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Article de méthode

Préparation du filtrat de culture de Mycobacterium tuberculosis pour comprendre la pathogenèse de la tuberculose

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DOI :

10.3791/67540

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28 mars 2025

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

Dans cet article

Résumé

Ici, nous démontrons la préparation du filtrat de culture Mtb (CF), qui est le milieu de croissance bactérienne composé de protéines sécrétées par les bactéries. Mtb sécrète des protéines pour moduler la signalisation de l’hôte et la réponse immunitaire, qui sont cruciales pour la pathogenèse. Les FC préparés sont analysés par spectrométrie de masse afin d’identifier tous les facteurs sécrétoires.

Résumé

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) sécrète de nombreuses protéines dans l’hôte pour moduler divers processus cellulaires, tels que la signalisation de l’hôte, la réponse immunitaire, l’apoptose, etc., afin d’améliorer la survie. Bien que la fonction de quelques facteurs sécrétoires ait été élucidée, beaucoup doivent encore être caractérisés. Par conséquent, l’étude de la protéine sécrétoire Mtb est un domaine de recherche essentiel. Mtb sécrète des protéines dans l’espace extracytoplasmique à l’aide de trois systèmes de sécrétion différents : général, gémeau-arginine et système de sécrétion spécialisé de type VII. Il faut préparer le sécrétome pour identifier de nouvelles molécules sécrétoires et caractériser fonctionnellement les facteurs connus. Ici, nous décrivons la méthode de préparation du sécrétome et de préparation de l’échantillon pour la spectrométrie de masse. La préparation du sécrétome nécessite le plus grand soin pour éviter la contamination des protéines cytosoliques, qui peuvent être surveillées en sondant avec des anticorps contre des protéines membranaires, sécrétoires et cytosoliques bien caractérisées. Le filtrat de culture ainsi préparé peut être utilisé à différentes fins, notamment pour étudier les propriétés d’immunomodulation de l’hôte.

Introduction

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’un des agents pathogènes les plus mortels au monde, infecte les personnes en bonne santé par le biais d’aérosols transmis par une personne infectée en éternuant ou en toussant1. Une fois qu’il pénètre dans les poumons, il est englouti par les macrophages alvéolaires, détournant le système immunitaire de l’hôte pour survivre. Parmi les divers mécanismes modulateurs de l’hôte que Mtb a pour la survie, les facteurs de virulence sécrétoires sont l’un d’entre eux. Les protéines sécrétées dans le milieu de culture par les bacilles au cours de sa croissance sont appelées protéines de filtrat de culture (CF)2. Ces protéines de filtrat de culture aident les bactéries à survivre dans des conditions difficiles à l’intérieur des cellules hôtes. Le Mtb est équipé de trois types différents de systèmes de sécrétion : un système de sécrétion spécialisé de type VII (T7SS), un système de sécrétion Sec général (système Sec) et un système de sécrétion d’arginine jumelle (système Tat). T7SS est le système de sécrétion le plus exclusif chez les actinobactéries, contrairement aux types I-VI chez les bactéries à Gram négatif3. La sécrétion de protéines dépliées à travers la membrane est principalement impliquée dans le système Sec, et les protéines sont reconnues par une séquence de signal N-terminale 4,5. Les protéines repliées ou partiellement repliées sont transportées par le système Tat, identifié par une séquence de signal N-terminale avec un motif jumeau d’arginine 6,7. La façon dont le système Sec et Tat régule la sécrétion de protéines n’a pas encore été déterminée.

Certaines protéines de filtrat de culture connues dans Mtb qui aident à résister et à survivre à l’assaut oxydatif de l’hôte lors de l’infection sont des enzymes telles que KatG et SodA 8,9, nécessaires pour dégrader les espèces réactives de l’oxygène. De plus, CFP10-ESAT6, un complexe protéique hétérodimérique, joue un rôle essentiel dans la régulation des réponses cytokiniques, l’échappement bactérien, la production de ROS, etc.10. Le locus RD1 est impliqué dans la modulation du système de sécrétion de type VII, qui comprend la sécrétion de CFP10-ESAT6, et la délétion génétique de cpf10-esat6 compromet la survie des bactéries dans les modèles d’infection ex vivo et in vivo. Mycobacterium bovis La souche vaccinale BCG n’a pas le locus RD1 responsable de la sécrétion des facteurs de virulence et peut donc être utilisée comme vaccin vivant atténué11. Différents processus cellulaires inexplorés régulent étroitement le processus de sécrétion. Les protéines du filtrat de culture contiennent des facteurs favorisant la réanimation (RpF) qui aident les bactéries à se régénérer à partir de l’état latent. Les facteurs favorisant la réanimation (Rpfs) sont des enzymes hydrolysantes du peptidoglycane qui sont connues pour jouer un rôle dans la dormance. Mtb code pour cinq gènes de type rpf (rpf A-E) qui aident les bactéries à sortir de la dormance, soit en solo, soit en interagissant avec d’autres protéines12. Les Rpfs se trouvent dans le filtrat de culture bactérienne et sont connus pour être impliqués dans la virulence de Mtb et l’immunité de l’hôte13,14. Les gènes rpf rpfE et rpfB, largement étudiés, montrent une immunité protectrice in vitro13 et améliorent les réponses immunitaires in vivo. Par conséquent, rpfE et rpfB peuvent être utilisés comme candidats vaccins contre Mtb.

La phosphorylation réversible15 est une modification post-traductionnelle qui modifie divers processus cellulaires, l’homéostasie cellulaire, la division cellulaire, etc. Par exemple, la phosphorylation de CFP10 joue un rôle régulateur important, lorsque les mutants phosphoablatifs et mimétiques de CFP10 ne parviennent pas à restaurer le phénotype observé dans la souche de délétion16 de CFP10-ESAT6. SecA2, quant à lui, est une protéine sécrétoire impliquée dans les dommages à l’ADN de la cellule hôte17. Le sécrétome du mutant SecA2 est suffisant pour modifier la réponse immunitaire de l’hôte et la cascade de signalisation18,19. Ainsi, il est essentiel et passionnant d’étudier le sécrétome de H37Rv et les mutants Mtb, où les gènes des protéines sécrétoires sont supprimés (données non publiées), afin de mieux comprendre comment ils affectent l’immunomodulation et la survie de l’hôte.

Ce rapport se concentre sur trois aspects : les étapes de la préparation du filtrat de culture de Mtb , le traitement des échantillons pour la spectrométrie de masse et la réalisation d’expériences ex vivo avec des filtrats de culture pour examiner les fonctions immunomodulatrices. Des études antérieures ont montré l’identification des protéines de filtrat de culture par électrophorèse sur gel 2D suivie d’une analyse par spectrométrie de masse8. Des protéines de filtrat de culture provenant de souches sensibles aux médicaments et résistantes ont été identifiées à l’aide de la spectrométrie de masse afin de mieux comprendre les modifications du sécrétome et d’identifier les facteurs de virulence qui peuvent jouer un rôle dans la résistance aux médicaments20. Nous avons déjà étudié le sécrétome et le phosphosécrétome de Mtb à l’aide de la spectrométrie de masse16. Les techniques telles que l’électrophorèse sur gel 2D sont à faible débit et ne sont pas utilisées pour étudier les changements globaux du protéome ou du sécrétome. Les protéines du filtrat de culture varieraient des souches bactériennes, des stades des cellules en croissance et même dans diverses conditions de stress. Selon différentes situations, la modification des pools de protéines sécrétoires à l’intérieur des cellules permettrait d’explorer l’ensemble du sécrétome de manière holistique et de fournir plus d’informations sur le système de sécrétion bactérienne pour les interventions thérapeutiques. Il serait encore plus intéressant d’examiner le sécrétome dans les souches d’inactivation ou d’épuisement des systèmes sécrétoires pour mieux comprendre les voies et les cibles de chaque voie sécrétoire. Le traitement des cellules avec des protéines de filtrat de culture au lieu de bactéries modifie les niveaux de cytokines et d’autres facteurs immunomodulateurs17. Avec l’aide de l’étude du sécrétome, on peut identifier de nouveaux facteurs de virulence et leur rôle dans la virulence.

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Protocole

REMARQUE : Ici, nous utilisons la souche de laboratoire pathogène H37Rv de Mtb. Il faut effectuer les étapes nécessaires à la culture bactérienne et isoler le surnageant de culture dans le laboratoire de biosécurité de niveau 3 (BSL-3). De la relance de la culture à la préparation du filtrat, l’installation BSL-3 est utilisée.

1. Inoculation de la culture de Mtb

  1. Préparation de la zone de travail en BSL-3
    1. Allumez la lumière UV de l’enceinte de biosécurité pendant 10 minutes avant de l’utiliser. Nettoyez l’enceinte de biosécurité avec de l’éthanol à 75 % avant et après utilisation. Jetez les matières utilisées dans les poubelles appropriées en suivant les directives de biosécurité.
  2. Préparation des cultures primaires et secondaires de Mtb H37Rv
    1. Prélever le bouillon de glycérol à partir de -80 °C et décongeler le bouillon à température ambiante. Utilisez quatre souches indépendantes pour les quadruplés biologiques.
    2. Prendre 10 mL de milieu 7H9 (tableau 1) contenant 10 % d’ADC (9 mL de milieu 7H9 et 1 mL d’ADC) dans une fiole conique autoclavée de 100 mL munie d’un bouchon à vis.
      REMARQUE : 7H9 + ADC : Le 7H9 est un milieu riche en nutriments obtenu dans le commerce, auquel on ajoute de l’ADC (ADC : albumine, dextrose et catalase ; Tableau 2). L’ADC et l’OADC peuvent être utilisés pour développer la culture. Les flacons coniques offrent une plus grande aération à la culture ; Cependant, on peut également utiliser un flacon de culture tissulaire pour faire pousser les cellules bactériennes.
    3. Inoculer tout le stock de glycérol au milieu pour relancer la culture, qui devient la culture primaire. Prenez une culture Mtb en croissancede 600 ~ 0,8 pour fabriquer des stocks de glycérol. Mélangez 15 % de glycérol et la culture de Mtb en croissance dans un flacon cryogénique et conservez-le à -80 °C.
    4. Incuber les flacons de culture à 37 °C dans un agitateur d’incubateur pendant 3 à 4 jours à 100 tr/min.
    5. Le 5ème jour, mesurer l’absorbance à 600 nm (A600). Lorsque les cultures atteignent A600 ~ 0,8-1, utiliser la culture pour inoculer la culture secondaire à A600 ~ 0,2 dans 100 mL de milieu 7H9 + 10 % ADC dans une fiole de 500 mL. Effectuez les mêmes étapes pour les réplications.
      1. Mesurez l’A600 de la culture primaire. Si le A600 est ~ 0,8, granuler la culture par centrifugation à 2100 x g pendant 10 min. Jetez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 5 mL de milieu 7H9 + 10 % ADC et mesurez l’A600. Calculez la quantité d’inoculum qui sera ajoutée dans 100 mL de culture secondaire de A600 ~ 0,2. Par exemple, si l’on utilise l’A600 ~ 4, il faut ajouter 5 mL de cette culture à 100 mL de culture secondaire fraîche 7H9 + 10 % d’ADC de A600 ~ 0,2.
    6. Cultivez-les à 37 °C dans un agitateur d’incubateur à 100 tr/min pendant 2-3 jours jusqu’à OD A600 ~ 0,8.
    7. Prélever 10 μL à l’aide d’une pipette munie d’un embout filtrant et repérer la culture sur une plaque de gélose LB qui ne contient pas d’antibiotiques dans le capuchon bactérien. Incuber la plaque à 37 °C pendant 12 à 16 h pour visualiser la contamination bactérienne (le cas échéant). Jetez les cultures et faites revivre les nouvelles cultures de l’expérience si une contamination bactérienne est détectée.
  3. Croissance bactérienne dans les milieux de Sauton
    1. À l’A600 ~ 0,8, inoculer des bactéries à A600 ~ 0,2 dans 100 mL de milieu de Sauton dans une fiole de 500 mL (tableau 3) et croître pendant 3 à 4 jours après que la DO ait atteint ~0,8.
    2. Utiliser des cultures cultivées jusqu’à A600 ~ 0,8 dans le milieu de Sauton (culture primaire de Sauton) pour l’inoculation des cultures à utiliser pour la préparation du filtrat de culture.
      REMARQUE : 7H9 + ADC est un milieu riche en nutriments qui contient de l’albumine. L’albumine ne peut pas être utilisée dans l’analyse du sécrétome car l’albumine peut masquer les protéines du filtrat de culture. Par conséquent, le milieu de Sauton est utilisé pour préparer le filtrat de culture. Le milieu de Sauton est préparé en reconstituant les composants mentionnés au tableau 3.

2. Préparation des protéines de filtrat de culture Mtb

  1. Centrifugation pour surnageant de culture
    1. Utilisez la culture primaire de Sauton pour inoculer 300 ml de culture secondaire de Sauton à A600 ~ 0,2. Cultivez des cultures jusqu’à ce que OD A600 soit ~0,4-0,5. Utilisez des cultures en phase logarithmique en croissance active pour éviter la contamination par les cellules mortes.
      1. Mesurer la DO de la culture secondaire. Si le diamètre extérieur atteint A600 ~0,8, granuler la culture par centrifugation à 2 100 x g pendant 10 min. Jetez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 10 mL de milieu de Sauton et reprenez la DE. Calculez la quantité d’inoculum qui sera ajoutée à une culture de 300 mL de 0,2 DO à partir de la DO mesurée. Par exemple, si la DO est de 8, il faut ajouter 7,5 mL de cette culture à 300 mL de milieu frais de Sauton de 0,2 DO.
        REMARQUE : Respectez le DO mentionné pour réduire la lyse cellulaire et la contamination par GroEL. GroEL est un chaperon et est exprimé de manière constitutive dans les cellules bactériennes. Une partie de la littérature a montré la présence de GroEL dans les filtrats de culture en raison du stress pendant la croissance. Ici, nous utilisons le média de Sauton pour la préparation du filtrat de culture, ce qui fournit un léger stress aux cellules ; par conséquent, GroEL peut être présent dans le filtrat de culture. De plus, si la DO de culture est supérieure à 1, la lyse cellulaire se produirait, entraînant une contamination par le GroEL dans le filtrat de culture.
    2. Granulez 300 ml de cultures en croissance dans des tubes de 6 à 50 ml à 2 100 x g pendant 10 min à 4 °C (figure 1A).
    3. Prélever 45 mL de surnageant, en laissant la pastille intacte, à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL dans un nouveau tube dans chaque cas. Gardez la pastille de côté pour la préparation du lysat de cellules entières (WCL).
    4. Répéter la centrifugation à 2 100 x g pendant 10 min à 4 °C. Prélever 40 mL de surnageant (en laissant 5 mL de culture intacts) à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL dans un nouveau tube et répéter l’étape de centrifugation.
    5. Prélever 35 mL du surnageant dans un tube frais et filtrer le surnageant de culture à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm. Filtrer dans un tube frais pour éliminer la contamination bactérienne pathogène. À partir de 300 mL de culture, 210 mL de filtrat de culture par répétition.
      REMARQUE : Le filtre qui a été utilisé ici pour filtrer le filtrat de culture est un filtre à seringue stérile de 0,22 μm (type SY25PL-S).
    6. Après la filtration du filtrat de culture, inoculer 1 mL d’aliquote du filtrat de culture filtré sur une plaque de gélose et incuber dans l’incubateur à 37 °C pendant 4 semaines pour s’assurer de la présence d’une autre contamination bactérienne pathogène dans le filtrat de culture. Prélever 1 mL d’aliquote du lysat à cellules entières (WCL) et suivre les mêmes mesures de sécurité.
    7. Essuyez les tubes d’échantillon avec de l’éthanol à 75 % et retirez-les du BSL-3 à travers une boîte de passage.
  2. Préparation du lysat de cellules entières (WCL)
    1. Remettez la pastille en suspension dans 1 ml de 1 x PBSG contenant du fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 1 x cocktail d’inhibiteurs de protéase, et transférez le lysat dans des tubes de 2 ml contenant 1/3de volume de billes de zircone de 0,1 mm.
      REMARQUE : Le 1x PBSG est composé de 1x PBS + 5 % de glycérol. Prenez le rapport de poids granulé/tampon de 1:3.
    2. Lyser les échantillons en les battant à perles dans un mini batteur à billes : 1 min de battage de billes suivi de 2 min d’incubation sur glace. Répétez cette opération 8 fois.
    3. Centrifuger les tubes à 18 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Prélever le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 mL et le conserver sur de la glace.
    4. Répétez l’étape de centrifugation. Passez le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,2 μm pour éliminer la contamination bactérienne pathogène.
      REMARQUE : Le filtre utilisé ici pour filtrer le filtrat de culture est un filtre à seringue stérile de 0,22 mm (type SY25PL-S).
    5. Essuyez les échantillons avec de l’éthanol à 75 % et sortez-les de BSL-3 à travers une boîte de passage. Vérifiez les concentrations de lysats à l’aide du kit de dosage BCA, comme mentionné ci-dessous. Conservez les lysats à -80 °C.
  3. Concentrez les protéines du filtrat de culture à l’aide d’unités de filtration centrifuges.
    1. Concentrez 210 mL de protéines de filtrat de culture Mtb à l’aide d’unités de filtration centrifuges. Utiliser des tubes d’unité de filtration centrifuge de 3 kDa et 15 mL (centricons) pour concentrer le filtrat de culture en ~1 mL (Figure 1A). Les tubes de l’unité de filtration centrifuge de 3 kDa retiennent les protéines de même taille ou supérieures à 3 kDa.
    2. Ajouter environ 15 mL de chaque répétition de filtrat de culture dans un tube centricon et centrifuger à 2 100 x g pendant 1 h à 4 °C.
    3. Jeter l’écoulement comme selon les normes et répéter l’étape 2.3.2 pendant 15 à 16 fois jusqu’à 210 ml du concentré de filtrat de culture jusqu’à ~1 mL.
    4. Aliquote 100 μL des protéines de filtrat de culture concentrées dans dix tubes de microcentrifugation à faible liaison protéique et estimer la concentration en protéines à l’aide d’un kit BCA.
  4. Estimation des protéines concentrées
    1. Estimez la concentration en protéines par rapport à la BSA comme norme. Utilisez 1 μg, 2 μg, 3 μg et 4 μg de BSA dans un volume de 25 μL en doubles. Si l’échantillon n’était pas dilué, utiliser un échantillon dilué 5x (en PBS) dans un volume de 25 μL en doubles pour l’estimation. Les estimations sont réalisées sur des plaques de 96 puits. Utiliser un témoin sans échantillon (blanc) contenant 25 μL de PBS.
    2. Ajouter 175 μL de réactif mélangé selon les instructions du fabricant. Mélangez des échantillons à l’aide d’une pipette multicanaux et incubez à 37 °C pendant 1 h. Mesurez les valeurs à 562 nm à l’aide d’un lecteur ELISA. Déduisez les valeurs des valeurs à blanc pour obtenir les valeurs pour BSA et les échantillons.
    3. Ajustez la courbe standard à la courbe de régression linéaire et estimez les échantillons par rapport à la norme. Suivez le kit BCA pour le manuel d’estimation des protéines.

3. Confirmation des protéines du filtrat de culture à l’aide de différents marqueurs

  1. Détection de protéines par coloration à Coomassie
    1. Pour confirmer la présence des protéines dans le filtrat de culture, prélever 30 μg de protéines et résoudre sur 10 % de dodécylsulfate de sodium – électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE ; Tableau 4).
      REMARQUE : Suivez la description du tableau pour faire des tampons SDS-PAGE, Coomassie staining et destaining solutions.
    2. Ajouter 20 ml de solution de coloration Coomassie (tableau 5) au gel et incuber pendant 30 minutes sur des bascules à température ambiante. Jeter la solution de coloration.
    3. Ajouter 30 mL de solution de décoloration (tableau 6) au gel et incuber pendant 30 min sur une bascule à température ambiante. Jetez la solution de décoloration et ajoutez une solution de décoloration fraîche. Répétez l’opération jusqu’à ce que le gel se décolore correctement.
    4. Vérifiez la traînée protéique sur l’illuminateur trans (Figure 1B). Comme la protéine du filtrat de culture contient plusieurs protéines, une traînée de bandes protéiques peut être observée dans le gel après décoloration (Figure 1B).
  2. Confirmation par transfert Western d’un marqueur protéique sécrété
    1. Utilisez l’anticorps de la protéine sécrétée pour vérifier la présence de la protéine sécrétée dans le filtrat de culture. Ag85B (ab43019) est une protéine bien connue sécrétée par Mtb dans le filtrat de culture et présente dans le cytosol ; l’anticorps Ag85B (concentration 5 mg/mL) (dilution 1:5000 dans 5 % de BSA) est utilisé comme témoin positif de la protéine sécrétée.
    2. Chargez une WCL avec les protéines du filtrat de culture pour différencier les fractions cytosoliques/membranaires et les fractions protéiques sécrétées. L’Ag85B est cytosolique et sécrété, il devrait donc être présent dans les deux fractions ; d’autre part, PknB est connu pour être localisé à la membrane et n’est pas présent dans le filtrat de culture.
    3. Déterminez la concentration de protéines dans le WCL/filtrat de culture à l’aide d’un kit BCA. Mélanger 30 μg de PCL/filtrat de culture avec un tampon 2x-lamelli dans un volume de 30 mL (tableau 7). Résolvez les échantillons en SDS-PAGE à 10 % pour PknB et à 12 % SDS-PAGE pour Ag85B jusqu’à ce que le front du colorant atteigne le fond à l’aide du tampon de gel SDS (Tableau 8). Ne laissez pas le colorant s’écouler du gel.
      REMARQUE : La taille de l’Ag85B est de ~35 kDa, donc 12 % SDS-PAGE est utilisé.
    4. Couper une membrane de nitrocellulose de 9 cm x 6 cm et 0,2 μm pour le transfert (tableau 9) de la protéine du gel sur la membrane. Configurez le transfert à l’aide d’une cassette de transfert, en trempant les cassettes, les tampons en mousse, le papier buvard, le gel et la membrane dans 1 tampon de transfert glacé.
    5. Placez le tampon en mousse sur un côté de la cassette, puis placez un papier buvard, placez le gel, placez une membrane de nitrocellulose sur le gel, placez à nouveau un papier buvard, et enfin, placez un autre tampon en mousse et fermez le porte-cassette. Placez le support de cassette dans le réservoir de transfert de sorte que le côté de la membrane soit orienté vers l’anode et le côté gel vers la cathode.
    6. Connectez la cathode et le fil d’anode au réservoir pour fermer l’installation et le régler à un courant de 120 mA pendant 120 min. Commencez à exécuter le transfert dans une chambre froide.
    7. Placez la membrane dans une petite boîte en plastique une fois le transfert terminé. Bloquez la membrane à l’aide de 10 mL de solution BSA à 5 % fabriquée en 1x PBST20 pour réduire la liaison non spécifique pendant 1 h à température ambiante sur la bascule.
    8. Retirer la solution bloquante, ajouter 5 à 10 ml d’anticorps primaire, qui est un anticorps anti-Ag85B de souris (dilutions de 1:5 000 dans une solution de BSA à 5 %), et incuber à 4 °C pendant la nuit dans un fauteuil à bascule. Stockez l’anticorps à -20 °C et réutilisez-le jusqu’à 3 fois.
    9. Retirer l’anticorps primaire, ajouter 5 à 10 ml de 1 PBST20 et laver la membrane pendant 8 minutes à température ambiante en agitant vigoureusement. Retirez le premier lavage, ajoutez à nouveau 5 à 10 ml de 1 PBST20 et lavez. Répétez cette opération 2 fois.
    10. Ajouter 5 à 10 ml de 1 x PBST20 contenant un anticorps secondaire, qui est un anticorps conjugué contre la peroxydase redox du cheval (HRP) de souris (dilution de 1:10 000), et incuber pendant 2 h à température ambiante sur un transat à bascule.
    11. Lavez la membrane après l’anticorps secondaire en suivant l’étape 3.2.9. Ajoutez une quantité égale de substrat HRP et d’activateur pour développer la membrane sous un chimiluminomètre (Figure 1C).
      REMARQUE : Pour confirmer l’absence de contamination par les protéines cytosoliques, nous avons sondé le Western blot avec un anticorps anti-PknB (figure 1C). L’anticorps a été élevé à l’Institut national d’immunologie, une animalerie, contre le domaine extracytoplasmique purifié de PknB. On peut observer la bande PknB dans la WCL, pas dans les filtrats de culture, et PknB est uniquement cytosolique et membranaire et ne devrait pas être présent dans le filtrat de culture.

4. Préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse

  1. Effectuer la digestion des protéines en solution par la trypsine.
    1. Prenez 100 μg de protéine de filtrat de culture, ajoutez 6 fois plus d’acétone glacée et maintenez-la à -20 °C pendant la nuit.
      REMARQUE : Utilisez de la verrerie pour préparer tous les réactifs pour l’échantillon de spectrométrie de masse. Utilisez des microtubes à centrifuger à faible teneur en protéines et des embouts de liaison à faible teneur en protéines. N’utilisez pas de matière plastique pour éviter la contamination par les polymères lors de l’analyse par spectrométrie de masse.
    2. Précipiter les protéines par centrifugation à 18 000 x g à 4 °C pendant 30 min. Jetez le surnageant.
    3. Lavez la pastille avec 500 μL d’acétone, descendez la pastille à 18 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Jetez le surnageant. Éliminez l’acétone résiduelle à l’aide d’un concentrateur sous vide.
    4. Ajouter 20 μL d’urée 8 M dissoute dans 25 mM de bicarbonate d’ammonium (2 M de base préparée dans de l’eau de qualité MS). Vortex les échantillons et incuber pendant 30 min à température ambiante.
    5. Ad 60 μL de bicarbonate d’ammonium 25 mM pour diluer 8 M d’urée dans 2 M. Incuber à température ambiante pendant 1 h. Ajouter 4 μL de PTCE (concentration finale de 10 mM obtenue dans du bicarbonate d’ammonium de 25 mM) et incuber à température ambiante pendant 30 min, en agitant à 1 800 x g.
    6. Ajouter 4 μL d’IAA (concentration finale de 25 mM obtenue dans du bicarbonate d’ammonium de 25 mM) et incuber à température ambiante pendant 30 min, en agitant à 1 800 x g dans l’obscurité. Ajouter 110 μL de bicarbonate d’ammonium de 25 mM.
    7. Ajouter la trypsine (1:20 ; Trypsine : protéine en μg) à la solution et la maintenir à 37 °C, en agitant à 300 tr/min, pour une digestion pendant la nuit (Figure 2). Arrêtez la réaction de digestion en ajoutant 10 % de TFA (acide trifluoroacétique). Vitesse : aspirez complètement les échantillons pour les faire sécher.
  2. Dessalage de l’échantillon
    1. Ajouter 100 μL de 5 % d’ACN + 0,1 % d’AFT aux peptides digérés. Vortex pendant 30 min à 1 500 tr/min à température ambiante.
    2. Centrifugeuse à 18 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Prenez le surnageant (peptide) sans toucher la pastille dans des tubes de microcentrifugation frais et procédez au dessalage. Préparez toutes les solutions de lavage et d’élution avant l’étape de dessalage.
    3. Équilibrez l’extrémité de la colonne C-18 avec 100 μL de 100 % d’ACN + 0,1 % d’AFT en pipetant la solution et en répétant le processus 5 fois.
    4. Ajouter 100 μL de 50 % d’ACN + 0,1 % d’AGT et répéter l’opération 5 fois. Ajouter 100 μL de 5 % d’ACN + 0,1 % d’AGF et répéter l’opération 5 fois.
    5. Permettez à la liaison peptidique de se produire dans l’extrémité de la colonne C-18 en pipetant 30x. Maintenir la solution à -20 °C jusqu’à ce que l’échantillon soit traité pour la spectrométrie de masse. Maintenant, le peptide est lié à la colonne C-18.
    6. Laver la colonne C-18 avec 100 μL d’eau de qualité MS + 0,1 % d’AGF par pipetage et répéter le processus 5 fois.
    7. Laver la colonne C-18 avec 100 μL de 5 % d’ACN + 0,1 % d’AFE par pipetage et répéter le processus 5 fois. Éluer les peptides de la colonne C-18 dans 100 μL de 50 % d’ACN + 0,1 % d’AFT par pipetage 30x (figure 2).
      REMARQUE : Après l’élution, l’embout de la colonne C-18 peut être stocké à 4 °C jusqu’à ce que la spectrométrie de masse soit terminée.
    8. Accélérez l’aspiration complète du peptide élué et stockez-le à -20 °C jusqu’à ce que l’échantillon soit fourni pour la spectrométrie de masse.
  3. Injection des échantillons peptidiques dans une spectrométrie de masse.
    1. Ajouter 20 μL de solution A (fournie par l’installation de spectrométrie de masse) aux échantillons de peptides séchés. Vortex les échantillons pendant 30 min et centrifuger pendant 90 min à 4 °C.
    2. Injectez 20 μL de l’échantillon dans la machine de spectrométrie de masse pour un gradient de 90 minutes.

5. Analyse des données pour les protéines sécrétées présentes dans le filtrat de culture

  1. Identification des protéines
    1. Analysez des échantillons de protéomique à l’aide du spectromètre de masse quadripolaire. Interrogez les spectres obtenus dans la base de données Mtb H37Rv UniprotKB.
    2. Réglez les tolérances de masse des précurseurs et des fragments à 10 ppm et 0,5 Da. Réglez l’enzyme sur la trypsine avec une valeur maximale de clivage manqué de deux.
    3. Utilisez le logiciel de protéome avec Sequest comme algorithme de recherche avec la carbamidométhylation de la cystéine comme modification fixe.
    4. Identifiez toutes les correspondances peptide-spectre (PSM) avec un taux de fausses découvertes de 1 %. Appliquez les paramètres par défaut pour tous les autres paramètres.
    5. Cartographiez les fichiers bruts de spectrométrie de masse de la séquence peptidique avec l’ID UniProt des protéines Mtb respectives. Répertoriez toutes les protéines Mtb, leurs identifiants Uniprot et leur classification fonctionnelle à l’aide de la base de données Mycobrowser.
    6. Pour une analyse plus approfondie, associez les identifiants UniProt des protéines identifiées à leur numéro Rv respectif. Déposer les données de sécrétome de spectrométrie de masse au Consortium ProteomeXchange par l’intermédiaire du partenaire PRIDE.

6. Traiter H37Rv avec la protéine de filtrat de culture pour vérifier le changement de signalisation de l’hôte

  1. Isolement des macrophages péritonéaux chez la souris.
    REMARQUE : Suivez la référence21 pour l’isolement des macrophages péritonéaux, l’ensemencement des cellules et l’infection.
    1. Injecter à des souris Balb/c (âgées de 4 à 6 semaines) 1 mL de thioglycolate à 4 % et isoler les macrophages péritonéaux du péritoine de souris le 4e jour de l’infection21 (figure 3).
    2. Collectez les cellules macrophages en injectant 1x PBS dans le péritoine de la souris. Centrifugez les cellules à 1 800 x g pendant 5 min, jetez le surnageant et ajoutez 5 ml de milieu 1640-RPMI complété par 10 % de FBS (sérum de veau fœtal ; milieu complet) et 1x pen-streptocoque (antibiotiques).
    3. Ensemencez 3 x 105 cellules par puits dans des plaques de 24 puits et incubez les plaques dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit. Le lendemain, changez le milieu en milieu frais et complet, et les cellules seront prêtes pour l’infection ou le traitement avec des protéines de filtrat de culture.
  2. Traitement des macrophages péritonéaux avec des protéines de filtrat de culture
    1. Amenez les cellules macrophages à BSL-3 et conservez-les dans l’incubateur. Traiter les cellules avec des protéines de filtrat de culture de 1 mg/mL (Figure 3). Récoltez les cellules à différents moments de 4 h, 24 h et 48 h de traitement du filtrat post-culture.
      1. Ensemencez les cellules macrophages isolées dans des plaques de 24 puits en trois exemplaires à chaque point temporel. Traiter les cellules avec 1 mg/mL de protéines de filtrat de culture et incuber à 37 °C dans un incubateur en présence de CO2. Récoltez les cellules à trois moments, 4 h, 24 h et 48 h après le traitement.
      2. Traitez les cellules avec i) un tampon à 2 lamelles pour fabriquer les lysats de cellules macrophages et vérifiez la présence de différents marqueurs de cellules hôtes en effectuant un western blot, et ii) différents tampons pour les tests immunologiques fournis par les fabricants avec les kits.
    2. Préparez les lysats cellulaires de l’hôte et vérifiez les différents marqueurs, le profilage des cytokines des cellules hôtes et l’expression de diverses protéines de la voie de signalisation sur des cellules macrophages traitées par filtrat de culture.
      REMARQUE : Si un laboratoire possède un mutant de remplacement génique de la protéine de la voie sécrétoire, les filtrats de culture préparés à partir de Mtb H37Rv et du mutant Mtb peuvent être utilisés pour évaluer leur impact sur les paramètres immunomodulateurs de l’hôte.

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Résultats

Dans ce protocole, nous avons démontré l’isolement de protéines de filtrat de culture à partir de mycobactéries (Figure 1A). Les protéines du filtrat de culture ont ensuite été vérifiées pour les différents marqueurs afin de confirmer l’isolement du filtrat de culture. Comme mentionné dans le protocole, une coloration de Coomassie a été effectuée pour vérifier la charge en protéines. On peut observer une bande protéique striée dans la fraction WCL (sur la dernière voie

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Discussion

L’un des domaines de recherche critiques concerne la compréhension de la pathogenèse de Mtb et la mise au point de diagnostics et de vaccins efficaces22,23. L’isolement des protéines de filtrat de culture à partir de milieux de culture Mtb est un processus qui permet d’identifier les facteurs de virulence sécrétés par l’agent pathogène. L’étude du rôle des protéines sécrétoires dans la modulation de la pathogenè...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,2 et micro ; m Filtres à seringuemdiSYPL0601MNXX204
0.2µ ; m Membrane nitrocellulosiqueAmersham10600001
37 % HClMerckH1758
AcétoneEMPLURA MERCKSL9F690866
AcétonytrileSigma-Aldrich34851-2L
AcrylamideBIORAD1610107
AlbumineBio Basic CanadaN° cat : AD0023
Amicon Ultra-15Merck, MilliporeUFC900396
Biocarbonate d’ammoniumSigma-Aldrich09830-500G
Persulpahte d’ammoniumSigma-AldrichA3678-100G
anti-Ag85BAbcamAB43019
anti-souris HRP anticorps secondaire conjuguéThermo Fischer62-6520
AsparagineSigma-AldrichA0884-500G
bis-acrylamideSIGMA146072-500G
BSAMerckMB083-500G
C-18 colonneThermo FischerSEM SS18V
Catalase  ;Sigma-AldrichC1345
Acide citriqueSigma-AldrichC0759-500G
DextroseSigma-AldrichG7021-1KG
Difco Middle brook 7H9 bouillon  ;   ;Fisher Scientific271310
Citrate d’ammonium ferrique(III)Sigma-AldrichF5879-100G
Acide formique 98-100 %MerckZ0823704246
Acide acétique glacial 100 %MerckCD0C700160
GlycineSigma-AldrichG8898-1KG
GlycineSIGMAG8898-1KG
GycerolSigma-AldrichG5516
Immobilion Western Chemiluminescent HRP substratMerckWBKLS0500
IodoacétamideAmershamRPN6302V
Magnesium sulpahteSigma-AldrichM7506-500G
Mycobroswer
Acide oléiqueSigmaCat No : O1008
Pierce BCA protein assay kitThermo Fischer23225
Pierce Trypsin ProtaseThermo Fischer90058
Proteome Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (expériences de protéomique - séquençage peptidique, identification et quantification des protéines)Thermo Fischer Scientific
Chlorure de sodiumSigmaN° de cat : S3014
Chlorurede sodium Sigma-AldrichS7773-1KG
Dodécylsulfatede sodium Sigma-AldrichL3771-1KG
TCEPSigma-AldrichC4706-25
TemedSigma-AldrichT9281-100ML
Tris BaseBioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
Tween 80Sigma-AldrichP1754
de données protéique UniProt
UreaMP Bio194857
Base

Références

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