être optimisé davantage. Dans un cube acrylique homogène, le signal de Rayleigh peut être complètement supprimé (Figure 7A). Bien que des mesures précises de Brillouin avec un certain signal résiduel de Rayleigh soient réalisables (Figure 7B), en cas de mauvaise suppression (Figure 7C), la lumière diffusée élastiquement obscurcit le signal de Brillouin.
  16. Vérifiez que le signal de Brillouin obtenu est comparable à l’amplitude de référence. Par exemple, dans notre système, à une exposition de 500 ms et avec un OD 0,3, l’amplitude maximale de l’intensité de Brillouin est d’environ 3000 comptes. Pour enregistrer les modifications des paramètres PK dans le fichier de configuration, dans la fenêtre PK, cliquez sur rafraîchir tout et tout sauvegarder. De plus, dans la fenêtre principale, appuyez sur enregistrer dans la section E/S du fichier .
  17. Passer au logiciel de balayage et vérifier que les paramètres sont toujours optimisés
  18. Fermez SpectraLok et ouvrez le logiciel de scan. Dans le protocole actuel, un logiciel basé sur LabVIEW a été utilisé et est décrit plus en détail à la Figure S3. Pour définir la géométrie du balayage, cette interface utilisateur propriétaire (UI) est utilisée pour contrôler l’étape de traduction Prior XY-Z ; cependant, d’autres méthodes peuvent être employées.
    1. Installez la boîte de Petri à fond de verre avec l’échantillon hydrogel-sphéroïde au lieu du cube acrylique (Figure 8). Pour éviter la déshydratation du gel, l’incubateur est réglé à 37 °C et à 95 % d’humidité relative. Retirez le couvercle de la boîte de Petri et ajoutez du substrat pour immerger le gel. Ajoutez une housse sur le dessus du gel pour éviter que le gel ne bouge.
    2. Localisez le sphéroïde. Avec le faisceau laser bloqué, basculez le chemin optique du microscope vers l’oculaire. Allumez l’éclairage à lumière blanche. Avec le joystick, contrôlez manuellement l’étape d’échantillonnage, localisez et concentrez le sphéroïde.
    3. Acquiers une image en champ clair du sphéroïde. Ajustez la luminosité de l’éclairage en faisant tourner la molette de contrôle. Réglez le chemin optique sur R, exposant ainsi la caméra du microscope. Le temps d’exposition peut être ajusté selon les besoins pour obtenir une image à fort contraste (c’est-à-dire 50 ms).
    4. Vérifiez que le spectromètre et les paramètres de dépliage sont toujours optimisés. Réglez le port du microscope sur L et capturez l’arrière-plan avec le laser bloqué. Débloquez le laser en tournant la roue pour qu’elle démarre. En fonction du rapport signal/bruit souhaité, sélectionnez le temps d’exposition. Le temps d’exposition typique de ces mesures est de 200 à 500 ms.
    5. Si un certain temps s’est écoulé (c’est-à-dire plusieurs heures) depuis l’étalonnage initial ou s’il y a eu une perturbation mécanique du système, le réglage de pression étalon ou le couplage PK-spectromètre peut ne plus être optimal. Répétez les étapes 5.3-5.5 pour réoptimiser les étapes mentionnées ci-dessus, si nécessaire.
    6. Dans le spectre non déroulé, sélectionnez la gamme Brillouin Peak Fitting. Ajustez la valeur seuil à environ la moitié de l’intensité des pics de Brillouin. Ignorez les pics de Brillouin dont l’amplitude est inférieure à ce seuil. Corrigez la longueur d’onde du laser selon toutes les paires de pics de Brillouin identifiées.
  19. Réglage de la géométrie de balayage multidimensionnel
  20. Choisissez la géométrie du balayage en ajustant la largeur de la région de balayage et la taille du pas.
    REMARQUE : Pour les sphéroïdes d’une taille d’environ 70 μm, pour un balayage à basse résolution, nous utilisons généralement une surface de balayage de 150 μm × 150 μm et une taille de pas de 10 μm. Cela donne une carte 2D basse résolution en environ 3,4 minutes.
    1. Commence le scan.
  21. Désactivation du système Brillouin
    1. Fermez le logiciel et éteignez l’ordinateur. Coupez l’émission laser avec la clé du régulateur. Laissez la molette de l’obturateur en position bloquée . Coupez le refroidissement du ventilateur laser. Éteignez les caméras du microscope et du spectromètre. Enfin, éteignez le microscope.

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Résultats

Les fichiers obtenus après un balayage incluent des spectres, des paramètres d’ajustement du balayage (.csv), des paramètres et analyses de balayage, des cartes BFS et de largeur de ligne, une image en champ clair avec la région de balayage d’intérêt identifiée, ainsi qu’une capture d’écran de la fenêtre de l’interface utilisateur. Pour chaque point du balayage de Brillouin multidimensionnel, une valeur BFS est acquise. Dans la Figure 9, un balayage haute ré...

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Discussion

Nous avons mis en place un protocole pour utiliser la microscopie de Brillouin afin d’imager biomécaniquement les sphéroïdes intégrés dans les hydrogels avec une résolution à l’échelle microscopique. L’hydrogel peut être distingué du sphéroïde vivant par des différences dans les valeurs de BFS obtenues. Dans les résultats représentatifs, nous avons utilisé des sphéroïdes MSC et des hydrogels PEG-maléimide ; cependant, ce protocole s’applique largement à d’autres types cellulaires (par ex...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs notent que T. Allen et G. Wardle sont employés de LightMachinery, qui fabrique et vend le spectromètre Brillouin utilisé dans cette étude. La société pourrait bénéficier de la publication de cet ouvrage. Tous les autres auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêts concurrents.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent le financement obtenu grâce à la subvention MechanoMeds Phase 2, UKRI/EPSRC, numéro de subvention EP/X033554/1 pour soutenir le développement de cette méthode.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
PEG-Maleimide à 4 bras (20 kDa)PEGWorks créatifsPSB-455https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k
Plaques AggreWell 400STEMCELL Technologies34411http://stemcell.com/products/aggrewell400.html
Étalon espaceant dans l’airLightMachineryHF-16074-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/
Solution de rinçage anti-adhérenceSTEMCELL Technologies7010https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html
Incubateur de la Ligne Grasse Top StageOkolabH301-NIKON-NZ100/200/500-Nhttps://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n
Cobolt Flamenco-100 laser 660 nmHuebner0660-05-01-0100-700https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/
Circulateur confocalLightMachineryHF-13311N/A
Système d’éclairage à fluorescence D-LEDi   ;NikonMBF83000https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi
Module EPI-FLNikonTi2-LA-FL-3https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules
Fibronectine (humaine)YoProtéines663https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html
Gibco Dulbecco s Eagle Moyen Modifié (DMEM)ThermoFisher11965092https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092
Spectromètre HyperFine BrillouinLightMachineryHF-8999-PK-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/
Cube filtre quadruple bande LED-DA/FI/TR/Cy5-BNikonMXR00753https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes
Cellules souches mésenchymateuses (MSC)PromoCellC-12974https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html
Étape de traduction motorisée & nbsp ;Ancien ScientificH117E2NNhttps://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33
NucBlue & échange ; ReadyProbes et échanges en direct ; réactif (Hoechst 33342)ThermoFisherR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605
Objective, S Plan Fluor 20X NA 0,45, airNikonMRH08230https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708
Caméra CMOS ORCA-FusionHamamatsuC14440-20UPhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html
PEG-dithiol, 2 kDaPEGWorks créatifsPLS-613https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g
sCMOS caméra  ;Teledyne Vision Solutions01-IRIS-15-USB-M-16-Chttps://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs  ;
SPY555-actin  ;SpirochromeCY-SC202https://spirochrome.com/product/spy555-actin/
TemperatureAppLogiciel de contrôle de la température
Peptide VPM, GCRDVPMSMRGGDRCGGenScriptN/AN/A
Microscope Eclipse Ti-2ANikonEclipse Ti-2Ahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series  ;

Références

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