Nous décrivons un protocole simple pour l’élimination du statocyste et des tissus associés chez le cténophore Mnemiopsis leidyi, qui se prête à l’imagerie en direct.
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Article de méthode
Ablation chirurgicale d’un organe sensoriel complexe chez des cténophores hautement régénératifs
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cténophore Mnemiopsis leidyi est un modèle animal classique de régénération du corps entier. L’augmentation de la traçabilité de nombreuses techniques de laboratoire et leur positionnement phylogénétique en tant que groupe frère probable des métazoaires restants ont conduit à un récent regain d’intérêt scientifique pour le travail avec les cténophores. Ils peuvent régénérer n’importe quel organe ou type de cellule manquant, y compris la régénération complète du corps entier à partir d’un fragment aussi petit que ~15 % du corps, en quelques jours. Comme la plupart des cténophores, M. leidyi a un organe de détection de la gravité situé à l’endroit de l’abdomen qui relie l’entrée sensorielle à la sortie motrice pour contrôler la position et l’orientation de son corps. Ce protocole démontre l’ablation chirurgicale du complexe de l’organe aboral (AO) et des structures associées chez M. leidyi , ainsi que des méthodes de culture, de manipulation et de montage appropriées pour imager les processus de cicatrisation et de régénération des plaies qui se déroulent dans les heures ou les jours suivants. Ces techniques simples sont largement adaptables à différents paradigmes expérimentaux et contextes de laboratoire.
Introduction
Les cténophores, également connus sous le nom de méduses en peigne, sont cosmopolites aux environnements marins de la Terre et peuvent être des acteurs majeurs des écosystèmes, en particulier dans le cadre du réseau trophique. Le cténophore Mnemiopsis leidyi est un modèle animal historié et de plus en plus populaire de régénération du corps entier 1,2. Leur capacité à régénérer tout organe ou type de cellule manquant apparaît vers la fin de l’embryogenèse et persiste tout au long de leur vie postembryonnaire 3,4 (~0,1 à >1 000 mm de taille corporelle). Ils sont également transparents tout au long de leur vie et se prêtent à diverses techniques d’imagerie en direct et fixes. L’ancêtre commun le plus récent de tous les cténophores avait de nombreux types de cellules et d’organes complexes ; la plupart des cténophores existants possèdent la plupart de ces éléments au cours d’au moins un stade de leur vie : un organe aboral sensible à la gravité (historiquement appelé organe apical et ici appelé organe aboral, AO), des structures locomotrices spécialisées composées de macrocils hautement organisés qui battent de manière coordonnée (rangées de peignes), des tentacules d’alimentation rétractables et des photocytes qui bioluminescent en réponse à des stimuli nocifs (Figure 1).
Malgré leurs nombreux types de cellules et leurs comportements complexes dépendants du contexte, un solide ensemble de données génomiques soutient le placement des cténophores comme le groupe frère probable de tous les autres animaux vivants 5,6,7,8. Des différences majeures dans la base cellulaire et fonctionnelle du système nerveux cténophore par rapport à d’autres animaux possédant un système nerveux (bilatériens et cnidaires) ont suggéré l’hypothèse que le système nerveux cténophore représente une origine indépendante ; Cependant, cela reste incertain 9,10,11,12.
Le complexe d’organes sensoriels aboraux comprend le statocyste, qui comprend de nombreux types de cellules, y compris plusieurs types de cellules neurosensorielles présumées 13,14,15,16,17,18, et fait l’objet d’un entretien constant dans des cténophores non manipulés. Les cellules mécanosensorielles portent de grands faisceaux ciliaires, qui sont déviés par un statolithe composé de cellules biominéralisées (appelées lithocytes) pour détecter la gravité. Deux « champs polaires », qui contiennent des structures sensorielles présumées de fonction inconnue14 et des cellules photosensorielles probables16, sont adjacents au statocyste.
L’étude expérimentale de la capacité de régénération de M. leidyi s’est étendue aux plus petits animaux lors de la transition entre l’embryon et l’éclosion (~100 μm) et les adultes macroscopiques libres (>2 cm). M. leidyi de ~1 mm de diamètre corporel sont assez grands pour permettre une manipulation chirurgicale manuelle sans instruments spéciaux tels que des micromanipulateurs, mais sont suffisamment petits pour être montés sur une lame de microscope standard pour l’imagerie avec des objectifs de grande puissance. Ce protocole démontre l’ablation chirurgicale de l’organe sensoriel aboral et des structures associées, ainsi que des méthodes de culture et d’imagerie appropriées pour documenter les processus de cicatrisation et de régénération des plaies qui se produisent dans les heures ou les jours qui suivent.
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Protocole
1. Préparez les outils et les fournitures
- À l’aide d’un bec Bunsen standard, tirez à la main des aiguilles de dissection en verre à partir de micropipettes capillaires en verre. Pour les animaux de plus de 1 mm, utilisez des micropipettes en verre sodocalcique calibrées destinées à la manipulation de liquides.
REMARQUE : La taille de 100 μl fonctionne bien sur la plage focale de 0,5 à 3 mm.- Établissez un cône de flamme bleu vif dans le bec Bunsen.
- Maintenez la pointe centrale de la pipette en verre dans la flamme jusqu’à ce qu’elle soit suffisamment ramollie pour se déplacer sous une légère pression.
- Retirez la pipette de la flamme et écartez immédiatement les deux côtés pour créer une aiguille courte et solide.
REMARQUE : La crosse d’aiguille en verre peut être refondue si un résultat satisfaisant n’a pas été obtenu lors de la première tentative, et les aiguilles cassées peuvent être sauvées et retirées à nouveau. Voir la figure 2 pour des exemples d’aiguilles utilisables et inutilisables tirées par cette méthode.
ALTERNATIVE : Les aiguilles de 26 G 1/2 pouce fonctionnent également bien, en particulier à l’extrémité la plus grande de la plage de taille focale.
- Préparez de l’eau de mer stérile en faisant passer de l’eau de mer naturelle ou artificielle à travers un filtre de 0,22 μm.
- Créez des pipettes doseuses.
- À l’aide de ciseaux tranchants ou d’une lame de rasoir, coupez une pipette de transfert en plastique pour produire une ouverture avec le diamètre intérieur de la taille souhaitée. Gardez à portée de main au moins une pipette pour le haut de la plage souhaitée et une pour le bas de la plage souhaitée. Voir la figure 3 pour un exemple de jeu de pipettes de mesure.
REMARQUE : Ces pipettes fonctionnent bien jusqu’à ~8 mm. Il est également possible d’estimer la taille à l’aide d’un micromètre ou d’outils de mesure à partir de photographies.
- À l’aide de ciseaux tranchants ou d’une lame de rasoir, coupez une pipette de transfert en plastique pour produire une ouverture avec le diamètre intérieur de la taille souhaitée. Gardez à portée de main au moins une pipette pour le haut de la plage souhaitée et une pour le bas de la plage souhaitée. Voir la figure 3 pour un exemple de jeu de pipettes de mesure.
2. Préparez les animaux pour l’expérience
- Sélectionnez des individus morphologiquement normaux de la taille et du stade souhaités.
REMARQUE : Nous trouvons que les animaux de ~0,5 à 3 mm de diamètre sont optimaux pour le montage sur des glissières. Vérifiez que les animaux ne rentrent pas dans la pipette de taille de bas de gamme mais qu’ils s’adaptent confortablement dans la pipette de taille de haut de gamme. - Affamer les animaux de laboratoire pendant 8 à 16 h.
REMARQUE : Bien que M. leidyi soit optiquement transparent et pas très autofluorescent, les aliments circulant dans leur système digestif sont généralement opaques et souvent autofluorescents.
3. Effectuez des coupes
- À l’aide d’une pipette de transfert, plus large que la taille du corps de l’animal de laboratoire, transférez-la dans une boîte en polystyrène de 35 mm contenant de l’eau de mer stérile.
- Visualisez l’échantillon à l’aide du microscope de dissection. Roulez un animal sur son côté adésophagien (figure 1). Cette vue donne l’accès le plus facile pour enlever l’organe aboral. Concentrez-vous sur l’organe aboral.
REMARQUE : Le grossissement le plus utile peut varier en fonction de la taille de l’animal et des préférences de l’utilisateur. Généralement, un grossissement de 12-20x fonctionne bien. - Maintenez doucement l’animal en place avec une aiguille de verre en utilisant la main non dominante.
- À l’aide de la main dominante, insérez la pointe d’une aiguille légèrement en dessous de l’organe aboral. Entrez obliquement pour faire une incision à partir d’un bord visible de l’organe aboral jusqu’en dessous de sa base. Retirez l’aiguille et faites une deuxième incision pour retirer un morceau de tissu en forme de coin contenant toutes les structures de l’organe aboral (voir la figure 4, panneau supérieur). Examinez attentivement l’animal et les tissus excisés pour vous assurer que l’opération a réussi.
- Utilisez la même pipette de transfert pour déplacer l’animal fraîchement coupé dans un plat frais contenant de l’eau de mer stérile.
REMARQUE : La plaie se refermera rapidement, donc en fonction des objectifs expérimentaux (par exemple pour plusieurs échantillons régénérant de manière synchrone ou pour imager les premiers stades de la cicatrisation et de la régénération), il faut agir rapidement pour générer plusieurs échantillons. Utilisez une minuterie pour limiter le temps chirurgical afin de rapprocher les cohortes d’animaux en régénération.
4. Vérifiez que les coupes sont correctes
REMARQUE : Même en vérifiant soigneusement sous le microscope de dissection, il est parfois possible de manquer des erreurs chirurgicales.
- Suivez les étapes de montage ci-dessous pour monter temporairement chaque individu postchirurgical sur une lame de verre afin de vérifier sous un microscope composé avec CID que toutes les structures prévues ont été correctement retirées. Effectuez cette vérification même si vous n’effectuez pas d’autres images à ce stade.
REMARQUE : Les excellentes capacités de guérison des cténophores les prêtent bien aux expériences de greffe ; nous retirons toujours les organes aboraux excisés du récipient de culture pour éviter la possibilité que les côtés coupés d’un AO retiré et le reste de l’animal dont il a été retiré puissent se coller et fusionner.
Si vous ne passez pas directement à l’imagerie à long terme, ne scellez pas la lame. Cela facilitera le rétablissement rapide et le retour à la culture de cet animal de laboratoire. Il est recommandé de vérifier la précision chirurgicale sous un fort grossissement. En particulier, le statolithe peut être éliminé du dôme sans avoir terminé l’opération.
5. Imagerie en direct
- Montage
- Traitez une lame de microscope en verre standard avec un agent silanisant, tel qu’un hydrofuge pour le traitement du verre, et laissez sécher complètement.
- Transférez un animal post-chirurgical sur une lame préparée à l’aide d’une pipette de transfert. Vérifiez que l’eau perle avec l’animal à l’intérieur.
- Placez une petite quantité de pâte à modeler (~1,5 mg) sur chaque coin d’un couvre-objet pour former des « pieds » qui serviront d’espaceur pour soulever le couvre-objet loin de l’animal.
- Placez délicatement le verre de protection, en terre cuite, sur l’animal. En tenant chaque coin de la vitre, faites rouler l’animal en position pour l’imagerie. Appuyez pour comprimer légèrement l’animal en le maintenant en place. Repositionnez l’échantillon autant que nécessaire pour obtenir une vue satisfaisante.
- Pour une imagerie de plus de ~30 min, appliquez une fine couche de vaseline sur chaque bord du verre de protection pour éviter le dessèchement de l’échantillon.
REMARQUE : M. leidyi monté de cette manière peut être facilement récupéré pour une culture ultérieure ou d’autres essais. Cependant, les animaux se libèrent généralement et se repositionnent en 1 à 2 heures, de sorte qu’une capture en accéléré continue de plus de 2 heures nécessiterait une approche d’imagerie différente.
6. Culture
- Conditions d’élevage des cydippidés
- Culture d’animaux manipulés chirurgicalement et de témoins dans de l’eau de mer naturelle ou artificielle filtrée près de la température ambiante. Utilisez un incubateur réglé à 20-22 °C pour garantir des résultats constants.
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Résultats
M. leidyi au stade cydippide se referme généralement complètement dans les ~20 minutes suivant la blessure (Figure 4 et Figure 5), tandis que la régénération complète de l’organe peut prendre 1 à 3 jours. Ce moment présente une certaine variabilité biologique, mais il est presque invariablement terminé 72 heures après la chirurgie (figure 6).
L’ablation chirurgicale des cellules et de la mésoglée...
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Discussion
Des expériences similaires pourraient être réalisées sur n’importe quelle taille de M. leidyi souhaitée ; La morphogenèse de l’organe s’achève en même temps que l’apparition de la capacité de régénération4. Les animaux peuvent être prélevés dans la nature19 ou en laboratoire20,21. Si une taille corporelle particulière est souhaitée, les animaux peuvent être autorisés à fray...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Jovita Joseph.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,2 &mu ; Filtre à seringue m SFCA | Thermo/Nalgene | 723-2520 | créer de l’eau de mer stérile |
| Boîte de Pétri en polystyrène de 35 mm | Faucon/Corning | 351008 | effectuer des coupes ; Culture Petits animaux |
| Seringue Luer-lock jetable de 60 mL | BH Fournitures | BH60LL | créer de l’eau de mer stérile |
| Pipettes en verre calibrées, 100 &mu ; L | Drummond | 2-000-100 | Effectuer des coupes |
| Lunettes de protection, #1.5, carré de 18 mm | VWR | 16004-326 | Monture pour l’imagerie |
| cténophores | Spécimens du Golfe | animaux vivants | |
| Glissières de dépression en verre à double cavité, 1,3 mm | VWR | 470200-930 | Monture pour l’imagerie |
| lames de microscope en verre | VWR | 16004-398 | Monture pour l’imagerie |
| Sel de mer de mer instantané | Océan instantané | milieu de culture animale | |
| Mini règle | Ted Pella | 13623 | mesurer les pipettes en plastique |
| Pâte à modeler (pâte à modeler) | Pepy Plastilina | Monture pour l’imagerie | |
| Gelée de pétroelum | Vaseline | Monture pour l’imagerie | |
| Pipettes de transfert en plastique (tailles assorties) | Cole-Parmer | 06226-13, 06226-12, 06226-01 | déplacer les petits animaux |
| Traitement du verre Rain-X | Pluie-X | Lames de microscope silanize | |
| règle | Westcott | 10564 | mesurer les pipettes en plastique |
| ciseaux | OXO | Pipettes en plastique coupées |
Références
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Réimpressions et autorisations
